不同基原八爪金龍藥材中黃酮、香豆素類化學(xué)成分分析

李曉 石慧 丁晶鑫 俸婷婷 劉雄偉 劉暢 周英

摘 要 目的：鑒定并分析不同基原八爪金龍藥材中黃酮及香豆素類成分。方法：采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC-QE-HF-MS/MS）。色譜柱為Zorbax Eclipse-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），柱溫為30 ℃，流速為0.3 mL/min，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。離子源為電噴霧離子源，掃描模式為正、負(fù)離子模式，加熱器溫度為325 ℃，鞘氣壓力為45 arb，輔助氣壓力為15 arb，吹掃氣壓力為1 arb，電噴霧電壓為3.5 kV，毛細(xì)管溫度為330 ℃，透鏡電壓為55%，掃描模式為一級(jí)全掃描（m/z 100～1 500）、數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描（dd-MS2，Top N=10），分辨率為70 000（一級(jí)質(zhì)譜）、17 500（二級(jí)質(zhì)譜），碰撞模式為高能量碰撞解離。通過參考ChemSpider、mzCloud、mzVault、PubChem等國內(nèi)外專業(yè)數(shù)據(jù)庫，同時(shí)結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和對(duì)照品數(shù)據(jù)對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定并比較含量。結(jié)果與結(jié)論：從朱砂根、百兩金、紅涼傘等3種不同基原的八爪金龍藥材中共分離47個(gè)成分，鑒定出17個(gè)黃酮類化合物，包括9個(gè)黃酮醇類（槲皮素3-O-鼠李糖苷7-O-葡糖苷、楊梅素、蘆丁、毛里求斯排草素、山柰酚、槲皮素、異鼠李素、槲皮苷、美恩西?。?、3個(gè)黃烷-3-醇類（表?xiàng)攦翰杷?、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯）、2個(gè)二氫黃酮類（黃顏木素、圣草酚）及3個(gè)其他類{3-（2，3-二氫苯并[1，4]二噁英-6-基）-7-羥基-2-三氟甲基-4-酮、墨沙酮、Oriciacridone F}，10個(gè)香豆素類化合物{巖白菜素、[（7-羥基-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-6-基）氧基]乙酸、[7-（羧基甲氧基）-4-甲基-2-氧-2-羥色基-3-基]乙酸、4，9-二羥基7H-呋喃并[3，2-g]色烯-7-酮、6，7-二羥基-4-甲基香豆素、七葉內(nèi)酯、秦皮素、7，8-二羥基-4-甲基香豆素、4-甲基傘形酮葡萄糖醛酸、二十烷酮}。含量分析結(jié)果顯示，黃酮、香豆素類化合物中，3種不同基原八爪金龍藥材中共有5個(gè)共有成分，分別為巖白菜素（2號(hào)峰）、[7-（羧基甲氧基）-4-甲基-2-氧-2-羥色基-3-基]乙酸（5號(hào)峰）、墨沙酮（16號(hào)峰）、槲皮素（18號(hào)峰）、Oriciacridone F（26號(hào)峰），且共有成分的含量存在明顯差異。除5個(gè)共有成分外，其余22個(gè)成分均為差異化學(xué)成分，分別為1、3、4、6～15、17、19～25、27號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物，其中3、6、8、23號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物僅存在于紅涼傘中;12～15、19號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物僅存在于百兩金中。UPLC-QE-HF-MS/MS法可高效、精確、快速地鑒別不同基原八爪金龍藥材中黃酮類、香豆素類化學(xué)成分。

關(guān)鍵詞 八爪金龍;超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法;黃酮類成分;香豆素類成分;結(jié)構(gòu)鑒定;含量

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To identify and analyze the flavonoids and coumarins in Radix Ardisiae from different sources. METHODS： UPLC-QE-HF-MS/MS was adopted. The determination was performed on Zorbax Eclipse-C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.3 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the temperature of injector was 4 ℃. The sample size was 2 ?L; ESI source was applied in negative and positive scanning ion mode， the heater temperature was 325 ℃， the sheath gas pressure was 45 arb， the auxiliary gas pressure was 15 arb， the purge gas pressure was 1 arb， the electrospray voltage was 3.5 kV， the capillary temperature was 330 ℃， S-lens RF level was 55%， scan mode was first-order full scan m/z 100-1 500， data-dependent secondary mass spectrometry scanning （dd-MS2， Top N=10），the resolution was 70 000 （first mass spectrometry） ， 17 500 （secondary mass spectrometry）， the collision mode was high-energy collision dissociation. Through retrieving foreign and domestic databases as ChemSpider， mzCloud， mzVault， PubChem， the structure of the compound was identified on the basis of related literatures and reference data， and the contents were compared. RESULTS & CONCLUSIONS： A total of 47 components were separated from Radix Ardisiae of 3 kinds of sources as Ardisia crenata Sims， A. crispa （Thunb.）A. DC.， A. crenata Sims var. bicolor （Walk）C. Y. Wu et C. Chen. A total of 17 flavonoids were identified， including 9 flavonols （quercetin 3-O-rhamnoside-7-O-glucoside， myricetin， rutin， mauritanin， kaempferol， quercetin， isorhamnetin， quercetin， mearnsitrin）， 3 flavan-3-ols [（-）-epigallocatechin， catechin， epigallocatechin gallate） 2 dihydroflavonoids [fustin， eriodictyol] and 3 other types [3-（2，3-dihydro-benzo[1，4]dioxin-6-yl）-7-hydroxy-2-trifluoromethyl-chromen-4-one， methadone， oriciacridone F]， 10 coumarins {bergenin， [（7-hydroxy-4-methyl-2-oxo-2H-chromen-6-yl）oxy]acetic acid， [7-（carboxymethoxy）- 4-methyl-2-oxo-2hydroxychromo-3-yl]acetic acid， 4，9-dihydroxy-7H-furo[3，2-g]chromen-7-one， 6，7-dihydroxy-4-methylcoumarin， esculetin， fraxetin， 7，8-dihydroxy-4-methylcoumarin， 4-methylumbelliferyl glucuronide， scoparone}. Results of content analysis showed that in flavonoids and coumarins， there were 5 common components in Radix Ardisiae from 3 kinds of sources， i.e. bergenin （peak 2）， [7-（carboxymethoxy）-4-methyl-2-oxo-2-hydroxychromo-3-yl] acetic acid （peak 5）， methadone （peak 16）， quercetin （peak 18）， oriciacridone F （peak 26）; the contents of common components were significantly different. In addition to 5 common components， there were 22 different chemical components， which were compounds corresponding to peaks 1， 3， 4， 6-15， 17， 19-25 and 27， respectively. Among them， compounds corresponding to peaks 3， 6， 8 and 23 were only found in A. crenata Sims var. bicolor （Walk）C. Y. Wu et C. Chen; compounds corresponding to peaks 12-15， 19 were only found in A. crispa （Thunb.） A. DC. UPLC-QE-HF-MS/MS method can efficiently， accurately and quickly identify the flavonoids and coumarins in Radix Ardisiae from different sources.

KEYWORDS? ?Radix Ardisiae; UPLC-QE-HF-MS/MS; Flavonoids; Coumarins; Structure identification; Content

八爪金龍為紫金牛科植物朱砂根Ardisia crenata Sims、百兩金Ardisia crispa（Thunb.）A. DC.和紅涼傘Ardisia crenata Sims var. bicolor（Walk）C. Y. Wu et C. Chen的根及根莖，為貴州省特色民族藥材，也是苗族常用藥材，現(xiàn)收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[1]。其性涼，味苦、辛，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀止痛、祛風(fēng)除濕的功效，臨床用于治療急性咽炎、扁桃體炎等癥，療效顯著[2-3]。目前，關(guān)于八爪金龍的研究大多集中在含量測(cè)定、藥理作用等方面[4-6]。有研究表明，八爪金龍的主要化學(xué)成分為香豆素類、黃酮類和三萜皂苷類化合物，其中香豆素類成分巖白菜素的含量最高，且具有止咳、抗炎、鎮(zhèn)痛等活性，是公認(rèn)的質(zhì)量控制指標(biāo)性成分和活性物質(zhì)[7]。黃酮類成分也具有多種生物活性，如楊梅素具有抗病毒、抑菌抗炎等活性[8]，槲皮素、蘆丁等具有抗炎和抗腫瘤等活性[9]。因此，鑒定八爪金龍中的香豆素類、黃酮類成分對(duì)其質(zhì)量控制、資源開發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要價(jià)值。

近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）已被廣泛應(yīng)用于中藥現(xiàn)代化研究，該技術(shù)同時(shí)具備液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度和選擇性，實(shí)現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)[10]。電噴霧電離法（ESI）是目前最常用的離子化技術(shù)之一，離子化效率高，且多與離子阱質(zhì)譜儀和三重四極桿質(zhì)量分析器聯(lián)用，可快速交替正負(fù)離子掃描模式，并具有支持復(fù)雜分析方法、節(jié)約分析時(shí)間等優(yōu)勢(shì)[11]。基于此，本研究采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法（UPLC-QE-HF-MS/MS）對(duì)不同基原八爪金龍藥材中的黃酮類和香豆素類成分進(jìn)行分離、鑒定，并總結(jié)裂解規(guī)律，旨在區(qū)分不同基原的八爪金龍藥材，以保證研究的可持續(xù)性和藥效的穩(wěn)定性，同時(shí)也為進(jìn)一步闡明八爪金龍藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其深入開發(fā)、臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Thermo Vanquish型UPLC系統(tǒng)（配有在線脫氣機(jī)、二元高壓泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱）、Thermo Q-ExactiveTM HF組合型四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)[配有ESI、Tune 2.9工作軟件、Trace Finder 4.1數(shù)據(jù)處理軟件、Thermo Sientific Xcalibur 4.1.31.9編輯方法軟件、Compound Discoverer 3.1定性分析軟件、Thermo Mzcloud在線數(shù)據(jù)庫、Thermo Mzvalut本地?cái)?shù)據(jù)庫]均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;XS205型十萬分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;JP2-160型萬分之一電子天平（日本CBC公司）;SB-600DTY型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)所用主要藥品與試劑有：巖白菜素對(duì)照品（成都普思生物科技有限公司，批號(hào)PS1330-0025，純度>98%）;甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純凈水。

實(shí)驗(yàn)用朱砂根藥材（編號(hào)S1，批號(hào)20190817）采集于貴州省黔南布依族苗族自治州長順縣，百兩金藥材（編號(hào)S2，批號(hào)20190819）采集于貴州省貴陽市白云區(qū)，紅涼傘藥材（編號(hào)S3，批號(hào)20190822）采集于貴州省凱里市雷山縣雷公山，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院魏升華教授鑒定分別為紫金牛科植物朱砂根A. crenata Sims、百兩金A. crispa（Thunb.）A. DC.、紅涼傘A. crenata Sims var. bicolor（Walk）C. Y. Wu et C. Chen的根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 以Zorbax Eclipse-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）為色譜柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～2 min，95%B;2～7 min，95%B→70%B;7～14 min，70%B→22%B;14～18 min，22%B→5%B;18～25 min，5%B→95%B），柱溫為30 ℃，流速為0.3 mL/min，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI，掃描模式為正、負(fù)離子模式，加熱器溫度為325 ℃，鞘氣壓力為45 arb，輔助氣壓力為15 arb，吹掃氣壓力為1 arb，電噴霧電壓為3.5 kV，毛細(xì)管溫度為330 ℃，透鏡電壓為55%;掃描模式為一級(jí)全掃描（Full scan，m/z 100～1 500）、數(shù)據(jù)依賴性二級(jí)質(zhì)譜掃描（dd-MS2，Top N=10），分辨率為70 000（一級(jí)質(zhì)譜）、17 500（二級(jí)質(zhì)譜），碰撞模式為高能量碰撞解離。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取朱砂根、百兩金、紅涼傘藥材鮮品，自然晾干，切片，各取250 g，分別加10倍量（mL/g）水煎煮2 h，共2次，趁熱濾過，合并提取液，濃縮，真空干燥，得各藥材提取物。分別取上述各藥材提取物0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率180 W，頻率40 kHz）處理40 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱取巖白菜素對(duì)照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品貯備液。精密量取上述對(duì)照品貯備液500 μL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.3 化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫建立

一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)參考ChemSpider化學(xué)結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（http：//www.chemspider.com/），二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)參考mzCloud（https：//www.mzcloud.org/）、mzVault（https：//www.mzcloud.org/）等未知物鑒定的新型數(shù)據(jù)庫，結(jié)合PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）與國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)[12-20]，構(gòu)建八爪金龍的化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（可能含有的化學(xué)成分及其代謝物），主要包括中英文名稱、分子式、相對(duì)分子量、結(jié)構(gòu)式、分子離子以及合理的碎片離子、理論上精確的同位素質(zhì)量和美國化學(xué)文摘服務(wù)社為化學(xué)物質(zhì)制定的登記號(hào)（CAS）等信息。

2.4 八爪金龍藥材中黃酮類、香豆素類化合物分析

取“2.2.1”項(xiàng)下3種供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，得3種不同基原八爪金龍的總離子流圖（見圖1）。根據(jù)得到的質(zhì)譜信息、精確質(zhì)量、碎片離子和保留時(shí)間，同時(shí)與“2.3”項(xiàng)下所建的化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配。結(jié)果，供試品溶液在正、負(fù)離子模式下均有響應(yīng)值較高的特征性吸收峰。從3種不同基原八爪金龍藥材中共分離47個(gè)成分，鑒定出17個(gè)黃酮類化合物和10個(gè)香豆素類化合物。其中，從朱砂根藥材中分離29個(gè)成分，共鑒定出10個(gè)黃酮類化合物和7個(gè)香豆素類化合物;從百兩金藥材中分離27個(gè)成分，共鑒定出8個(gè)黃酮類化合物和4個(gè)香豆素類化合物;從紅涼傘藥材分離30個(gè)成分，共鑒定出13個(gè)黃酮類化合物和8個(gè)香豆素類化合物，結(jié)果見表1。

2.5 黃酮及其苷類化合物的鑒定及裂解規(guī)律

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，八爪金龍藥材中黃酮類化學(xué)成分含量較高[18]。本研究從朱砂根、百兩金、紅涼傘藥材中共鑒定出17個(gè)黃酮及其苷類化合物，包括9個(gè)黃酮醇類、2個(gè)二氫黃酮類、3個(gè)黃烷-3-醇類及3個(gè)其他類化合物。

2.5.1 黃酮醇及其苷類化合物的裂解規(guī)律 通過對(duì)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+及[M-H]-進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，苷類化合物主要在糖苷鍵處發(fā)生斷裂，形成失去1個(gè)或多個(gè)糖的次級(jí)苷或苷元碎片離子[21]，苷類含有的糖基主要是葡萄糖、鼠李糖、蕓香糖、甘露糖和半乳糖。在正、負(fù)離子模式下，共鑒定出9個(gè)黃酮醇類成分，分別為槲皮素3-O-鼠李糖苷7-O-葡糖苷、楊梅素、蘆丁、毛里求斯排草素、山柰酚、槲皮素、異鼠李素、槲皮苷、美恩西汀[22] 。

在正離子模式下，該類化合物主要產(chǎn)生了丟失相應(yīng)糖基的[M+H-C9H8O3]+、[M+H-C6H10O4]+、[M+H-C6H10O4-C6H10O5]+碎片離子。

以保留時(shí)間為6.282 min的化合物為例，其獲得m/z 611.160[M+H]+的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)脫去1分子鼠李糖的碎片離子m/z 465.102[M+H-C6H10O4]+和脫去1分子蕓香糖的碎片離子m/z 303.050[M+H-C12H20O9]+，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C27H30O16，再結(jié)合文獻(xiàn)[23]，推測(cè)該化合物為蘆丁。

以保留時(shí)間為6.707 min的化合物為例，其獲得m/z 317.065[M+H]+的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z 302.042[M+H-CH3]+、153.018[M+H-C9H8O3]+的碎片離子峰，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C16H12O7，再結(jié)合文獻(xiàn)[24]，推測(cè)該化合物為異鼠李素。

以保留時(shí)間為6.514 min的化合物為例，其獲得m/z 287.055[M+H]+的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z 153.018[C8H8O3]+、137.023[C8H8O2]+、121.029[M+H-CO-C8H10O2]+的碎片離子峰，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C15H10O6，再結(jié)合文獻(xiàn)[25]，推測(cè)該化合物為山柰酚。

以保留時(shí)間為6.513 min的化合物為例，其獲得m/z 741.223[M+H]+的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)依次脫去3分子糖基的碎片離子峰m/z 595.166[M+H-C6H10O4]+、449.108[M+H-C6H10O4-C6H10O4]+、287.055

[M+H-C6H10O4-C6H10O4-C9H8O3]+，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C33H40O19，再結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)[26]，推測(cè)該化合物為毛里求斯排草素。

可見，m/z 465.102、303.050、302.042、153.018、151.003、129.055、85.029等碎片離子是黃酮醇及苷類化合物裂解和糖斷裂的特征離子。黃酮醇類化合物結(jié)構(gòu)見圖2。

2.5.2 黃烷-3-醇類化合物的裂解規(guī)律 在正、負(fù)離子模式下，共鑒定出3個(gè)黃烷-3-醇類成分，分別為表?xiàng)攦翰杷?、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯[27]。

通過對(duì)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+及[M-H]-進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下，以上3個(gè)化合物均得到脫去1分子水[M+H-H2O]+的碎片離子，如289.070[M+H-H2O]+、273.075[M+H-H2O]+，經(jīng)過黃酮逆-狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（RDA）裂解途徑得到碎片離子139.039[M+H-C8H8O4]+（A1+.）。表?xiàng)攦翰杷剌^兒茶素多1個(gè)羥基，表沒食子兒茶素沒食子酸酯在表?xiàng)攦翰杷氐?位羥基處通過酯基連接1個(gè)苯環(huán)，因此表沒食子兒茶素沒食子酸酯在裂解過程中脫去苯環(huán)得到表?xiàng)攦翰杷厮槠x子，之后裂解規(guī)律同兒茶素，C環(huán)不同鍵位斷裂獲得多種A環(huán)碎片離子與B環(huán)碎片離子，或者丟失1分子H2O、1分子CO2獲得碎片離子。可見，m/z 163.039、151.039、139.039等碎片離子是黃烷-3-醇類裂解和基團(tuán)斷裂的特征離子。黃烷-3-醇類化合物的結(jié)構(gòu)式見圖3。

2.5.3 二氫黃酮類化合物的裂解規(guī)律 在正、負(fù)離子模式下，共鑒定出2個(gè)二氫黃酮類成分，分別為黃顏木素、圣草酚[28]。

通過對(duì)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+及[M-H]-進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在正離子模式下，以保留時(shí)間為6.225 min的化合物為例，其獲得m/z 289.070[M+H]+的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z 271.060[M+H-H2O]+和再依次脫去一氧化碳的碎片離子m/z 243.065[M+H-H2O-CO]+、215.070[M+H-H2O-CO-CO]+、187.131[M+H-H2O-CO-CO-CO]+，通過黃酮RDA裂解途徑得到m/z 153.018[C8H8O3]+（B1+.）和m/z 137.079[C7H4O3]+（A1+.）的碎片峰，通過黃酮類裂解途徑Ⅱ得到m/z 139.039[C8H10O2]+

（B2+.）的碎片峰，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C15H12O6，再結(jié)合文獻(xiàn)[29]，推測(cè)該化合物為黃顏木素。

以保留時(shí)間為9.063 min的化合物為例，其獲得m/z 289.070[M+H]+的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z 271.060[M+H-H2O]+、153.018[C8H8O3]+（A1+.）的碎片峰，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C15H12O6，再結(jié)合文獻(xiàn)[30]，推測(cè)該化合物為圣草酚。圣草酚與黃顏木素的相對(duì)分子量相同，區(qū)別在于后者為二氫黃酮醇類，前者羥基連接在A環(huán)5位上。

可見，m/z 271.060、258.073、215.070、153.018、187.131、58.066等碎片離子是二氫黃酮類裂解和基團(tuán)斷裂的特征離子。二氫黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)式見圖4。

2.5.4 其他黃酮類化合物的裂解規(guī)律 在正、負(fù)離子模式下共鑒定出3個(gè)其他黃酮類成分，分別為3-（2，3-二氫苯并[1，4]二噁英-6-基）-7-羥基-2-三氟甲基-4-酮、墨沙酮、Oriciacridone F[31]。其結(jié)構(gòu)式見圖5。

通過對(duì)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+及[M-H]-進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在負(fù)離子模式下，以保留時(shí)間為4.577 min的化合物為例，其獲得m/z 363.049[M-H]-的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z 290.186[M-H-CO-C2H5O]-、177.874[C10H10O3]-的碎片峰，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C18H11F3O5，推測(cè)該化合物為3-（2，3-二氫苯并[1，4]二噁英-6-基）-7-羥基-2-三氟甲基-4-酮，屬于異黃酮類化合物。

在正離子模式下，以保留時(shí)間為10.054 min的化合物為例，其獲得m/z 621.223[M+H]+的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生1分子 酮的碎片離子m/z 309.118[M+H-C18H17NO4]+，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C36H32N2O8，再結(jié)合文獻(xiàn)[31]，推測(cè)該化合物為Oriciacridone F，其基本骨架為 酮類，由2分子含氮 酮構(gòu)成。

綜上，黃酮及其苷類化合物的主要裂解方式是通過RDA裂解與黃酮類的基本裂解途徑Ⅱ得到碎片離子A1+.、B1+.、B2+.，以及丟失蕓香糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖殘基與OH、OCH3、CO等母環(huán)上的功能基團(tuán)[32]。以黃顏木素為例，其裂解規(guī)律見圖6。

2.6 香豆素類化合物的鑒定及裂解規(guī)律

有研究發(fā)現(xiàn)，巖白菜素及其衍生物是八爪金龍藥材中含量較高的成分[33]。巖白菜素屬于異香豆素類化合物。在正、負(fù)離子模式下，共鑒定出10個(gè)香豆素類化合物，包括簡單香豆素類化合物{[（7-羥基-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-6-基）氧基]乙酸、[7-（羧基甲氧基）-4-甲基-2-氧-2-羥色基-3-基]乙酸、6，7-二羥基-4-甲基香豆素、七葉內(nèi)酯、秦皮素、7，8-二羥基-4-甲基香豆素、4-甲基傘形酮葡萄糖醛酸、二十烷酮}、呋喃香豆素類化合物[4，9-二羥基7H-呋喃并（3，2-g）色烯-7-酮]及異香豆素類化合物（巖白菜素）。香豆素類化合物結(jié)構(gòu)式見圖7。

通過對(duì)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+及[M-H]-進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在負(fù)離子模式下，以保留時(shí)間為4.556 min的化合物為例，其獲得m/z? 327.072[M-H]-的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生脫去1分子CH2O[M-H-CH2O]-的碎片峰m/z 297.333，再以及脫去1分子CH3O和1分子OH的碎片峰m/z 249.040[M-H-CH2O-CH3O-OH]-，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C14H16O9，再結(jié)合文獻(xiàn)[34]，推測(cè)該化合物為巖白菜素。

以保留時(shí)間為6.395 min的化合物為例，其獲得m/z 193.049[M+H]+的一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)，二級(jí)質(zhì)譜出現(xiàn)m/z 165.055[M+H-CO]+、147.117[M+H-CO-H2O]+的碎片峰，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下數(shù)據(jù)庫得到分子式C10H8O4，再結(jié)合文獻(xiàn)[35]推測(cè)該化合物為6，7-二羥基-4-甲基香豆素。

可見，m/z 233.044、219.065、193.050、191.070、187.039、177.055、175.075、149.060、147.117、137.060、133.065、119.086、91.055、85.065等碎片離子是香豆素類裂解和糖苷鍵斷裂的特征離子。

綜上，香豆素類化合物的主要裂解途徑是母核側(cè)鏈上的H2O、CH3、OCH3、CO、CO2、COOH以及其他功能基團(tuán)的斷裂與丟失[36]。以[（7-羥基-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-6-基）氧基]乙酸為例，其裂解規(guī)律[37]見圖8。

2.7 巖白菜素的驗(yàn)證

取“2.2.1”項(xiàng)下3種供試品溶液及“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜與質(zhì)譜條件進(jìn)樣分析，將供試品溶液得到的2號(hào)峰與巖白菜素對(duì)照品的保留時(shí)間、分子量和裂解碎片進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果，供試品溶液中2號(hào)峰的裂解規(guī)律與巖白菜素對(duì)照品基本一致;同時(shí)，結(jié)合現(xiàn)有文獻(xiàn)[34，36]，確定為2號(hào)峰為巖白菜素。

2.8 3種不同基原八爪金龍藥材中黃酮類、香豆素類化合物的相對(duì)含量變化

本研究以17個(gè)黃酮類及10個(gè)香豆素類化合物峰面積與巖白菜素峰面積的比值，作為前者的相對(duì)含量（2號(hào)峰以其峰面積均值計(jì)）。2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定以巖白菜素為八爪金龍藥材的鑒別和含量測(cè)定的指標(biāo)[1]，加之巖白菜素峰面積較大、含量較高，故以巖白菜素為參照，在Compound Discoverer 3.1定性分析軟件提取峰面積的基礎(chǔ)上對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，得到3種不同基原八爪金龍藥材中同一化合物的相對(duì)含量。結(jié)果，黃酮類、香豆素類化合物中，3種不同基原八爪金龍藥材中共有5個(gè)共有成分，分別為巖白菜素（2號(hào)峰）、[7-（羧基甲氧基）-4-甲基-2-氧-2-羥色基-3-基]乙酸（5號(hào)峰）、墨沙酮（16號(hào)峰）、槲皮素（18號(hào)峰）、Oriciacridone F（26號(hào)峰），且共有成分的含量存在明顯差異。

其中，2、5號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物在朱砂根、紅涼傘中的相對(duì)含量較高，說明其是重要的香豆素類成分;16號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物在百兩金中的含量明顯高于朱砂根和紅涼傘;18號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物在紅涼傘中的含量較高，在朱砂根中的含量較低，相對(duì)含量順序依次為紅涼傘>百兩金>朱砂根;2、5、26號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物在朱砂根和紅涼傘中含量相近且均明顯高于百兩金。

除5個(gè)共有成分外，其余22個(gè)成分均為差異化學(xué)成分，分別為1、3～4、6～15、17、19～25、27號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物，其中1、7、9～11、17、20～22、24、27號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物存在于朱砂根和紅涼傘中，且大多含量相近;3、6、8、23號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物僅存在于紅涼傘中;12～15、19號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物僅存在于百兩金中，詳見圖9。

3 討論

本研究采用四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法在正、負(fù)離子模式下對(duì)不同基原八爪金龍藥材進(jìn)行了鑒定。結(jié)果，共鑒定出17個(gè)黃酮類化合物和10個(gè)香豆素類化合物。同時(shí)，對(duì)其主要質(zhì)譜裂解碎片進(jìn)行了歸屬，并分析了其可能的裂解規(guī)律[38]。這17個(gè)黃酮類化合物包括槲皮素3-O-鼠李糖苷7-O-葡糖苷、楊梅素、蘆丁、毛里求斯排草素、山柰酚、槲皮素、異鼠李素、槲皮苷、美恩西汀、表?xiàng)攦翰杷?、兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、黃顏木素、圣草酚、3-（2，3-二氫苯并[1，4]二噁英-6-基）-7-羥基-2-三氟甲基-4-酮、墨沙酮、Oriciacridone F，10個(gè)香豆素類化合物包括[（7-羥基-4-甲基-2-氧代-2H-色烯-6-基）氧基]乙酸、[7-（羧基甲氧基）-4-甲基-2-氧-2-羥色基-3-基]乙酸、6，7-二羥基-4-甲基香豆素、七葉內(nèi)酯、秦皮素、7，8-二羥基-4-甲基香豆素、4-甲基傘形酮葡萄糖醛酸、二十烷酮、4，9-二羥基7H-呋喃并[3，2-g]色烯-7-酮、巖白菜素;黃酮類化合物的特征斷裂主要為C環(huán)開裂及基團(tuán)丟失導(dǎo)致C環(huán)變形，C環(huán)上的化學(xué)鍵能夠以任意組合發(fā)生裂解，得到A環(huán)和B環(huán)碎片離子;此外，A環(huán)能夠配合C環(huán)的斷裂而發(fā)生改變，如生成三鍵或雙鍵變單鍵，苷類化合物的糖基多為C-3位取代，也有C-7位取代，但糖基的斷裂首先發(fā)生在C-3位。香豆素類化合物的特征斷裂主要為所連基團(tuán)的丟失及內(nèi)酯環(huán)的變化。

本研究中，不同基原八爪金龍藥材中黃酮類及香豆素類化合物共有5個(gè)共有成分，且其相對(duì)含量存在明顯差異，其中2、5和26號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物在朱砂根和紅涼傘中的相對(duì)含量相近，且高于百兩金;16號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物在百兩金中的相對(duì)含量高于朱砂根和紅涼傘，18號(hào)峰對(duì)應(yīng)化合物的相對(duì)含量順序依次為紅涼傘>百兩金>朱砂根。有4個(gè)黃酮類（12、14、15、19號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物）、1個(gè)香豆素類（13號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物）化合物僅存在于百兩金中，其中19號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物（異鼠李素）的相對(duì)含量較高，可作為區(qū)別百兩金與其他兩種基原八爪金龍藥材的指標(biāo)成分。異鼠李素是一種黃酮醇類化合物，具有抗腫瘤、降血壓、降血脂、抗氧化及擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等藥理作用[39]。有2個(gè)黃酮類（3、8號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物），2個(gè)香豆素類（6、23號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物）僅存在于紅涼傘中，其中6號(hào)峰對(duì)應(yīng)的化合物（4，9-二羥基7H-呋喃并[3，2-g]色烯-7-酮）相對(duì)含量較高，可作為區(qū)別紅涼傘與其他兩種基原八爪金龍藥材的指標(biāo)成分。槲皮素3-O-鼠李糖苷-7-O-葡糖苷是一種黃酮苷類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[40]。但黃酮類及香豆素類化合物的有無及含量差異是否會(huì)導(dǎo)致八爪金龍藥理活性的不同尚無法確定，仍有待進(jìn)一步研究。此外，百兩金中黃酮類化合物的種類和含量均多于朱砂根和紅涼傘，其他化合物的相對(duì)含量差異較大，而朱砂根與紅涼傘較相似，因此百兩金與朱砂根、紅涼傘是否能夠作為同一基原八爪金龍藥材入藥尚有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，UPLC-QE-HF-MS/MS法可高效、精確、快速地鑒別不同基原八爪金龍藥材中黃酮類、香豆素類化學(xué)成分。

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（收稿日期：2020-11-01 修回日期：2021-01-06）

（編輯：陳 宏）