黃瓜子多糖的分離、純化和體外抗氧化活性研究

張志宏 邢娜 彭東輝 王秋紅 匡海學(xué)

摘 要 目的：對(duì)黃瓜子多糖進(jìn)行分離、純化，并考察其體外抗氧化活性。方法：采用水提醇沉法提取黃瓜子粗多糖（CCL），然后以Amberlite FPA90Cl陰離子和Amberlite FPC3500H陽(yáng)離子串聯(lián)交換樹(shù)脂柱和離子交換纖維素DEAE Cellulose 52柱對(duì)CCL進(jìn)行分離、純化得到CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6 等3種多糖。結(jié)合高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法、超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法和紫外、紅外光譜等多種技術(shù)對(duì)3種均一多糖的純度、分子量、結(jié)構(gòu)和單糖組成等進(jìn)行分析。以維生素C（VC）為陽(yáng)性對(duì)照，考察CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6（質(zhì)量濃度均為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL）對(duì)1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力，并計(jì)算其半數(shù)清除濃度（IC50）。結(jié)果：CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6均為吡喃糖形式的均一多糖，分子量分別為9.614×106、2.024×107、3.343×107 Da。CCL-M2的單糖組成為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，其摩爾比為5.1 ∶ 2.6 ∶ 1.7 ∶ 1.4 ∶ 31.6;CCL-M3和CCL-M6的單糖組成均為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖，其摩爾比分別為1.7 ∶ 3.8 ∶ 6.4 ∶ 3.3 ∶ 1.3和1.3 ∶ 3.0 ∶ 3.2 ∶ 4.4 ∶ 8.9。體外抗氧化活性結(jié)果顯示，3種均一多糖對(duì)DPPH·、·OH、O2-·均具有一定的清除活性，其對(duì)DPPH·的清除活性強(qiáng)弱順序?yàn)閂C>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6（IC50依次為0.309、1.240、1.489、1.713 mg/mL），對(duì)·OH的清除活性強(qiáng)弱順序?yàn)閂C>CCL-M2>CCL-M6>CCL-M3（IC50依次為0.968、1.032、1.233、1.356 mg/mL），對(duì)O2-·的清除活性強(qiáng)弱順序?yàn)閂C>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6（IC50依次為0.335、0.379、0.812、1.662 mg/mL）。結(jié)論：從黃瓜子中分離得到3種吡喃糖形式的均一多糖均具有一定的體外抗氧化活性，其中以CCL-M2的活性最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 黃瓜子;均一多糖;分離;純化;抗氧化活性

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To isolate and purify the polysaccharides from Cucumis satiuus， and to investigate its in vitro antioxidant activity. METHODS： The crude polysaccharides （CCL） were extracted from C. satiuus by water extraction and alcohol precipitation. CCL was separated and purified on Amberlite FPA90Cl anion and Amberlite FPC3500H cation exchange resin column and DEAE cellulose 52 column， so as to obtain 3 kinds of polysaccharides as CCL-M2， CCL-M3， CCL-M6. The purity， molecular weight， structure and monosaccharide composition of 3 kinds of polysaccharides were analyzed by HPLC-ELSD， UPLC-QTOF/MS， UV and IR. Using vitamin C （VC） as positive control， the scavenging activity of CCL-M2， CCL-M3 and CCL-M6 （0.4， 0.8， 1.2， 1.6， 2.0 mg/mL） to 1，1-dibenzene-2-trinitrobenzene free radicals （DPPH·）， hydroxyl free radicals （·OH） and superoxycyclic anion free radicals （O2-·） were investigated， and IC50 was calculated. RESULTS： CCL-M2， CCL-M3 and CCL-M6 were homogeneous polysaccharides in the form of pyranose， with molecular weights of 9.614×106， 2.024×107 and 3.343×107 Da， respectively. CCL-M2 monosaccharides were composed of rhamnose， semi-lactose aldehyde acid， glucose，? semi-lactose and arabic sugar， with a molar ratio of 5.1 ∶ 2.6 ∶ 1.7 ∶ 1.4 ∶ 31.6. CCL-M3 and CCL-M6 monosaccharides were composed of mannose， rhamnose， glucose， semi-lactose， arabic sugar， with a molar ratio of 1.7 ∶ 3.8 ∶ 6.4 ∶ 3.3 ∶ 1.3 and 1.3 ∶ 3.0 ∶ 3.2 ∶ 4.4 ∶ 8.9. The results of antioxidant activity in vitro showed that 3 kinds of homogeneous polysaccharides had certain scavenging activity on DPPH·， ·OH and O2-·; the order of scavenging activity to DPPH· was VC>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6 （IC50 was 0.309， 1.240， 1.489 and 1.713 mg/mL）; the order of scavenging activity to ·OH was VC>CCL-M2>CCL-M6>CCL-M3 （IC50 was 0.968， 1.032， 1.233， 1.356 mg/mL）; the order of scavenging activity to O2-· was VC>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6 （IC50 was 0.335， 0.379， 0.812， 1.662 mg/mL）. CONCLUSIONS： 3 kinds of monosaccharides in the form of pyranose are isolated from C. satiuus， and all of them have antioxidant activity in vitro， and CCL-M2 is the best.

KEYWORDS? ?Cucumis satiuus; Homogeneous polysaccharides; Separation; Purification; Antioxidant activity

黃瓜子為葫蘆科藥食同源植物黃瓜Cucumis satiuus L.的干燥成熟種子。夏、秋二季取種子成熟的老黃瓜，剖開(kāi)，取出種子，曬干，即得[1]。黃瓜子主要含有糖和苷類(lèi)、三萜類(lèi)、植物甾醇類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)等成分[2]，具有舒筋接骨、祛風(fēng)消疾的功效，可用于骨折筋傷、風(fēng)濕痹痛、勞傷咳嗽等[3]。多糖是繼蛋白質(zhì)、核酸和脂類(lèi)之后的維持人類(lèi)生命的第四大重要物質(zhì)，與機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、癌癥的診斷與治療等密切相關(guān)[4-6]。隨著多糖研究的大量開(kāi)展，中藥多糖的抗病毒、降血糖、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗神經(jīng)炎和調(diào)節(jié)免疫等藥理活性被逐漸證實(shí)[7]。但目前針對(duì)黃瓜子的研究多集中在小分子物質(zhì)上，而對(duì)于黃瓜子多糖的研究鮮有報(bào)道。有研究指出，黃瓜子具有抑制自由基產(chǎn)生并加速自由基清除的作用，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[3]，但該作用是否與黃瓜子多糖有關(guān)尚未可知。因此，本研究以黃瓜子多糖為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分離、純化后收集均一多糖，并通過(guò)光譜技術(shù)對(duì)其組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，然后通過(guò)體外自由基清除試驗(yàn)考察黃瓜子多糖的體外抗氧化活性，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 主要儀器

ME104型電子分析天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器（中國(guó)）有限公司;JY92-IIN型高速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀集團(tuán)有限公司;BS100N型自動(dòng)部分收集器、HL-2N型恒流泵均購(gòu)自上海青浦滬西儀器廠;Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司;iMark型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;FDU-2110型冷凍干燥機(jī)購(gòu)自日本EYELA公司;UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自日本Shimadzu公司;TENSOR37型傅里葉紅外光譜儀購(gòu)自德國(guó)Bruker公司;Alliance 2695型高效液相色譜（HPLC）儀、X500R型超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-QTOF/MS）儀、2998型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）均購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

1.2 主要藥品與試劑

黃瓜子藥材（批號(hào)20191215）于2020年購(gòu)自河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱教授鑒定為葫蘆科植物黃瓜C.satiuus L.的干燥成熟種子;離子交換纖維素DEAE Cellulose 52（粒徑50 μm）購(gòu)自美國(guó)Whatman公司;分子量分別為40 000、2 000、500、70、40、10 kDa的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)分別為D91501054、D91502032、D91502032、D91502032、D91502032、D91502032，純度為99.7%）和陰離子交換樹(shù)脂Amberlite FPA90Cl（粒徑580～840 μm）、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂Amberlite FPC3500H（粒徑580～840 μm）、三氟乙酸（TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖（批號(hào)CHB180929）、葡萄糖醛酸（批號(hào)CHB180902）、半乳糖醛酸（批號(hào)CHB180227）、阿拉伯糖（批號(hào)CHB180206）、半乳糖（批號(hào)CHB180227）、鼠李糖（批號(hào)CHB190217）、木糖（批號(hào)CHB180301）、甘露糖（批號(hào)CHB180615）等單糖標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均不低于98%;維生素C原料藥（VC，批號(hào)28288902，純度>99.7%）購(gòu)自天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心;過(guò)氧化氫購(gòu)自廣東恒健制藥有限公司;濃硫酸、苯酚、乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃瓜子粗多糖（CCL）的提取

將干燥黃瓜子藥材打成粗粉。稱(chēng)取粗粉5 kg，以10倍量（mL/g，下同）的80%乙醇加熱回流提取3次、每次3 h，提取液經(jīng)8層紗布濾過(guò)后，合并3次濾液。藥渣自然晾干，然后以10倍量水加熱回流提取3次、每次2 h，水提液經(jīng)8層紗布濾過(guò)后，合并3次濾液。將2次合并液混合并減壓濃縮至一定體積（約1 L），然后加入85%乙醇進(jìn)行醇沉（邊加醇邊進(jìn)行攪拌），使藥液中乙醇體積分?jǐn)?shù)約為70%后，靜置24 h，抽濾，得到沉淀物，反復(fù)按上述方法醇沉3次。將醇沉后的沉淀物用無(wú)水乙醇和丙酮交替洗滌3次，真空干燥除去殘留的洗滌溶劑，即得CCL，得率為5.06%。

2.2 CCL的分離、純化

用水將CCL制成0.03 g/mL的多糖溶液，以4 750 r/min離心15 min，取上清液，以Amberlite FPA90Cl陰離子和Amberlite FPC3500H陽(yáng)離子串聯(lián)交換樹(shù)脂柱進(jìn)行分離：先用水洗脫（流速為10 mL/min，按5 mL/管分管收集），經(jīng)苯酚-硫酸法[8]檢測(cè)至無(wú)糖組分流出時(shí)，改用1 mol/L氯化鈉溶液洗脫（流速為10 mL/min，按5 mL/管分管收集），直至洗脫到無(wú)糖組分流出為止。將以上得到的兩個(gè)組分洗脫液濃縮后分別裝至截留分子量為3 500 Da的透析袋中，先用流動(dòng)水透析48 h，再用水浸泡24 h，每隔6 h換水1次（下同）;然后，將袋內(nèi)溶液分別減壓濃縮，冷凍干燥，即得到水、1 mol/L氯化鈉溶液洗脫組分，分別命名為CCL-S、CCL-M，得率分別為8.00%、13.33%，密封干燥保存。

將CCL-M溶解于水中制成質(zhì)量濃度為0.03 g/mL的多糖樣品溶液，以4 750 r/min離心15 min，收集上清液，以離子交換纖維素DEAE Cellulose 52柱進(jìn)行純化：依次用水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫（流速均為2 mL/min，按5 mL/管分管收集），每隔5管采用苯酚-硫酸法顯色[8]，并以洗脫管數(shù)-紫外光譜吸光度值繪制洗脫曲線(xiàn)，合并出峰位置相同的組分，用截留分子量為3 500 Da的透析袋透析;然后，將透析袋內(nèi)液減壓濃縮，冷凍干燥，分別得到3個(gè)多糖組分，分別命名為CCL-M2（水洗脫部位）、CCL-M3（0.4 mol/L 氯化鈉溶液洗脫部位）、CCL-M6（0.4 mol/L氯化鈉溶液洗脫部位），得率分別為0.40%、0.44%、4.50%，密封干燥保存。黃瓜子多糖組分CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6在DEAE-52纖維素柱中的洗脫曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

2.3 黃瓜子3種多糖的純度檢測(cè)

將CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6分別以水溶解，均制成2 mg/mL的供試溶液，采用HPLC-ELSD法分別檢測(cè)其多糖純度[9-10]。色譜柱為Shodex sugar KS-805糖柱+KS-G高效凝膠過(guò)濾色譜柱，流動(dòng)相為超純水，柱溫為40 ℃，流速為0.7 mL/min，載氣流速1 mL/min，氣體壓力40 psi，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6譜圖中均顯示為單一對(duì)稱(chēng)峰，表明以上3個(gè)黃瓜子多糖均為均一多糖。黃瓜子多糖組分CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6的HPLC-ELSD色譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 黃瓜子3種均一多糖的分子量測(cè)定

采用HPLC-ELSD法進(jìn)行測(cè)定，條件同“2.3”項(xiàng)。取分子量分別為40 000、2 000、500、70、40、10 kDa的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別用水制成質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣分析并記錄色譜圖。以各標(biāo)準(zhǔn)品分子量的lg值（x）為橫坐標(biāo)、保留時(shí)間（y）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[11]，得到回歸方程為y=-0.734 1x+9.625 7（R 2=0.999 0）。分別取黃瓜子3種均一多糖樣品適量，用水溶解制成質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將各樣品的保留時(shí)間分別代入上述回歸方程中，計(jì)算得CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6的分子量分別為9.614×106、2.024×107、3.343×107 Da。

2.5 黃瓜子3種均一多糖的結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 紫外吸收特性分析 稱(chēng)取CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6各4 mg，用水制成質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的溶液，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，檢測(cè)其在260、280 nm波長(zhǎng)處是否含有核酸和蛋白質(zhì)綴合物吸收峰[12]。結(jié)果顯示，CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6在260、280 nm波長(zhǎng)處均無(wú)明顯吸收峰，表明經(jīng)過(guò)分離、純化得到的是3種精制的均一多糖，均不含有核酸和蛋白質(zhì)。黃瓜子均一多糖CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6的紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖3。

2.5.2 紅外吸收特性分析 分別取CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6各適量（1～2 mg）和干燥的溴化鉀粉末50 mg，在瑪瑙研缽中研磨混勻，在壓片機(jī)上制成透明薄片，然后使用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外光譜圖[13]。結(jié)果顯示，CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6有相似的吸收峰。其中，在3 402 cm-1附近寬而強(qiáng)的吸收峰代表有O-H伸縮振動(dòng)和氫鍵的存在;在2 925 cm-1附近的弱吸收峰代表有-CH和C-H伸縮振動(dòng)的存在;在2 364 cm-1附近的吸收峰代表有三鍵或累積雙鍵的存在;在1 659 cm-1附近的吸收峰代表有 -COOH的非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的存在;在1 551cm-1處的吸收峰代表有-C-O-伸縮振動(dòng)的存在;在1 412 cm-1附近的吸收峰代表有-COOH中C-O鍵的伸縮振動(dòng)的存在;在1 000～1 200 cm-1附近的吸收峰代表有C-OH側(cè)基和C-O-C糖苷鍵伸縮振動(dòng)的存在;610 cm-1附近的吸收峰為吡喃糖的特征吸收峰。以上結(jié)果表明，CCL-M2、CCL-M3、CLL-M6均是吡喃糖形式[14]。黃瓜子均一多糖CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6的紅外光譜圖見(jiàn)圖4。

2.6 黃瓜子3種均一多糖的單糖組成分析

2.6.1 均一多糖的完全酸水解及衍生化處理 分別稱(chēng)取CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6各1 mg，置于不同具塞試管中，加入 4 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL溶解，密封，120 ℃油浴2 h后，用氮吹儀吹干。沉淀物加甲醇200 μL進(jìn)行溶解，再以氮吹儀吹干，反復(fù)以上操作2次。最后將沉淀物再次以甲醇200 μL復(fù)溶，即得完全酸水解液。在完全酸水解溶液中加入氨水0.5 mL，然后再加入 0.5 mol/mL的PMP甲醇溶液0.5 mL進(jìn)行衍生化反應(yīng)，封口，70 ℃水浴30 min。在上述提取液中加入甲醇100 μL，用氮吹儀吹干，重復(fù)操作3次。沉淀物再次以甲醇100 μL復(fù)溶，即得酸水解和衍生化處理后的樣品溶液[15]。

2.6.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化處理及混標(biāo)溶液的制備稱(chēng)取8種單糖（葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、甘露糖）標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg，分別置于8支具塞試管中，每管加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液0.5 mL進(jìn)行衍生化反應(yīng)，封口，70 ℃水浴30 min。在上述提取液中加入甲醇100 μL，用氮吹儀吹干溶劑，反復(fù)以上操作3次，即得PMP衍生化單糖標(biāo)準(zhǔn)品。取上述各衍生化單糖標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，分別用甲醇1 mL溶解，作為各單糖標(biāo)準(zhǔn)品母液;分別吸取上述單糖標(biāo)準(zhǔn)品母液各100 μL，置于同一具塞試管中，渦旋混勻，即得各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)溶液[16]。

2.6.3 UPLC-QTOF/MS分析條件 色譜條件參考文獻(xiàn)[17]設(shè)置：以CORTECS C18 PFP為色譜柱，以20 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相A（462 mg乙酸銨溶解于300 mL 0.05%乙酸中配制而成）、乙腈為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～16 min，80%A;16～20 min，80%A→50%A;20～25 min，50%A→5%A;25～26 min，5%A→80%A;26～28 min，80%A），柱溫為30 ℃，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜分析的離子源為電噴霧電離源（ESI），在正離子模式下采集m/z 400～600范圍內(nèi)的數(shù)據(jù);霧化氣（N2）和脫溶氣體（N2）的流速分別為50、500 L/h，電離源溫度為100 ℃，溶劑溫度為300 ℃，毛細(xì)管電泳電壓為3.0 kV，錐孔電壓為30 V;以亮氨酸腦啡肽（m/z 556.277 1，500 ng/mL）進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正;Lock Spray頻率設(shè)定為10 s，使用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)采集和處理。

2.6.4 單糖組成分析 分別取“2.6.1”項(xiàng)下經(jīng)酸水解和衍生化處理后的3種均一多糖樣品溶液以及“2.6.2”項(xiàng)下的混標(biāo)溶液，按“2.6.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄總離子流圖（見(jiàn)圖5）。通過(guò)與混標(biāo)樣品總離子圖進(jìn)行對(duì)比分析可知，CCL-M2由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比為5.1 ∶ 2.6 ∶ 1.7 ∶ 1.4 ∶ 31.6，其中以鼠李糖和阿拉伯糖摩爾含量最高;CCL-M3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比為1.7 ∶ 3.8 ∶ 6.4 ∶ 3.3 ∶ 1.3，其中以葡萄糖摩爾含量最高;CCL-M6由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比為1.3 ∶ 3.0 ∶ 3.2 ∶ 4.4 ∶ 8.9，其中以半乳糖摩爾含量最高。

2.7 黃瓜子3種均一多糖的體外抗氧化活性研究

2.7.1 清除DPPH·能力的測(cè)定 分別稱(chēng)取不同質(zhì)量的CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6和VC（陽(yáng)性對(duì)照）溶于水中，制成質(zhì)量濃度均為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的系列樣品溶液。吸取上述不同質(zhì)量濃度的樣品溶液各50 μL，加入 DPPH溶液50 μL，充分混勻后，在25 ℃下避光反應(yīng)30 min后，采用酶標(biāo)儀于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度（A）[18]，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，取平均值。按以下公式計(jì)算DPPH·清除率[19]：DPPH·清除率（%）=[（1-（Ai-Aj）/A0）]×100%;式中，Ai為樣品溶液與DPPH溶液混合后的A值，Aj為樣品溶液的A值，A0為DPPH溶液的A值。通過(guò)軟件Graphphad Prism 7.0計(jì)算各樣品的半數(shù)清除濃度（IC50）。結(jié)果顯示，在所測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各樣品對(duì)DPPH·均有一定的清除活性，其強(qiáng)弱順序依次為VC>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6，IC50依次為0.309、1.240、1.489、1.713 mg/mL。

2.7.2 清除羥基自由基（·OH）能力的測(cè)定 分別按“2.7.1”項(xiàng)下方法制備CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6和VC（陽(yáng)性對(duì)照）不同質(zhì)量濃度的系列樣品溶液。分別吸取各質(zhì)量濃度的樣品溶液5 mL，加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、6 mmol/L過(guò)氧化氫溶液各0.5 mL，于37 ℃反應(yīng)45 min后，采用酶標(biāo)儀于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值。每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。按公式計(jì)算·OH清除率：·OH清除率（%）=（1-（Ai-Aj）/A0）×100%[20]。式中，Ai為加入樣品溶液和硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫溶液的A值，Aj為不加過(guò)氧化氫溶液的A值，A0為不加樣品溶液的A值。按照“2.7.1”項(xiàng)下方法計(jì)算各樣品對(duì)·OH的IC50。結(jié)果顯示，各樣品對(duì)·OH均有一定的清除活性，其強(qiáng)弱順序依次為VC>CCL-M2>CCL-M6>CCL-M3，IC50依次為0.968、1.032、1.233、1.356 mg/mL。

2.7.3 清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力的測(cè)定 分別“2.7.1”項(xiàng)下方法制備CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6和VC（陽(yáng)性對(duì)照）不同質(zhì)量濃度的系列樣品溶液。分別吸取各質(zhì)量濃度的樣品溶液5 mL，置于10 mL具塞試管中，均加入 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）4.7 mL，在25 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)20 min后，立即加入事先預(yù)熱好的鄰苯三酚溶液0.3 mL，混勻。采用酶標(biāo)儀于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值，每隔30 s測(cè)定1次，共測(cè)定5 min，算出每分鐘A值的增量，然后通過(guò)計(jì)算每分鐘A值的增量與時(shí)間的比值得到自氧化速率[21]。每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。按公式計(jì)算O2-·清除率：O2-·清除率（%）=（1-ΔAi/ΔA0）×100%[21]。式中，ΔAi為加入樣品溶液后鄰苯三酚的自氧化速率;ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率。按照“2.7.1”項(xiàng)下方法計(jì)算各樣品對(duì)O2-·的IC50。結(jié)果顯示，各樣品對(duì)O2-·均有一定的清除活性，其強(qiáng)弱順序依次為VC>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6，IC50依次為0.335、0.379、0.812、1.662 mg/mL。

3 討論

在本研究中，筆者首次對(duì)CCL進(jìn)行提取，并進(jìn)一步進(jìn)行分離、純化后得到CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6等3種均一多糖。結(jié)合紫外、紅外等多種光譜技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定后，發(fā)現(xiàn)3種均一多糖具有相似的化學(xué)鍵和官能團(tuán)，并呈現(xiàn)出糖類(lèi)物質(zhì)的典型吸收峰，且均是吡喃糖。其中，CCL-M2由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比為5.1 ∶ 2.6 ∶ 1.7 ∶ 1.4 ∶ 31.6，分子量為9.614×106 Da;CCL-M3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比為1.7 ∶ 3.8 ∶ 6.4 ∶ 3.3 ∶ 1.3，分子量為2.024×107 Da;CCL-M6亦由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成，其摩爾比為1.3 ∶ 3.0 ∶ 3.2 ∶ 4.4 ∶ 8.9，分子量為3.343×107 Da。該結(jié)果表明，CCL-M3和CCL-M6具有相同的單糖組成，但摩爾比不同;CCL-M2與另外2種多糖的單糖組成不同，這可能是因?yàn)镃CL-M2是從水洗脫部位中分離出來(lái)的多糖，而CCL-C3和CCL-C6是從鹽洗脫部位中分離出來(lái)的多糖，故組成存在差異。

DPPH·、·OH、O2-·是生物體內(nèi)主要的活性氧自由基，其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化是導(dǎo)致衰老、心血管疾病和腫瘤發(fā)生的重要原因之一[22]。本研究通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種均一多糖對(duì)DPPH·、·OH、O2-·均有一定的清除作用，且在相同的質(zhì)量濃度下，CCL-M2的抗氧化活性要強(qiáng)于其余2個(gè)均一多糖，筆者推測(cè)這可能是由于該多糖的單糖組成不同于其他兩個(gè)多糖所造成的。此外，筆者推測(cè)這種差異還可能與多糖的糖苷鍵類(lèi)型、三螺旋結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)，故其抗氧化活性的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究從黃瓜子中分離得到3種吡喃糖形式的均一多糖均具有一定的體外抗氧化活性，其中以CCL-M2的活性最強(qiáng)。

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（收稿日期：2020-11-19 修回日期：2021-01-08）

（編輯：林 靜）