• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黃瓜子多糖的分離、純化和體外抗氧化活性研究

    2021-04-08 02:03:21張志宏邢娜彭東輝王秋紅匡海學(xué)
    中國(guó)藥房 2021年4期

    張志宏 邢娜 彭東輝 王秋紅 匡海學(xué)

    摘 要 目的:對(duì)黃瓜子多糖進(jìn)行分離、純化,并考察其體外抗氧化活性。方法:采用水提醇沉法提取黃瓜子粗多糖(CCL),然后以Amberlite FPA90Cl陰離子和Amberlite FPC3500H陽(yáng)離子串聯(lián)交換樹(shù)脂柱和離子交換纖維素DEAE Cellulose 52柱對(duì)CCL進(jìn)行分離、純化得到CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6 等3種多糖。結(jié)合高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法、超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法和紫外、紅外光譜等多種技術(shù)對(duì)3種均一多糖的純度、分子量、結(jié)構(gòu)和單糖組成等進(jìn)行分析。以維生素C(VC)為陽(yáng)性對(duì)照,考察CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6(質(zhì)量濃度均為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL)對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力,并計(jì)算其半數(shù)清除濃度(IC50)。結(jié)果:CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6均為吡喃糖形式的均一多糖,分子量分別為9.614×106、2.024×107、3.343×107 Da。CCL-M2的單糖組成為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖,其摩爾比為5.1 ∶ 2.6 ∶ 1.7 ∶ 1.4 ∶ 31.6;CCL-M3和CCL-M6的單糖組成均為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖,其摩爾比分別為1.7 ∶ 3.8 ∶ 6.4 ∶ 3.3 ∶ 1.3和1.3 ∶ 3.0 ∶ 3.2 ∶ 4.4 ∶ 8.9。體外抗氧化活性結(jié)果顯示,3種均一多糖對(duì)DPPH·、·OH、O2-·均具有一定的清除活性,其對(duì)DPPH·的清除活性強(qiáng)弱順序?yàn)閂C>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6(IC50依次為0.309、1.240、1.489、1.713 mg/mL),對(duì)·OH的清除活性強(qiáng)弱順序?yàn)閂C>CCL-M2>CCL-M6>CCL-M3(IC50依次為0.968、1.032、1.233、1.356 mg/mL),對(duì)O2-·的清除活性強(qiáng)弱順序?yàn)閂C>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6(IC50依次為0.335、0.379、0.812、1.662 mg/mL)。結(jié)論:從黃瓜子中分離得到3種吡喃糖形式的均一多糖均具有一定的體外抗氧化活性,其中以CCL-M2的活性最強(qiáng)。

    關(guān)鍵詞 黃瓜子;均一多糖;分離;純化;抗氧化活性

    ABSTRACT? ?OBJECTIVE: To isolate and purify the polysaccharides from Cucumis satiuus, and to investigate its in vitro antioxidant activity. METHODS: The crude polysaccharides (CCL) were extracted from C. satiuus by water extraction and alcohol precipitation. CCL was separated and purified on Amberlite FPA90Cl anion and Amberlite FPC3500H cation exchange resin column and DEAE cellulose 52 column, so as to obtain 3 kinds of polysaccharides as CCL-M2, CCL-M3, CCL-M6. The purity, molecular weight, structure and monosaccharide composition of 3 kinds of polysaccharides were analyzed by HPLC-ELSD, UPLC-QTOF/MS, UV and IR. Using vitamin C (VC) as positive control, the scavenging activity of CCL-M2, CCL-M3 and CCL-M6 (0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2.0 mg/mL) to 1,1-dibenzene-2-trinitrobenzene free radicals (DPPH·), hydroxyl free radicals (·OH) and superoxycyclic anion free radicals (O2-·) were investigated, and IC50 was calculated. RESULTS: CCL-M2, CCL-M3 and CCL-M6 were homogeneous polysaccharides in the form of pyranose, with molecular weights of 9.614×106, 2.024×107 and 3.343×107 Da, respectively. CCL-M2 monosaccharides were composed of rhamnose, semi-lactose aldehyde acid, glucose,? semi-lactose and arabic sugar, with a molar ratio of 5.1 ∶ 2.6 ∶ 1.7 ∶ 1.4 ∶ 31.6. CCL-M3 and CCL-M6 monosaccharides were composed of mannose, rhamnose, glucose, semi-lactose, arabic sugar, with a molar ratio of 1.7 ∶ 3.8 ∶ 6.4 ∶ 3.3 ∶ 1.3 and 1.3 ∶ 3.0 ∶ 3.2 ∶ 4.4 ∶ 8.9. The results of antioxidant activity in vitro showed that 3 kinds of homogeneous polysaccharides had certain scavenging activity on DPPH·, ·OH and O2-·; the order of scavenging activity to DPPH· was VC>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6 (IC50 was 0.309, 1.240, 1.489 and 1.713 mg/mL); the order of scavenging activity to ·OH was VC>CCL-M2>CCL-M6>CCL-M3 (IC50 was 0.968, 1.032, 1.233, 1.356 mg/mL); the order of scavenging activity to O2-· was VC>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6 (IC50 was 0.335, 0.379, 0.812, 1.662 mg/mL). CONCLUSIONS: 3 kinds of monosaccharides in the form of pyranose are isolated from C. satiuus, and all of them have antioxidant activity in vitro, and CCL-M2 is the best.

    KEYWORDS? ?Cucumis satiuus; Homogeneous polysaccharides; Separation; Purification; Antioxidant activity

    黃瓜子為葫蘆科藥食同源植物黃瓜Cucumis satiuus L.的干燥成熟種子。夏、秋二季取種子成熟的老黃瓜,剖開(kāi),取出種子,曬干,即得[1]。黃瓜子主要含有糖和苷類(lèi)、三萜類(lèi)、植物甾醇類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、氨基酸類(lèi)等成分[2],具有舒筋接骨、祛風(fēng)消疾的功效,可用于骨折筋傷、風(fēng)濕痹痛、勞傷咳嗽等[3]。多糖是繼蛋白質(zhì)、核酸和脂類(lèi)之后的維持人類(lèi)生命的第四大重要物質(zhì),與機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的識(shí)別、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、癌癥的診斷與治療等密切相關(guān)[4-6]。隨著多糖研究的大量開(kāi)展,中藥多糖的抗病毒、降血糖、抗腫瘤、降血脂、抗氧化、抗神經(jīng)炎和調(diào)節(jié)免疫等藥理活性被逐漸證實(shí)[7]。但目前針對(duì)黃瓜子的研究多集中在小分子物質(zhì)上,而對(duì)于黃瓜子多糖的研究鮮有報(bào)道。有研究指出,黃瓜子具有抑制自由基產(chǎn)生并加速自由基清除的作用,具有較強(qiáng)的抗氧化能力[3],但該作用是否與黃瓜子多糖有關(guān)尚未可知。因此,本研究以黃瓜子多糖為研究對(duì)象,對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分離、純化后收集均一多糖,并通過(guò)光譜技術(shù)對(duì)其組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,然后通過(guò)體外自由基清除試驗(yàn)考察黃瓜子多糖的體外抗氧化活性,為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)參考。

    1 材料

    1.1 主要儀器

    ME104型電子分析天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器(中國(guó))有限公司;JY92-IIN型高速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀集團(tuán)有限公司;BS100N型自動(dòng)部分收集器、HL-2N型恒流泵均購(gòu)自上海青浦滬西儀器廠;Milli-Q Advantage A10型超純水機(jī)購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore公司;iMark型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司;FDU-2110型冷凍干燥機(jī)購(gòu)自日本EYELA公司;UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自日本Shimadzu公司;TENSOR37型傅里葉紅外光譜儀購(gòu)自德國(guó)Bruker公司;Alliance 2695型高效液相色譜(HPLC)儀、X500R型超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF/MS)儀、2998型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD)均購(gòu)自美國(guó)Waters公司。

    1.2 主要藥品與試劑

    黃瓜子藥材(批號(hào)20191215)于2020年購(gòu)自河北安國(guó)中藥材市場(chǎng),經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院劉基柱教授鑒定為葫蘆科植物黃瓜C.satiuus L.的干燥成熟種子;離子交換纖維素DEAE Cellulose 52(粒徑50 μm)購(gòu)自美國(guó)Whatman公司;分子量分別為40 000、2 000、500、70、40、10 kDa的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)分別為D91501054、D91502032、D91502032、D91502032、D91502032、D91502032,純度為99.7%)和陰離子交換樹(shù)脂Amberlite FPA90Cl(粒徑580~840 μm)、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂Amberlite FPC3500H(粒徑580~840 μm)、三氟乙酸(TFA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)均購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;葡萄糖(批號(hào)CHB180929)、葡萄糖醛酸(批號(hào)CHB180902)、半乳糖醛酸(批號(hào)CHB180227)、阿拉伯糖(批號(hào)CHB180206)、半乳糖(批號(hào)CHB180227)、鼠李糖(批號(hào)CHB190217)、木糖(批號(hào)CHB180301)、甘露糖(批號(hào)CHB180615)等單糖標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司,純度均不低于98%;維生素C原料藥(VC,批號(hào)28288902,純度>99.7%)購(gòu)自天津市天新精細(xì)化工開(kāi)發(fā)中心;過(guò)氧化氫購(gòu)自廣東恒健制藥有限公司;濃硫酸、苯酚、乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀等試劑均為分析純,水為超純水。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 黃瓜子粗多糖(CCL)的提取

    將干燥黃瓜子藥材打成粗粉。稱(chēng)取粗粉5 kg,以10倍量(mL/g,下同)的80%乙醇加熱回流提取3次、每次3 h,提取液經(jīng)8層紗布濾過(guò)后,合并3次濾液。藥渣自然晾干,然后以10倍量水加熱回流提取3次、每次2 h,水提液經(jīng)8層紗布濾過(guò)后,合并3次濾液。將2次合并液混合并減壓濃縮至一定體積(約1 L),然后加入85%乙醇進(jìn)行醇沉(邊加醇邊進(jìn)行攪拌),使藥液中乙醇體積分?jǐn)?shù)約為70%后,靜置24 h,抽濾,得到沉淀物,反復(fù)按上述方法醇沉3次。將醇沉后的沉淀物用無(wú)水乙醇和丙酮交替洗滌3次,真空干燥除去殘留的洗滌溶劑,即得CCL,得率為5.06%。

    2.2 CCL的分離、純化

    用水將CCL制成0.03 g/mL的多糖溶液,以4 750 r/min離心15 min,取上清液,以Amberlite FPA90Cl陰離子和Amberlite FPC3500H陽(yáng)離子串聯(lián)交換樹(shù)脂柱進(jìn)行分離:先用水洗脫(流速為10 mL/min,按5 mL/管分管收集),經(jīng)苯酚-硫酸法[8]檢測(cè)至無(wú)糖組分流出時(shí),改用1 mol/L氯化鈉溶液洗脫(流速為10 mL/min,按5 mL/管分管收集),直至洗脫到無(wú)糖組分流出為止。將以上得到的兩個(gè)組分洗脫液濃縮后分別裝至截留分子量為3 500 Da的透析袋中,先用流動(dòng)水透析48 h,再用水浸泡24 h,每隔6 h換水1次(下同);然后,將袋內(nèi)溶液分別減壓濃縮,冷凍干燥,即得到水、1 mol/L氯化鈉溶液洗脫組分,分別命名為CCL-S、CCL-M,得率分別為8.00%、13.33%,密封干燥保存。

    將CCL-M溶解于水中制成質(zhì)量濃度為0.03 g/mL的多糖樣品溶液,以4 750 r/min離心15 min,收集上清液,以離子交換纖維素DEAE Cellulose 52柱進(jìn)行純化:依次用水和0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫(流速均為2 mL/min,按5 mL/管分管收集),每隔5管采用苯酚-硫酸法顯色[8],并以洗脫管數(shù)-紫外光譜吸光度值繪制洗脫曲線,合并出峰位置相同的組分,用截留分子量為3 500 Da的透析袋透析;然后,將透析袋內(nèi)液減壓濃縮,冷凍干燥,分別得到3個(gè)多糖組分,分別命名為CCL-M2(水洗脫部位)、CCL-M3(0.4 mol/L 氯化鈉溶液洗脫部位)、CCL-M6(0.4 mol/L氯化鈉溶液洗脫部位),得率分別為0.40%、0.44%、4.50%,密封干燥保存。黃瓜子多糖組分CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6在DEAE-52纖維素柱中的洗脫曲線見(jiàn)圖1。

    2.3 黃瓜子3種多糖的純度檢測(cè)

    將CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6分別以水溶解,均制成2 mg/mL的供試溶液,采用HPLC-ELSD法分別檢測(cè)其多糖純度[9-10]。色譜柱為Shodex sugar KS-805糖柱+KS-G高效凝膠過(guò)濾色譜柱,流動(dòng)相為超純水,柱溫為40 ℃,流速為0.7 mL/min,載氣流速1 mL/min,氣體壓力40 psi,進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6譜圖中均顯示為單一對(duì)稱(chēng)峰,表明以上3個(gè)黃瓜子多糖均為均一多糖。黃瓜子多糖組分CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6的HPLC-ELSD色譜圖見(jiàn)圖2。

    2.4 黃瓜子3種均一多糖的分子量測(cè)定

    采用HPLC-ELSD法進(jìn)行測(cè)定,條件同“2.3”項(xiàng)。取分子量分別為40 000、2 000、500、70、40、10 kDa的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品適量,分別用水制成質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣分析并記錄色譜圖。以各標(biāo)準(zhǔn)品分子量的lg值(x)為橫坐標(biāo)、保留時(shí)間(y)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11],得到回歸方程為y=-0.734 1x+9.625 7(R 2=0.999 0)。分別取黃瓜子3種均一多糖樣品適量,用水溶解制成質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的樣品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖。將各樣品的保留時(shí)間分別代入上述回歸方程中,計(jì)算得CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6的分子量分別為9.614×106、2.024×107、3.343×107 Da。

    2.5 黃瓜子3種均一多糖的結(jié)構(gòu)分析

    2.5.1 紫外吸收特性分析 稱(chēng)取CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6各4 mg,用水制成質(zhì)量濃度均為2 mg/mL的溶液,使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200~400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,檢測(cè)其在260、280 nm波長(zhǎng)處是否含有核酸和蛋白質(zhì)綴合物吸收峰[12]。結(jié)果顯示,CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6在260、280 nm波長(zhǎng)處均無(wú)明顯吸收峰,表明經(jīng)過(guò)分離、純化得到的是3種精制的均一多糖,均不含有核酸和蛋白質(zhì)。黃瓜子均一多糖CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6的紫外吸收光譜圖見(jiàn)圖3。

    2.5.2 紅外吸收特性分析 分別取CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6各適量(1~2 mg)和干燥的溴化鉀粉末50 mg,在瑪瑙研缽中研磨混勻,在壓片機(jī)上制成透明薄片,然后使用傅里葉紅外光譜儀測(cè)定4 000~400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外光譜圖[13]。結(jié)果顯示,CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6有相似的吸收峰。其中,在3 402 cm-1附近寬而強(qiáng)的吸收峰代表有O-H伸縮振動(dòng)和氫鍵的存在;在2 925 cm-1附近的弱吸收峰代表有-CH和C-H伸縮振動(dòng)的存在;在2 364 cm-1附近的吸收峰代表有三鍵或累積雙鍵的存在;在1 659 cm-1附近的吸收峰代表有 -COOH的非對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)的存在;在1 551cm-1處的吸收峰代表有-C-O-伸縮振動(dòng)的存在;在1 412 cm-1附近的吸收峰代表有-COOH中C-O鍵的伸縮振動(dòng)的存在;在1 000~1 200 cm-1附近的吸收峰代表有C-OH側(cè)基和C-O-C糖苷鍵伸縮振動(dòng)的存在;610 cm-1附近的吸收峰為吡喃糖的特征吸收峰。以上結(jié)果表明,CCL-M2、CCL-M3、CLL-M6均是吡喃糖形式[14]。黃瓜子均一多糖CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6的紅外光譜圖見(jiàn)圖4。

    2.6 黃瓜子3種均一多糖的單糖組成分析

    2.6.1 均一多糖的完全酸水解及衍生化處理 分別稱(chēng)取CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6各1 mg,置于不同具塞試管中,加入 4 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL溶解,密封,120 ℃油浴2 h后,用氮吹儀吹干。沉淀物加甲醇200 μL進(jìn)行溶解,再以氮吹儀吹干,反復(fù)以上操作2次。最后將沉淀物再次以甲醇200 μL復(fù)溶,即得完全酸水解液。在完全酸水解溶液中加入氨水0.5 mL,然后再加入 0.5 mol/mL的PMP甲醇溶液0.5 mL進(jìn)行衍生化反應(yīng),封口,70 ℃水浴30 min。在上述提取液中加入甲醇100 μL,用氮吹儀吹干,重復(fù)操作3次。沉淀物再次以甲醇100 μL復(fù)溶,即得酸水解和衍生化處理后的樣品溶液[15]。

    2.6.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化處理及混標(biāo)溶液的制備稱(chēng)取8種單糖(葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、甘露糖)標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg,分別置于8支具塞試管中,每管加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液0.5 mL進(jìn)行衍生化反應(yīng),封口,70 ℃水浴30 min。在上述提取液中加入甲醇100 μL,用氮吹儀吹干溶劑,反復(fù)以上操作3次,即得PMP衍生化單糖標(biāo)準(zhǔn)品。取上述各衍生化單糖標(biāo)準(zhǔn)品1 mg,分別用甲醇1 mL溶解,作為各單糖標(biāo)準(zhǔn)品母液;分別吸取上述單糖標(biāo)準(zhǔn)品母液各100 μL,置于同一具塞試管中,渦旋混勻,即得各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的混標(biāo)溶液[16]。

    2.6.3 UPLC-QTOF/MS分析條件 色譜條件參考文獻(xiàn)[17]設(shè)置:以CORTECS C18 PFP為色譜柱,以20 mmol/L乙酸銨為流動(dòng)相A(462 mg乙酸銨溶解于300 mL 0.05%乙酸中配制而成)、乙腈為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫(0~16 min,80%A;16~20 min,80%A→50%A;20~25 min,50%A→5%A;25~26 min,5%A→80%A;26~28 min,80%A),柱溫為30 ℃,流速為0.4 mL/min,進(jìn)樣量為5 μL。質(zhì)譜分析的離子源為電噴霧電離源(ESI),在正離子模式下采集m/z 400~600范圍內(nèi)的數(shù)據(jù);霧化氣(N2)和脫溶氣體(N2)的流速分別為50、500 L/h,電離源溫度為100 ℃,溶劑溫度為300 ℃,毛細(xì)管電泳電壓為3.0 kV,錐孔電壓為30 V;以亮氨酸腦啡肽(m/z 556.277 1,500 ng/mL)進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正;Lock Spray頻率設(shè)定為10 s,使用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)采集和處理。

    2.6.4 單糖組成分析 分別取“2.6.1”項(xiàng)下經(jīng)酸水解和衍生化處理后的3種均一多糖樣品溶液以及“2.6.2”項(xiàng)下的混標(biāo)溶液,按“2.6.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析,記錄總離子流圖(見(jiàn)圖5)。通過(guò)與混標(biāo)樣品總離子圖進(jìn)行對(duì)比分析可知,CCL-M2由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,其摩爾比為5.1 ∶ 2.6 ∶ 1.7 ∶ 1.4 ∶ 31.6,其中以鼠李糖和阿拉伯糖摩爾含量最高;CCL-M3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,其摩爾比為1.7 ∶ 3.8 ∶ 6.4 ∶ 3.3 ∶ 1.3,其中以葡萄糖摩爾含量最高;CCL-M6由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,其摩爾比為1.3 ∶ 3.0 ∶ 3.2 ∶ 4.4 ∶ 8.9,其中以半乳糖摩爾含量最高。

    2.7 黃瓜子3種均一多糖的體外抗氧化活性研究

    2.7.1 清除DPPH·能力的測(cè)定 分別稱(chēng)取不同質(zhì)量的CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6和VC(陽(yáng)性對(duì)照)溶于水中,制成質(zhì)量濃度均為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL的系列樣品溶液。吸取上述不同質(zhì)量濃度的樣品溶液各50 μL,加入 DPPH溶液50 μL,充分混勻后,在25 ℃下避光反應(yīng)30 min后,采用酶標(biāo)儀于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(A)[18],每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,取平均值。按以下公式計(jì)算DPPH·清除率[19]:DPPH·清除率(%)=[(1-(Ai-Aj)/A0)]×100%;式中,Ai為樣品溶液與DPPH溶液混合后的A值,Aj為樣品溶液的A值,A0為DPPH溶液的A值。通過(guò)軟件Graphphad Prism 7.0計(jì)算各樣品的半數(shù)清除濃度(IC50)。結(jié)果顯示,在所測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi),各樣品對(duì)DPPH·均有一定的清除活性,其強(qiáng)弱順序依次為VC>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6,IC50依次為0.309、1.240、1.489、1.713 mg/mL。

    2.7.2 清除羥基自由基(·OH)能力的測(cè)定 分別按“2.7.1”項(xiàng)下方法制備CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6和VC(陽(yáng)性對(duì)照)不同質(zhì)量濃度的系列樣品溶液。分別吸取各質(zhì)量濃度的樣品溶液5 mL,加入9 mmol/L硫酸亞鐵溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、6 mmol/L過(guò)氧化氫溶液各0.5 mL,于37 ℃反應(yīng)45 min后,采用酶標(biāo)儀于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值。每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。按公式計(jì)算·OH清除率:·OH清除率(%)=(1-(Ai-Aj)/A0)×100%[20]。式中,Ai為加入樣品溶液和硫酸亞鐵、水楊酸-乙醇、過(guò)氧化氫溶液的A值,Aj為不加過(guò)氧化氫溶液的A值,A0為不加樣品溶液的A值。按照“2.7.1”項(xiàng)下方法計(jì)算各樣品對(duì)·OH的IC50。結(jié)果顯示,各樣品對(duì)·OH均有一定的清除活性,其強(qiáng)弱順序依次為VC>CCL-M2>CCL-M6>CCL-M3,IC50依次為0.968、1.032、1.233、1.356 mg/mL。

    2.7.3 清除超氧陰離子自由基(O2-·)能力的測(cè)定 分別“2.7.1”項(xiàng)下方法制備CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6和VC(陽(yáng)性對(duì)照)不同質(zhì)量濃度的系列樣品溶液。分別吸取各質(zhì)量濃度的樣品溶液5 mL,置于10 mL具塞試管中,均加入 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.7 mL,在25 ℃下恒溫振蕩反應(yīng)20 min后,立即加入事先預(yù)熱好的鄰苯三酚溶液0.3 mL,混勻。采用酶標(biāo)儀于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其A值,每隔30 s測(cè)定1次,共測(cè)定5 min,算出每分鐘A值的增量,然后通過(guò)計(jì)算每分鐘A值的增量與時(shí)間的比值得到自氧化速率[21]。每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。按公式計(jì)算O2-·清除率:O2-·清除率(%)=(1-ΔAi/ΔA0)×100%[21]。式中,ΔAi為加入樣品溶液后鄰苯三酚的自氧化速率;ΔA0為鄰苯三酚的自氧化速率。按照“2.7.1”項(xiàng)下方法計(jì)算各樣品對(duì)O2-·的IC50。結(jié)果顯示,各樣品對(duì)O2-·均有一定的清除活性,其強(qiáng)弱順序依次為VC>CCL-M2>CCL-M3>CCL-M6,IC50依次為0.335、0.379、0.812、1.662 mg/mL。

    3 討論

    在本研究中,筆者首次對(duì)CCL進(jìn)行提取,并進(jìn)一步進(jìn)行分離、純化后得到CCL-M2、CCL-M3、CCL-M6等3種均一多糖。結(jié)合紫外、紅外等多種光譜技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定后,發(fā)現(xiàn)3種均一多糖具有相似的化學(xué)鍵和官能團(tuán),并呈現(xiàn)出糖類(lèi)物質(zhì)的典型吸收峰,且均是吡喃糖。其中,CCL-M2由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,其摩爾比為5.1 ∶ 2.6 ∶ 1.7 ∶ 1.4 ∶ 31.6,分子量為9.614×106 Da;CCL-M3由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,其摩爾比為1.7 ∶ 3.8 ∶ 6.4 ∶ 3.3 ∶ 1.3,分子量為2.024×107 Da;CCL-M6亦由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,其摩爾比為1.3 ∶ 3.0 ∶ 3.2 ∶ 4.4 ∶ 8.9,分子量為3.343×107 Da。該結(jié)果表明,CCL-M3和CCL-M6具有相同的單糖組成,但摩爾比不同;CCL-M2與另外2種多糖的單糖組成不同,這可能是因?yàn)镃CL-M2是從水洗脫部位中分離出來(lái)的多糖,而CCL-C3和CCL-C6是從鹽洗脫部位中分離出來(lái)的多糖,故組成存在差異。

    DPPH·、·OH、O2-·是生物體內(nèi)主要的活性氧自由基,其引起的脂質(zhì)過(guò)氧化是導(dǎo)致衰老、心血管疾病和腫瘤發(fā)生的重要原因之一[22]。本研究通過(guò)體外抗氧化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),3種均一多糖對(duì)DPPH·、·OH、O2-·均有一定的清除作用,且在相同的質(zhì)量濃度下,CCL-M2的抗氧化活性要強(qiáng)于其余2個(gè)均一多糖,筆者推測(cè)這可能是由于該多糖的單糖組成不同于其他兩個(gè)多糖所造成的。此外,筆者推測(cè)這種差異還可能與多糖的糖苷鍵類(lèi)型、三螺旋結(jié)構(gòu)等因素有關(guān),故其抗氧化活性的具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

    綜上所述,本研究從黃瓜子中分離得到3種吡喃糖形式的均一多糖均具有一定的體外抗氧化活性,其中以CCL-M2的活性最強(qiáng)。

    參考文獻(xiàn)

    [ 1 ] 祝洪宇,隋瑩,宋寧,等.黃瓜子不同炮制品中化學(xué)成分的對(duì)比[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2014,11(20):106-109.

    [ 2 ] 裴啟洋,佟鑫,賈天柱.黃瓜子不同提取部位對(duì)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的影響[J].中成藥,2014,36(4):680-684.

    [ 3 ] 吳曉毅.黃瓜子化學(xué)成分和瓜蔞含水量、酸值測(cè)定研究[D].北京:中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院,2012.

    [ 4 ] 孫英,楊艷平,劉娜,等.米糠多糖的提取方法和生物活性功能的研究進(jìn)展[J].飼料研究,2020,43(12):147-150.

    [ 5 ] 段麗萍,苗麗坤,孫煒煒,等.油茶多糖的提取及生物活性研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2020,33(11):26-28.

    [ 6 ] 周博宇,楊岳峰,張晶瑩,等.香菇多糖生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué),2020,19(5):792-795.

    [ 7 ] 肖玉煥,韓麗,李浩然,等.靈芝多糖防治中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展[J].中草藥,2020,51(24):6391-6395.

    [ 8 ] 溫文娟,劉珊,黃遠(yuǎn)麗.苯酚硫酸法與蒽酮硫酸法測(cè)定香菇多糖含量比較[J].現(xiàn)代食品,2020,7(21):177-179.

    [ 9 ] 林曉婷,王秋紅,匡海學(xué).柱前衍生化HPLC法測(cè)定麻黃粗多糖中4種單糖的含量[J].化學(xué)工程師,2020,34(11):22-25.

    [10] 黃超,萬(wàn)鳴,陳樹(shù)和,等. HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定茯苓水溶性多糖中多種單糖[J].中國(guó)藥師,2020,23(1):148- 150.

    [11] 鄧昂,馮凱,滕希峰,等.鬼針草提取物中多糖含量及分子量的測(cè)定[J].海峽藥學(xué),2019,31(12):60-62.

    [12] 周偉娥,周學(xué)鋒,王宇陽(yáng),等.中藥多糖成分前處理及檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2020,39(9):1168- 1175.

    [13] 游宇,羅林,陳哲杰,等.生脈飲多糖提取工藝優(yōu)化及對(duì)脾虛模型大鼠腸道功能調(diào)節(jié)作用的研究[J].中國(guó)藥房,2019,30(4):493-498.

    [14] 曹宇欣,李科,秦雪梅,等.基于部分酸水解寡糖特征圖譜及免疫活性評(píng)價(jià)的不同產(chǎn)地黃芪的品質(zhì)比較[J].中草藥,2020,51(21):5598-5606.

    [15] 楊雯,王嘉,王棟,等.多糖中單糖測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J].北方藥學(xué),2020,17(8):181-183.

    [16] 袁琪,文紅梅,張前程,等.苓桂術(shù)甘湯中多糖結(jié)構(gòu)組成及其抗氧化活性考察[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2020,26(16):63-70.

    [17] 李子江,劉慰,吳磊,等.偃松松塔多糖的單糖組成分析及活性研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2020,40(1):37-44.

    [18] 葉明珠,吳嘉彩,游思遠(yuǎn),等.蜜炙對(duì)黃芪分級(jí)醇沉多糖及其抗氧化活性的影響[J].軍事醫(yī)學(xué),2019,43(8):602- 607.

    [19] 吳彩霞,劉瑜新,常星,等.頭狀蓼提取物體外抗氧化活性研究[J].中國(guó)藥房,2009,20(24):1845-1847.

    [20] 劉曉燕,蔣益萍,張嘉寶,等.啤酒花的HPLC指紋圖譜建立及其抗氧化作用譜效關(guān)系研究[J].中國(guó)藥房,2020,31(2):138-143.

    [21] 謝學(xué)明,李熙燦,鐘遠(yuǎn)聲,等.龜板體外抗氧化活性的研究[J].中國(guó)藥房,2006,17(18):1368-1370.

    [22] 戴玥,鄭佳,鄭黎強(qiáng).抗氧化物質(zhì)和自由基產(chǎn)物與腦卒中關(guān)系的研究進(jìn)展[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2019,35(3):489- 491.

    (收稿日期:2020-11-19 修回日期:2021-01-08)

    (編輯:林 靜)

    午夜福利免费观看在线| 在线观看免费视频日本深夜| 很黄的视频免费| 欧美日韩一级在线毛片| 99香蕉大伊视频| 日韩大码丰满熟妇| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 又大又爽又粗| 久久久精品欧美日韩精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | av天堂久久9| 亚洲情色 制服丝袜| 成人18禁在线播放| xxx96com| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| av福利片在线| 51午夜福利影视在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲av电影在线进入| 久久精品国产清高在天天线| 他把我摸到了高潮在线观看| 黄色女人牲交| 十八禁网站免费在线| 深夜精品福利| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久人妻熟女aⅴ| 日本免费a在线| 天堂中文最新版在线下载| 人成视频在线观看免费观看| 51午夜福利影视在线观看| 99riav亚洲国产免费| 99久久国产精品久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一级毛片女人18水好多| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 天堂√8在线中文| 成年人黄色毛片网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 老司机靠b影院| www.999成人在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 热99re8久久精品国产| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品 国内视频| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 一夜夜www| 高清黄色对白视频在线免费看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久性视频一级片| 热99re8久久精品国产| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 成人手机av| 无人区码免费观看不卡| 免费在线观看亚洲国产| 老司机午夜十八禁免费视频| 成人国语在线视频| 精品第一国产精品| 久久青草综合色| 色综合婷婷激情| 色老头精品视频在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜两性在线视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲国产看品久久| 亚洲中文av在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 岛国视频午夜一区免费看| 他把我摸到了高潮在线观看| а√天堂www在线а√下载| 超色免费av| 国产高清国产精品国产三级| 不卡av一区二区三区| 久久久久亚洲av毛片大全| 欧美日本中文国产一区发布| 国产精华一区二区三区| 日韩有码中文字幕| 校园春色视频在线观看| 高清欧美精品videossex| 自线自在国产av| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲avbb在线观看| 美国免费a级毛片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 久久久国产精品麻豆| 后天国语完整版免费观看| 少妇的丰满在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲精品一区av在线观看| 长腿黑丝高跟| 桃红色精品国产亚洲av| 大码成人一级视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 欧美日韩精品网址| 嫩草影视91久久| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 天堂√8在线中文| 91av网站免费观看| 国产精华一区二区三区| 免费在线观看亚洲国产| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 美女福利国产在线| 久热爱精品视频在线9| 成人国产一区最新在线观看| 日本欧美视频一区| 十八禁网站免费在线| 69av精品久久久久久| 高清av免费在线| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 操出白浆在线播放| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲av成人av| 久久久国产成人精品二区 | 一夜夜www| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 最新美女视频免费是黄的| 丝袜美足系列| 亚洲成人免费电影在线观看| 999久久久国产精品视频| 91成人精品电影| 黄片小视频在线播放| 性色av乱码一区二区三区2| 午夜精品久久久久久毛片777| 女人精品久久久久毛片| 欧美大码av| 九色亚洲精品在线播放| 最好的美女福利视频网| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 一个人免费在线观看的高清视频| 午夜福利在线观看吧| bbb黄色大片| 啦啦啦在线免费观看视频4| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产精品国产av在线观看| 99国产综合亚洲精品| 色综合欧美亚洲国产小说| 一区二区三区国产精品乱码| 精品久久久久久成人av| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 一边摸一边抽搐一进一出视频| 欧美日韩黄片免| 黄色女人牲交| 久久久久久大精品| 又大又爽又粗| 久久热在线av| 一本大道久久a久久精品| 黄色 视频免费看| 亚洲片人在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 韩国精品一区二区三区| 88av欧美| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲精品一二三| 操出白浆在线播放| 在线观看66精品国产| 亚洲精品粉嫩美女一区| www.熟女人妻精品国产| 最好的美女福利视频网| 国产成人精品久久二区二区91| 高清av免费在线| 手机成人av网站| 乱人伦中国视频| 十八禁网站免费在线| 两性夫妻黄色片| 最新美女视频免费是黄的| 日韩国内少妇激情av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 一级a爱片免费观看的视频| av国产精品久久久久影院| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲精品一区av在线观看| 岛国视频午夜一区免费看| 国产精品久久视频播放| 亚洲avbb在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 黄色女人牲交| 91av网站免费观看| 精品无人区乱码1区二区| 亚洲在线自拍视频| 午夜激情av网站| 丰满的人妻完整版| 亚洲黑人精品在线| 十分钟在线观看高清视频www| 两个人看的免费小视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲少妇的诱惑av| 91av网站免费观看| 窝窝影院91人妻| 国产一区在线观看成人免费| 99热国产这里只有精品6| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲成人免费av在线播放| 在线观看午夜福利视频| 国产精品久久久久成人av| 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美黄色淫秽网站| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品久久视频播放| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品二区激情视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 三上悠亚av全集在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 黄色a级毛片大全视频| 成人国产一区最新在线观看| 91国产中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 国产av一区在线观看免费| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美乱妇无乱码| 欧美乱色亚洲激情| 天堂√8在线中文| 成人亚洲精品av一区二区 | 午夜免费激情av| 真人做人爱边吃奶动态| 国产野战对白在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 欧美精品一区二区免费开放| 麻豆国产av国片精品| 国产成人av激情在线播放| 亚洲全国av大片| а√天堂www在线а√下载| 久久人妻av系列| 好男人电影高清在线观看| av在线天堂中文字幕 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日韩av久久| 国产黄a三级三级三级人| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产精品1区2区在线观看.| 国产三级黄色录像| 成年女人毛片免费观看观看9| 在线观看www视频免费| 亚洲av电影在线进入| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲情色 制服丝袜| 精品福利观看| 天堂动漫精品| aaaaa片日本免费| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 精品人妻在线不人妻| 久久久国产成人免费| 757午夜福利合集在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 中文字幕人妻熟女乱码| 女性被躁到高潮视频| 久久精品影院6| 91麻豆av在线| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 老司机深夜福利视频在线观看| 黄色女人牲交| 欧美日韩福利视频一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 十八禁网站免费在线| 夜夜夜夜夜久久久久| 女同久久另类99精品国产91| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美中文日本在线观看视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 免费av中文字幕在线| 国产高清视频在线播放一区| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲成a人片在线一区二区| 色婷婷久久久亚洲欧美| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 欧美精品一区二区免费开放| 午夜免费鲁丝| 国产亚洲精品第一综合不卡| 91av网站免费观看| 日本三级黄在线观看| 黄色 视频免费看| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 伦理电影免费视频| 国产精品野战在线观看 | 高清毛片免费观看视频网站 | 超碰97精品在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 极品人妻少妇av视频| 无限看片的www在线观看| 亚洲片人在线观看| 国产精华一区二区三区| 热re99久久国产66热| 丁香欧美五月| 视频在线观看一区二区三区| 久久青草综合色| 亚洲美女黄片视频| 中国美女看黄片| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产男靠女视频免费网站| 69av精品久久久久久| 午夜免费鲁丝| 男女午夜视频在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 久久热在线av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 五月开心婷婷网| 啦啦啦免费观看视频1| 久久久久久久精品吃奶| 高清在线国产一区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲三区欧美一区| 日韩视频一区二区在线观看| 欧美一级毛片孕妇| 激情视频va一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久久国产精品麻豆| 日韩欧美在线二视频| 午夜视频精品福利| 丝袜美腿诱惑在线| 国产片内射在线| 亚洲精华国产精华精| 国产成人免费无遮挡视频| 88av欧美| 一级毛片女人18水好多| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美成人午夜精品| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日本a在线网址| 高清欧美精品videossex| 久久中文字幕一级| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩人妻精品一区2区三区| a级毛片黄视频| 亚洲av熟女| 超碰成人久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲片人在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美黑人精品巨大| 级片在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲 欧美一区二区三区| 一二三四社区在线视频社区8| 91老司机精品| 在线天堂中文资源库| 两个人看的免费小视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品国产乱子伦一区二区三区| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲色图综合在线观看| 色综合站精品国产| 美国免费a级毛片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲av成人一区二区三| 叶爱在线成人免费视频播放| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲五月天丁香| 一本大道久久a久久精品| 国产亚洲精品久久久久5区| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美在线一区亚洲| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲精品一二三| 两个人看的免费小视频| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲在线自拍视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 在线国产一区二区在线| 免费观看人在逋| 超碰成人久久| 亚洲五月天丁香| 又紧又爽又黄一区二区| 午夜精品在线福利| 自线自在国产av| 色婷婷av一区二区三区视频| 免费少妇av软件| 欧美一级毛片孕妇| 国产精品国产av在线观看| 久久影院123| 在线免费观看的www视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 女性生殖器流出的白浆| 无限看片的www在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 欧美激情久久久久久爽电影 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲激情在线av| 人人澡人人妻人| 亚洲精品美女久久av网站| 麻豆一二三区av精品| 嫩草影院精品99| 国产精品久久久久成人av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 午夜两性在线视频| 久99久视频精品免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 夜夜夜夜夜久久久久| 搡老岳熟女国产| 欧美中文综合在线视频| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产成人免费无遮挡视频| 成在线人永久免费视频| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 免费av中文字幕在线| 精品乱码久久久久久99久播| 久久青草综合色| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 91麻豆av在线| 国产一卡二卡三卡精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日韩视频一区二区在线观看| 99国产精品一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 免费看a级黄色片| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 91精品国产国语对白视频| 午夜福利在线免费观看网站| 色老头精品视频在线观看| 又大又爽又粗| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 中出人妻视频一区二区| 18禁国产床啪视频网站| 在线观看免费高清a一片| 久久中文字幕一级| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品综合久久久久久久免费 | 国产片内射在线| 国产精品一区二区三区四区久久 | 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 十八禁网站免费在线| 丝袜美足系列| 免费搜索国产男女视频| 国产成人欧美| 最新在线观看一区二区三区| av免费在线观看网站| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 香蕉丝袜av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲精品国产区一区二| aaaaa片日本免费| 久久狼人影院| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 精品福利观看| 人成视频在线观看免费观看| 欧美性长视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 午夜免费鲁丝| 99精品欧美一区二区三区四区| 91老司机精品| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久人妻av系列| 1024香蕉在线观看| 国产精品永久免费网站| 国产又爽黄色视频| 国产区一区二久久| 国产视频一区二区在线看| 免费人成视频x8x8入口观看| 日韩免费高清中文字幕av| 久久久精品欧美日韩精品| 国产1区2区3区精品| 99精品欧美一区二区三区四区| 搡老乐熟女国产| 黄片小视频在线播放| 夫妻午夜视频| 免费少妇av软件| 久久草成人影院| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 后天国语完整版免费观看| 色哟哟哟哟哟哟| 国产色视频综合| 动漫黄色视频在线观看| 国产成人影院久久av| 女同久久另类99精品国产91| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 男女下面插进去视频免费观看| 超碰成人久久| 久久中文字幕一级| 国产亚洲精品一区二区www| 黑丝袜美女国产一区| 咕卡用的链子| 丝袜人妻中文字幕| 日本五十路高清| 国产片内射在线| 国产免费现黄频在线看| 国产精品98久久久久久宅男小说| bbb黄色大片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日日夜夜操网爽| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲一区高清亚洲精品| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 亚洲五月婷婷丁香| 精品久久久久久,| 9色porny在线观看| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久久国产成人精品二区 | 精品国产国语对白av| 午夜福利在线观看吧| 乱人伦中国视频| www.熟女人妻精品国产| 露出奶头的视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 午夜福利影视在线免费观看| 十八禁人妻一区二区| av天堂在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 深夜精品福利| 老司机亚洲免费影院| 久久香蕉激情| 国产主播在线观看一区二区| 热re99久久国产66热| 1024视频免费在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| av天堂久久9| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 天堂俺去俺来也www色官网| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产亚洲精品一区二区www| 国产色视频综合| 亚洲第一av免费看| 日日爽夜夜爽网站| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 99国产极品粉嫩在线观看| 级片在线观看| 欧美日韩乱码在线| 成人av一区二区三区在线看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久国产精品麻豆| 国产亚洲av高清不卡| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品电影一区二区在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 免费高清在线观看日韩| 激情视频va一区二区三区| 中出人妻视频一区二区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 极品人妻少妇av视频| 免费在线观看完整版高清| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日韩精品免费视频一区二区三区| 丝袜美足系列| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美在线黄色| 看黄色毛片网站| 又大又爽又粗| 美女大奶头视频| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产精品久久视频播放| 亚洲自拍偷在线| 亚洲精品久久午夜乱码| cao死你这个sao货| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 黑人欧美特级aaaaaa片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲专区中文字幕在线| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲av第一区精品v没综合| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 一级a爱视频在线免费观看| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 日本一区二区免费在线视频| 国产一卡二卡三卡精品| 欧美精品啪啪一区二区三区| 美女 人体艺术 gogo| 久久中文看片网| 色老头精品视频在线观看| 精品久久久久久电影网| 亚洲男人天堂网一区| 9热在线视频观看99| 夜夜夜夜夜久久久久| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 最新在线观看一区二区三区| 在线天堂中文资源库| 岛国在线观看网站| 日本一区二区免费在线视频| 黄片小视频在线播放| 丁香六月欧美|