miR-146a-5p 抑制TRAF6/NF-кB 信號通路影響滋養(yǎng)細胞的炎癥反應

陳芳榮，吳棟才，陳小菊

（海南省人民醫(yī)院，海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院產(chǎn)科，海南 ?？?70311）

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期特有的綜合征，影響3%～5%的孕婦，并以水腫、高血壓和蛋白尿為特征，是造成孕產(chǎn)婦和新生兒死亡的主要原因之一［1］。子癇前期是孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的重要原因。子癇前期本質(zhì)上是異質(zhì)的，其差異表現(xiàn)在疾病時機、臨床癥狀、器官損害的嚴重程度、母嬰結(jié)局和并發(fā)癥上［2］。

PE 的病因和確切的發(fā)病機制尚不完全清楚。有研究表明，妊娠過程中炎癥反應和血管內(nèi)皮細胞損傷等與子癇前期密切相關(guān)［3］。子癇前期與促炎的環(huán)境有關(guān)，其中細胞因子在介質(zhì)中起重要作用［4］。研究已發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者中的炎癥細胞，被激活并分泌大量炎癥細胞因子，例如白細胞介素（Inter?leukin，IL）-1β、IL-6、IL-8 和 腫 瘤 壞 死 因 子-a（Tu?mor necrosis factor-a，TNF-α）［5］。這些細胞因子導致子癇前期的病理特征。子癇前期有關(guān)的炎性反應甚至可能發(fā)生在沒有微生物感染的情況下，被稱為無菌性炎癥［6］。

microRNA（miRNA）是長度為19～25 個核苷酸的短RNA 分子，可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達［7］。目前，許多研究表明，miRNAs 參與了胎盤發(fā)育過程中滋養(yǎng)層細胞的生長、侵襲和新生血管的調(diào)節(jié)［8］。miR-146a 是最早被發(fā)現(xiàn)參與天然免疫的調(diào)控因子，它是一個典型的多功能miRNA，在炎癥、免疫、腫瘤等人體多種生理病理過程中發(fā)揮重要作用［9］。

通過生物信息學預測，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TNF receptorassociated factor 6，TRAF6）是miR-146a-5p 的下游靶基因之一。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-146a-5p 表達后可上調(diào)TRAF6 表達，增強JEG-3 細胞增殖、侵襲及遷移能力［10］。

研究已發(fā)現(xiàn)，miR-146a 可調(diào)控TRAF6 來調(diào)節(jié)NF-κB 的活性在糖尿病相關(guān)微血管并發(fā)癥中發(fā)揮作用［11］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a 在滋養(yǎng)細胞中異常表達［12］，子癇前期組胎盤組織中NF-κB p65陽性率明顯高于正常組［13］。但miR-146a 能否通過調(diào)節(jié)TRAF6/NF-κB 信號通路影響子癇前期的炎癥反應還有待研究。本文以JEG-3 細胞作為研究對象，以脂多糖（LPS）干預JEG-3 細胞制作子癇前期滋養(yǎng)細胞模型，通過檢測各組JEG-3 細胞中的TRAF6 及NF-κB 和表達水平及相關(guān)炎癥因子的變化及其意義，探討miR-146a-5p 在子癇前期中的抗炎作用及作用機制，為深入研究子癇前期發(fā)病機制及臨床靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株和試劑

人絨毛膜癌細胞株JEG-3 來源于國家細胞資源共享平臺；control（對照組）、LPS 組、miR-146a-5p mimic 組、miR-146a-5p inhibitor 組 均 購 自 上 海 吉 凱基因公司，LPS 購自美國Sigma 公司，從細胞或組織中提取總RNA，使用RNA 提取試劑盒購自美國Qiagen 公司，RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Qiagen公司，DMEM 培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司（含100 U/mL 青 霉 素、100 μg/mL 鏈 霉 素 和10% 胎 牛 血清），胎牛血清（FBS）購自美國Gibico 公司。胰蛋白酶購自美國Genview 公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRTPCR 試劑盒購自美國ABI 公司；Trizol、脂質(zhì)體2000（LipofectamineTM2000）、BAC 試劑盒購自美國Invit?rogen 公司。

1.2 通過QPCR 實驗技術(shù)定量檢測基因表達量

按照試劑盒操作說明，使用TRizol 試劑從細胞中提取總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 合成。以cDNA 模板按Real-PCR 試劑盒進行PCR 擴增。反應條件為預變性95℃3 min，變性95℃15 s，退火60℃30 s，延伸60℃30 s，擴增40 個循環(huán)。60℃60 s、95℃15 s 生成熔解曲線。實驗 結(jié) 果 目 的 基 因 的 定 量 分 析 采 用2-△△CT法 計 算［14］。所有引物均由上海生物技術(shù)有限公司設計和合成，引 物 序 列 為（5′-3′）：miR-146a-5p：Forward，5′-GGG GTG AGA ACT GAA TTC CAT-3′and re?verse，5′-CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′；TRAF6：Forward，5′-CTA TTC ACC AGT TAG AGG-3′and reverse，5′-GCT CAC TTA CAT ACA TAC T-3′；NF-κB：Forward，5′-TCA AGA TCT GCC GAC TGA AC -3′and reverse，5-CCT CTT TCT GCA CCT TGT CA-3′；β-actin（hu?man）：Forward，5-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′and reverse，5-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′。

1.3 Western blot 實驗

利用蛋白質(zhì)裂解液（RIPA）將各組細胞裂解，從不同的實驗組細胞定量使用BCA 試劑盒（武漢博斯特武漢生物科技有限公司）。然后，等量的蛋白質(zhì)（30 μg）分離了10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）（武漢博斯特生物技術(shù)有限公司）在100 V 下2 h，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上在100 V 下持續(xù)1 h。然后，用5%脫脂牛奶在1× TBST 緩沖液中，印跡為與抗TRAF6 在4℃下孵育過夜和抗NF-κB 抗體（均來自美國Abcam 公司，1∶1 000 稀釋）以及抗β-actin 抗體（美國Becton，1∶3 000）作為內(nèi)部控制。然后用1X TBST 洗滌，印跡在室溫下孵育HRP 共軛二抗的溫度2 h。洗滌后，用ECL 化學發(fā)光試劑，并用凝膠成像定量蛋白條帶的灰度值使用Image J 軟件［15］。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，2 組間比較采用非配對t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 QPCR 檢測miR146a-5p 在JEG-3 細胞中的相對表達量

JEG-3 細 胞 轉(zhuǎn) 染miR-146a mimic 后，miR-146a-5p 過表達效果顯著增加（P＜0.05），說明轉(zhuǎn)染成功，提示可進行下一步實驗。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染后4組JEG-3細胞中miR-146a-5p表達水平的比較（±s）Tab 1 Comparison of miR-146a-5p expression levels in JEG-3 cells after transfection（±s）

表1 轉(zhuǎn)染后4組JEG-3細胞中miR-146a-5p表達水平的比較（±s）Tab 1 Comparison of miR-146a-5p expression levels in JEG-3 cells after transfection（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別control 組NC 組miR-146a-5p mimic 組miR-146a-5p inhibitor 組miR-146a-5p 1.006±0.118 1.005±0.118 3.120±0.328a 0.229±0.061

2.2 轉(zhuǎn)染后LPS 組JEG-3 細胞中miR-146a-5p 表達水平的比較

經(jīng)脂多糖（LPS）誘導后，對照組與LPS 組miR-146a-5p 表 達 量 分 別 為（0.401±0.019）、（0.790±0.033）。

LPS 誘導的JEG-3 細胞中miR-146a-5p 的表達量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 QPCR 實驗技術(shù)定量檢測各組JEG-3 細胞中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的mRNA 表達水平

與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-146a mimic 后IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的mRNA 表達水平明顯下降（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor 后IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的mRNA 表達水平明顯增加（P＜0.05），LPS 組介于miR-146a mimic 組和miR-146a inhibitor組之間（P＜0.05）。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后5 組JEG-3 細胞中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的mRNA 表達水平的比較（±s）Tab 2 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α in JEG-3 cells after transfection（±s）

表2 轉(zhuǎn)染后5 組JEG-3 細胞中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 的mRNA 表達水平的比較（±s）Tab 2 Comparison of mRNA expression levels of IL-1β，IL-6，IL-8 and TNF-α in JEG-3 cells after transfection（±s）

注：與control 組比較，aP＜0.05；與LPS 組比較，bP＜0.05；與LPS+miR?146a?5p mimic 組比較，cP＜0.05。

組別control 組LPS 組LPS+miR-146a-5p mimic 組LPS+miR-146a-5p inhibitor 組TNF-α 1.116±0.025 9.638±0.513a 2.966±0.009ab 14.853±0.581abc IL-1β 1.015±0.008 11.542±0.407a 3.407±0.009ab 15.840±0.361abc IL-6 1.057±0.003 10.612±0.220a 2.826±0.010ab 14.864±0.590abc IL-8 1.203±0.013 12.526±0.386a 3.248±0.056ab 16.592±0.443abc

2.4 Western Blot 技術(shù)檢測JEG-3 各組細胞樣本中TRAF6、NF-κB 的蛋白水平

轉(zhuǎn)染miR-146a mimic 后JEG-3 細胞內(nèi)TRAF6、NF-κB 蛋白的表達量較對照組下降；轉(zhuǎn)染miR-146a inhibitor 后JEG-3 細 胞 內(nèi)TRAF6、NF-κB 蛋 白 的 表達量較對照組上升。差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1 及表3。

圖1 TRAF6、NF-κB 的WB 表達水平檢測圖Fig 1 Expression levels of TRAF6 and NF-κB

表3 轉(zhuǎn)染后各4 組JEG-3 細胞中TRAF6 和NF-κB 蛋白表達水平的比較（±s）Tab 3 Comparison of TRAF6 and NF-κB protein expression levels in JEG-3 cells after transfection（±s）

表3 轉(zhuǎn)染后各4 組JEG-3 細胞中TRAF6 和NF-κB 蛋白表達水平的比較（±s）Tab 3 Comparison of TRAF6 and NF-κB protein expression levels in JEG-3 cells after transfection（±s）

注：與 對 照 組 比 較，aP＜0.05；與LPS 組 比 較，bP＜0.05；與LPS+miR-146a-5p mimic 組比較，cP＜0.05。

NF-κB 蛋白0.986±0.046 2.779±0.170a 1.550±0.074bc 4.731±0.280abc組別control 組LPS 組LPS+miR-146a-3p mimic 組LPS+miR-146a-3p inhibitor 組TRAF6 蛋白1.034±0.049 3.086±0.046a 1.978±0.091bc 5.174±0.237abc

3 討論

PE 是妊娠期高血壓疾病的常見形式。除了終止妊娠娩出胎兒胎盤外，PE 尚無治愈方法，目前對PE 的治療始終還不能有效改善孕產(chǎn)婦和胎兒的結(jié)局，因此研究該疾病的發(fā)病機制以便可以采取更有效的治療方案是非常必要的［16］。

盡管子癇前期的確切機制尚不清楚，但普遍認為這些并發(fā)癥與異常的母親炎癥反應有關(guān)［17］。異常激活的炎癥導致PE 的發(fā)生［18］。有大量證據(jù)表明氧化應激在PE 的病理生理中起關(guān)鍵作用［19］。氧化應激將活性氧釋放到母體循環(huán)中，從而引起全身性炎癥反應［20］。

異常的炎癥反應導致過度的氧化應激和核因子-κB（NF-κB）信號激活［21］。

患有PE 的婦女表現(xiàn)出較高的炎癥狀態(tài)，并且促炎性細胞因子和趨化因子如TNF-α、IL-6 和IL-1β 在全身及胎盤局部升高［22，23］。PE 胎盤中IL-6 和TNF-α 升高增加了滋養(yǎng)層細胞的凋亡并增加了內(nèi)皮的活化，使內(nèi)皮功能障礙，導致PE 高血壓的出現(xiàn)［24］。

本研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導的JEG 細胞中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 表達較對照組上調(diào)。因為人絨毛膜癌滋養(yǎng)細胞系JEG-3 細胞具有與滋養(yǎng)細胞相似的分子結(jié)構(gòu)和生物學性狀，常用于代替正常滋養(yǎng)細胞，研究其生物學行為［25］。脂多糖是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，是炎癥反應的主要活性成分［26］。Cotechini 等［27］發(fā)現(xiàn)LPS 誘發(fā)的炎癥，導致胎盤亞硝化應激，腎臟結(jié)構(gòu)和功能改變，MAP 升高，引起PE和FGR。在JEG-3 細胞中，LPS 通過上調(diào)環(huán)氧合酶-2（COX-2）和相關(guān)炎癥因子的表達激活了NF-κB信號通路，而JEG-3 細胞的侵襲能力卻被削弱［28］。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS 誘導的JEG-3細胞中miR-146a-5p 的表達量顯著增加，（P＜0.05）。這與Feng 等［29］報道的MALAT1 調(diào)節(jié)miR-146 在保護微血管內(nèi)皮細胞在LPS 誘導的炎性損傷中的作用一致：LPS 暴露后，miR-146a 和miR-146b的表達與對照細胞相比呈劑量依賴性的增加。人工加入miR-146a-5p mimic 增加miR-146a-5p 的表達后，可以抑制LPS 誘導的JEG 細胞中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 表達（P＜0.05）；加入miR-146a-5p inhibitor 降 低miR-146a-5p 表 達，則 加 重LPS 誘導的JEG 細胞中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 表達（P＜0.05）。與LPS+miR-146a-5p mimic 組比較，LPS+miR-146a-5p inhibitor 組的JEG 細胞中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 表達明顯增高（P＜0.05）。

miR-146a-5p 作為一種抗炎調(diào)節(jié)劑，已顯示出在各種免疫細胞中介導其功能的作用［30］。miR-146a 通過靶向TRAF6 在炎癥中發(fā)揮作用也已見報道，F(xiàn)ei 等［31］先前有研究報道，miR-146a 可以通過靶向TNF 受體相關(guān)因子6（TRAF6）和IL-1 受體相關(guān)激酶（IRAK）來控制Toll 樣受體（toll like receptors，TLR）和細胞因子信號傳導，MiR-146a 通過靶向柯薩奇B 病毒感染中的TLR3 和TRAF6 下調(diào)炎癥反應。TRAF6 調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子κB（Nuclear transcrip?tion factor-kappa B，NF-κB）通路已在腫瘤等大腸癌中報道，Zhu 等［32］發(fā)現(xiàn)，TRAF6 在結(jié)直腸癌組織中高表達，其患者生存率低，TRAF6 基因敲除可抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。TRAF6 通過進入細胞核激活TRAF6-NF-κB/AP-1 信號通路，引起大腸癌細胞的生物學行為改變，在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

miR-146a 下調(diào)TRAF6 在肝細胞癌等多種疾病中 發(fā) 揮 重 要 作 用［33］。但miR-146a 調(diào) 控TRAF6/NF-κB 通路能否在子癇前期中發(fā)揮抗炎作用未見報道，本研究中，用miR-146a-5p 模擬物轉(zhuǎn)染后，使miR-146a-5p 過表達，抑制LPS 誘導的TRAF6/NFκB 通路的激活，降低JEG3 細胞中TRAF6 和NF-κB蛋白的表達，并降低促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表達。與先前Zeng 等［34］的研究一致：miR-146a 可通過抑制TLR2/IRAK1/TRAF6/NFκB 和MAPK 途 徑 來 下 調(diào) 痤 瘡 炎 癥 中IL-6、IL-8 和TNF-α 的產(chǎn)生。

筆者在體外實驗對miR-146a 和TRAF6 /NFκB 信號通路在滋養(yǎng)細胞炎性因子產(chǎn)生中的作用進行了研究。與對照組相比，LPS 組中TRAF6 和NF-κB 及細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 表均增加（P＜0.05）。在LPS 組中加入miR-146a-5p mimic 后，TRAF6 和NF-κB 和細胞因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 表達較LPS 組均下降（P＜0.05）；而在LPS 組中加入miR-146a-5p inhibitor 后的目的蛋白TRAF6 和NF-κB 表達及細胞因子較LPS 組上升。結(jié)果表明，miR-146a 過表達可能通過抑制TRAF6 /NF-κB 信號傳導通路而抑制促炎性細胞因子的產(chǎn)生（P＜0.05）。

總之，本研究通過體外實驗表明，miR-146a 通過抑制TRAF6 /NF-κB 信號傳導從而降低滋養(yǎng)細胞促炎性細胞因子的產(chǎn)生。這些發(fā)現(xiàn)證明miR-146a-5p 在子癇前期中的一種新的抗炎機制。此外，近期Yang 等［35］研究還發(fā)現(xiàn)，羊水來源的MSC（AFMSCs）對LPS 誘導的炎性滋養(yǎng)層細胞的抗炎作用，而TRAF6 的預測靶標miR-146a-5p 和miR-548e-5p參與了人類滋養(yǎng)層細胞中氧化應激的調(diào)節(jié)；可能是治療炎癥疾病和妊娠期相關(guān)問題的新靶點。我們將進一步行體內(nèi)實驗進行驗證，為下一步子癇前期的靶向抗炎治療藥物提供理論依據(jù)。