響應(yīng)面法優(yōu)化海南砂仁多糖的提取工藝研究

符玉將，姜熙林，張 帥，吳秋香，邱 敏，屈慧娟，魏 娜

（海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口570100）

多糖是一類天然產(chǎn)物的聚合物，具有與維持生命機(jī)能密切相關(guān)的多種藥理活性，在抗腫瘤、抗感染、降血糖、降血脂、抗病毒以及抗氧化等方面具有獨特的功效［1-6］。多糖因為其具有較多的作用，所以一些多糖已被作為治療疾病的藥物和保健食品來開發(fā)。海南砂仁為姜科豆蔻屬植物海南砂仁（Amo?mum longiligulare T.L.Wu）的干燥成熟果實，主要產(chǎn)于海南澄邁、陵水等縣，是海南特有的品種，已有1 300 多年的使用歷史；砂仁味辛、性溫，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎的功效，黎族地區(qū)人們經(jīng)常用其果實煎湯以治療消化不良［7，8］。近年藥理研究也表明砂仁可以發(fā)揮調(diào)節(jié)胃腸動力、免疫系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛消炎、抗氧化等作用［9-11］。雖然海南砂仁和陽春砂仁同為藥典規(guī)定的正品砂仁，但國內(nèi)外對砂仁的研究卻主要集中在陽春砂仁上，并發(fā)現(xiàn)了陽春砂仁在免疫調(diào)節(jié)及腸道菌群的調(diào)控方面活性顯著［12-15］，而且它還可以不同程度的抑制大腸桿菌、沙門氏菌和葡萄球菌等［16］。但有關(guān)海南砂仁尤其是其多糖的文獻(xiàn)研究卻少有報道，因此本研究采用超聲輔助法提取海南砂仁多糖［17，18］，采用單因素試驗和響應(yīng)面法分析優(yōu)化海南砂仁多糖的提取工藝，目的是為海南砂仁的合理開發(fā)和利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用藥材來自海南瓊中，并在海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院經(jīng)過曾念開教授鑒別確認(rèn)是豆蔻屬植物海南砂仁Amomum longiligulare T.L.Wu 的果實；無水乙醇（分析純），由西隴科學(xué)股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

LYSF-200-B 超高速多功能粉碎機(jī)（長沙市桌成醫(yī)療器械有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；DZF-6020 真空干燥箱（上海申賢恒溫設(shè)備廠）；SY-180 超聲波清洗機(jī)（上海寧商超聲儀器有限公司）；80-3 電動離心機(jī)（金壇區(qū)西城新瑞儀器廠）；ML203 電子天平（MTD（中國上海）。

1.3 試驗方法

1.3.1 海南砂仁的前處理 取海南砂仁干燥成熟果實于超高速多功能粉碎機(jī)中粉碎，所得粉末全部經(jīng)過藥典3 號篩，密封好備用。

1.3.2 海南砂仁多糖的提取 海南砂仁粉末3 g，按15∶1 液料比加純凈水，于180 W 功率，60 ℃下，超聲提取30 min，過濾，再使用純凈水對所得濾渣以同樣的方法提取3 次，合并濾液后離心，取上清液，濃縮至原來體積的1/4，加無水乙醇至醇濃度為80%，4℃下靜置24 h，抽濾，沉淀依次使用無水乙醇和丙酮清洗，真空干燥，稱重［19-21］。計算多糖得率的公式如下：

1.3.3 單因素試驗

1.3.3.1 提取時間對海南砂仁多糖得率的影響 稱取5 份海南砂仁粉末各3 g，將提取次數(shù)、水浴溫度、液 料 比 分 別 固 定 為2 次、60℃和20∶1，然 后 采 用“1.3.2”項下的方法分別探究提取時間（10、20、30、40、50 min）對海南砂仁多糖得率的影響。

1.3.3.2 提取溫度對海南砂仁多糖得率的影響 稱取5 份海南砂仁粉末各3 g，將提取次數(shù)固定為2 次，提取時間設(shè)置為30 min，液料比保持20∶1 不變，然后采用“1.3.2”項下方法分別探究提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對海南砂仁多糖得率的影響。

1.3.3.3 液料比對海南砂仁多糖得率的影響 稱取5 份海南砂仁粉末各3 g，提取次數(shù)被固定為2 次，提取時間設(shè)置為30 min，提取溫度保持60 ℃不變，同理采用“1.3.2”項下方法分別探究液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）對海南砂仁多糖得率的影響。

1.3.3.4 提取次數(shù)對海南砂仁多糖得率的影響 稱取5 份海南砂仁粉末各3 g，使提取時間固定為30 min，提取溫度保持為60 ℃不變，液料比固定為20∶1，同理使用“1.3.2”項下方法分別探究提取次數(shù)（1、2、3、4、5）對海南砂仁多糖的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 基于單因素試驗的結(jié)果，利用Box-Behnken 中心組合實驗設(shè)計的原理，將超聲時間、提取次數(shù)、提取溫度和液料比選取為影響因素，采用Design Expert 10 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，并對試驗所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多次二項回歸擬合［22］。以多糖得率為響應(yīng)值，回歸方程中各變量對該指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，采用F 檢驗判定，概率P（F＞F0）的值越小，則響應(yīng)變量的顯著程度越高［23］。各個影響因素與響應(yīng)值存在的密切關(guān)系能夠很好地被回歸方程所描述，故可利用其去確定影響海南砂仁多糖得率的4 個自變量的顯著性，并根據(jù)實際情況選出最佳的提取工藝條件。然后按照最佳工藝條件平行進(jìn)行3 次實驗，最后將實驗所得結(jié)果與預(yù)測值作比較，以此來驗證回歸方程的可行性和有效性。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對海南砂仁多糖得率的影響 在10～30 min 期間，可以觀察到隨著提取時間的增加，海南砂仁多糖的提取率也隨之升高，并且其峰值出現(xiàn)在30 min，但繼續(xù)延長提取時間反而導(dǎo)致海南砂仁多糖得率出現(xiàn)明顯的下降。推斷其原因，可能是因為超聲時間延長導(dǎo)致某些水溶性多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞［24］。故選擇最佳提取時間為30 min，見圖1A。

2.1.2 提取次數(shù)對海南砂仁多糖得率的影響 由圖可知，多糖得率在提取次數(shù)為4 次時達(dá)到峰值。提取次數(shù)為1～4 次時，海南砂仁的提取率隨提取次數(shù)的增多逐漸升高，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)第5 次時，海南砂仁多糖得率反而下降，故確定提取次數(shù)為4 次，見圖1B。

2.1.3 提取溫度對海南砂仁多糖得率的影響 當(dāng)超聲溫度在40 ℃～70 ℃這個區(qū)間時，多糖得率與溫度呈正相關(guān)關(guān)系，溫度為70 ℃出現(xiàn)峰值。推測其原因可能是在一定范圍內(nèi)溫度的升高使溶液黏稠度降低，利于多糖的溶出，但當(dāng)溫度超過70 ℃時，可能是溫度過高使多糖降解［25］。因此確定提取溫度為70 ℃，見圖1C。

2.1.4 液料比海南砂仁多糖得率的影響 由圖可知，在液料比由10∶1 升高至15∶1 時，多糖得率顯著升高，之后隨液料比不斷增加多糖得率反而逐漸下降?？赡苁且驗楹Ｄ仙叭识嗵窃谒械娜芙舛仁怯邢薜模虼硕嗵堑寐实姆逯党霈F(xiàn)在其溶解度達(dá)到飽和的時候。但隨液料比繼續(xù)增加，可能導(dǎo)致部分多糖重新溶解，造成多糖濃度降低，因此確定液料比為15∶1，見圖1D。

圖1 單因素對多糖得率的影響Fig 1 The influence of single factor on polysaccharide yield

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗因素和水平的確定 響應(yīng)面分析試驗的因素和水平確定是基于單因素試驗的結(jié)果。見表1。

2.2.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 基于單因素試驗的結(jié)果分析，利用Box-Behnken 的中心組合試驗設(shè)計原理，使用Design Expert 10 軟件對提取次數(shù)、提取溫度、提取時間和料液比這4 個因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。見表2。

2.2.3 回歸方程的建立與顯著性檢驗 擬合全變量二次回歸方程的模型的建立是使用Design Ex?pert 10 軟件進(jìn)行多項式回歸分析所得出。所得回歸方程的模型為：

表1 因素及水平編碼表Tab 1 Factor and level coding table

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab 2 Response surface experiment design and results

對該模型進(jìn)行方差分析見表3。通過統(tǒng)計學(xué)分析可知，該模型P 值＜0.01，表明回歸模型極顯著，方差的失擬項P 值為0.077 8，大于0.05 表明模型的失擬項不顯著，實驗誤差小。所選模型的R2=0.943 4，R2Adj=0.886 9，說明該模型與實驗擬合較好，故對海南砂仁多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化是可以使用這個模型。

表3 回歸模型方差分析結(jié)果Tab 3 ANOVA results of regression model

2.2.4 最佳工藝參數(shù)的確定 基于響應(yīng)面分析優(yōu)化所得的結(jié)果，回歸方程模型給出海南砂仁多糖的最佳提取條件為提取時間29.08 min，提取次數(shù)3.68次，提取溫度68.04 ℃，液料比15.47∶1（mL/g），并且其預(yù)測在此工藝條件下海南砂仁多糖得率為10.90%。根據(jù)實際操作情況及生產(chǎn)成本，修改最佳提取工藝條件為：提取時間29 min，提取次數(shù)3 次，提取溫度68℃，液料比15∶1（mL/g）。在此條件下進(jìn)行了3 次平行驗證實驗，并對3 次實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果表明海南砂仁多糖的平均得率為10.69%，與預(yù)測值10.90%較為相近，且相對誤差在可接受的范圍內(nèi)，說明此模型可有效預(yù)測海南砂仁多糖得率。

2.2.5 響應(yīng)曲面及等高線分析結(jié)果 在用超聲輔助海南砂仁多糖的提取流程中，可較為直觀看到提取時間、提取次數(shù)、提取溫度和液料比這4 個因素之間的相互作用影響多糖的得率，并且各因素交互作用的顯著程度也可以下6 圖可直觀反映（圖2A～F）。響應(yīng)面圖中曲線越彎曲表明該因素對多糖得率影響越大，而等高線呈橢圓形說明所選研究因素之間的交互作用顯著，呈圓形時則表示交互作用不顯著［26-28］。

根據(jù)圖2A 可知，隨提取溫度升高或提取次數(shù)增多，同時也伴隨著多糖得率的升高，但當(dāng)多糖得率出現(xiàn)峰值后，再升高提取溫度或增加提取次數(shù)，多糖得率反而降低。由于等高線呈現(xiàn)圓形，表明提取溫度和提取次數(shù)這兩個因素的交互作用不顯著；同時觀察到響應(yīng)曲面坡度較為陡峭，這說明提取溫度和提取次數(shù)這兩個因素對海南砂仁多糖得率的影響較大。

根據(jù)圖2B 可知，在一定液料比下，多糖得率在提取溫度40 ℃～70 ℃的區(qū)間內(nèi)隨溫度的升高而升高，超過這個區(qū)間就趨于平穩(wěn)。同時又可以從等高線趨于橢圓形得出提取溫度和液料比這兩個因素的交互作用顯著；根據(jù)響應(yīng)面兩側(cè)的彎曲程度，位于提取溫度一側(cè)的彎曲程度較陡，所以液料比對海南砂仁多糖得率的影響程度小于提取溫度。依據(jù)圖2C 的等高線形狀及響應(yīng)面兩側(cè)彎曲程度，表明料液比和提取次數(shù)之間存在顯著的相互作用，而且對多糖得率影響而言，提取次數(shù)的影響程度大于液料比。由圖2D 可知，提取時間對多糖得率的影響程度小于提取溫度，并且它們之間存在的交互作用對多糖得率產(chǎn)生顯著影響。

根據(jù)圖2E 可以看出，當(dāng)固定提取時間時，隨提取次數(shù)增加，多糖得率呈先升高后降低的趨勢；而當(dāng)提取次數(shù)一定時，隨提取時間的延長，多糖得率無明顯變化。依據(jù)等高線和響應(yīng)面坡度的形狀，表明提取時間和提取次數(shù)之間存在較為顯著的交互作用，對多糖得率的影響程度，提取時間小于提取次數(shù)。同理可知圖2F 中提取時間和液料比之間存在的交互作用不顯著，而且對多糖得率的影響都比較弱。

圖2 各因素交互作用對多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig 2 Response surface graph of the interaction of various factors on the yield of polysaccharides

3 結(jié)論

本試驗以海南砂仁為原料，采用超聲輔助提取法提取，并使用水提醇沉法制取砂仁多糖，然后結(jié)合分析單因素試驗的結(jié)果，利用Design Expert 10 軟件對提取工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，構(gòu)建了所選的4 個影響因素與海南砂仁多糖得率之間的數(shù)學(xué)模型關(guān)系式，并依據(jù)實際生產(chǎn)情況最終把最佳提取工藝條件確定為：超聲功率180 W，超聲時間29 min，提取次數(shù)3 次，提取溫度68oC，液料比15∶1，該條件下多糖得率實際值為10.69%。該優(yōu)化方案提取時間短，多糖得率高，有效可行，具有較高的實用價值。本文對海南砂仁多糖的開發(fā)及利用研究提供一定的理論基礎(chǔ)，并對海南砂仁將來的應(yīng)用前景具有一定的指導(dǎo)意義。