胰高血糖素樣肽1 對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)基因ACAT1、CD36 的表達(dá)及膽固醇代謝的影響

岳云飛，韓永魁，張 奎，申曉彧

（山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院，山西太原030000）

巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝紊亂及蓄積量過多會(huì)導(dǎo)致其泡沫化，泡沫細(xì)胞內(nèi)有著大量的脂肪，是動(dòng)脈斑塊形成的一大因素，而巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝紊亂及蓄積量過多會(huì)導(dǎo)致其泡沫化，對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展起了重要作用［1，2］。已有資料表明，在巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，CD36 可以和氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）相結(jié)合，并在此前提下進(jìn)一步促進(jìn)了單核巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞的過程，是 動(dòng) 脈 粥 樣 硬 化 形 成 的“ 罪 犯 因 子”之 一［3］。ACAT1 對(duì)游離膽固醇具有催化作用，使其轉(zhuǎn)化為膽固醇酯，因此ACAT1 與CD36 在對(duì)膽固醇在細(xì)胞內(nèi)的代謝中同樣起著關(guān)鍵性的作用［4］。且都能夠加劇細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積，加快動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生速率。部分研究發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)GLP-1 的分泌場(chǎng)所主要來源于小腸中的L 細(xì)胞，有2 種生物活性形式，其中之一為GLP-1（7-36a），GLP-1 約80%的活性來自7-36a；另一種活性形式為GLP-1（7-37），其酰胺化產(chǎn)物為GLP-1（7-36a）。有大量研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1對(duì)人體具有多種益處，在對(duì)心血管層面則起著抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的作用，但其分子機(jī)制及通路尚未完全明確［5，6］。在動(dòng)物組織學(xué)層面已得到證實(shí)［7］，GLP-1 類似物能夠減少主動(dòng)脈根部斑塊面積，從而抑制動(dòng)脈粥樣的發(fā)展過程，本研究旨在從細(xì)胞學(xué)角度進(jìn)一步觀察GLP-1 能否降低ACAT1 與CD36 的表達(dá)，并通過檢驗(yàn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量來進(jìn)一步驗(yàn)證GLP-1 在人體內(nèi)能夠通過抑制ACAT1 與CD36的表達(dá)，從而減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇的蓄積，最終起到延緩動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的具體過程，并為延緩動(dòng)脈斑塊的形成提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 藥物

GLP-1（7-36）貨號(hào)：249125，由上海吉爾生化有限公司生產(chǎn)，GLP-1（7-36）抑制劑［（Exendin（9-39）］貨號(hào)：055285，由上海吉爾生化有限公司生產(chǎn)。

1.2 試劑

Raw264.7 小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；ox-LDL（北京協(xié)生生物科技有限公司）；ACAT1 一抗（武漢三鷹生物有限公司）；CD36 一抗（上海拜力生物科技有限公司）；PCR 試劑盒［寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 取小鼠來源的巨噬細(xì)胞，并置于37℃、5%CO2條件下進(jìn)行培育，將其濃度調(diào)整為適宜濃度，接種于6 孔培養(yǎng)板，加用RPMI-1640 培養(yǎng)液，饑餓培育1 h 單核細(xì)胞，再加入50 mg/L 的ox-LDL 將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)為泡沫細(xì)胞，而后加入5 nmol/L 的GLP-1（7-36），然后將細(xì)胞分為4 組：空白對(duì)照組（巨噬細(xì)胞）、實(shí)驗(yàn)組（將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)成的泡沫細(xì)胞）、GLP-1 激動(dòng)組（在泡沫細(xì)胞的基礎(chǔ)上加 入GLP-1）、GLP-1 抑 制 組［GLP-1 及 其 抑 制 劑Exendin（9-39）］。

1.3.2 油紅O 染色 將濃度為50 mg/L 的ox-LDL滴入巨噬細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行干涉處理24 h，60%異丙醇潤洗，每孔各1 次，各孔內(nèi)加入1 mL 油紅O 染色15 min，再用蘇木精染色2 min，干預(yù)后的細(xì)胞泡沫化狀況及形態(tài)用倒置顯微鏡察看。

1.3.3 RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞中的ACAT1 和CD36 mRNA 表達(dá) 按照試劑盒法提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及PCR 擴(kuò)增，首先，在94℃下預(yù)變性3 min，然后再按照變性、退火的順序進(jìn)行40 次循環(huán)。ACAT1 上 游 引 物：5'-ACGTAATGAGCAGAG?GAGCAACAC-3'，下 游 引 物：5'-CGTATCCT?GTTCCTGCCGTGAG-3'；CD36 上 游 引 物：5'-CTTTGAAAGAACTCTTGTGGGG-3'，下 游 引物：5'-GTCTGTGCCATTAATCATGTCG-3'；β肌動(dòng)蛋白（β-actin）上游引物：5'-CGAGCUCAAGC?GAUUUCCUCGUAU-3'，下游引物：5'-AGCTCC?GTCTATGGTGGTGGCTAT-3'；內(nèi)參為β-actin。

1.3.4 Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞中CD36 和ACAT1 蛋白表達(dá) 將巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化成為泡沫細(xì)胞并對(duì)其進(jìn)行相應(yīng)的處理之后，使用裂解液提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白，并用BCA 法對(duì)提取出的蛋白行定量分析。行凝膠電泳、濃縮電泳和分離電泳，再通過濕轉(zhuǎn)法完成轉(zhuǎn)膜，之后用牛奶封閉2～4 h。一抗在溫度為4℃條件下以（1∶1 000）孵育過夜。漂洗3次，二抗（1∶2 000）在室溫下孵育2 h。漂洗3 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行收集，并測(cè)定條帶灰度值，將內(nèi)參基因設(shè)定為β-actin。

1.3.5 高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)各膽固醇水平 將各組干預(yù)后的細(xì)胞，參考膽固醇測(cè)定試劑盒說明書，在酶標(biāo)儀儀器發(fā)射波長為590 nm 處檢測(cè)熒光值，游離膽固醇可以直接被檢測(cè)出；膽固醇的測(cè)量需要在膽固醇酯酶的處理下檢測(cè)；膽固醇酯的測(cè)量則為膽固醇與游離膽固醇的差值，單位為mg/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理分析，計(jì)量資料均以（±s）來進(jìn)行表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 油紅O 染色

用ox-LDL 對(duì)巨噬細(xì)胞行干涉處理后，對(duì)其行油紅O 染色，并在鏡下察看結(jié)果，其形態(tài)飽滿，在細(xì)胞內(nèi)能夠觀察到大量的脂滴顆粒后，可以確信泡沫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞來源）的模型已成功建立。

2.2 各組CD36 和ACAT1 mRNA 表達(dá)比較

與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組的CD36 和ACAT1 mRNA 表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與實(shí)驗(yàn)組比較，GLP-1 激動(dòng)組CD36 和ACAT1 mRNA 表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與GLP-1 激動(dòng)組比較，GLP-1 抑制組CD36 和ACAT1 mRNA 表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組ACAT1 和CD36 mRNA 表達(dá)比較（n=8，±s）Tab 1 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression between the experimental groups and the blank control group（n=8，±s）

表1 各組ACAT1 和CD36 mRNA 表達(dá)比較（n=8，±s）Tab 1 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression between the experimental groups and the blank control group（n=8，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，#P＜0.05；與GLP?1 激動(dòng)組比較，▲P＜0.05。

CD36 mRNA 0.49±0.08 1.02±0.26 *0.52±0.08#0.97±0.14▲組別空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組GLP?1 激動(dòng)組GLP?1 抑制組ACAT1 mRNA 0.53±0.08 1.01±0.17*0.62±0.18 0.92±0.23▲

2.3 各組ACAT1 和CD36 蛋白表達(dá)比較

與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組CD36 和ACAT1蛋白表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與實(shí)驗(yàn)組比較，GLP-1 激動(dòng)組CD36 和ACAT1 蛋白表達(dá)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與GLP-1 激 動(dòng) 組 比 較，GLP-1 抑 制 組CD36 和ACAT1 蛋白表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2 及圖1。

表2 各組ACAT1 和CD36 蛋白表達(dá)比較（n=8，±s）Tab 4 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression level between blank control group and experimental groups（n=8，±s）

表2 各組ACAT1 和CD36 蛋白表達(dá)比較（n=8，±s）Tab 4 Comparison of ACAT1 and CD36 mRNA expression level between blank control group and experimental groups（n=8，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，#P＜0.05；與GLP?1 激動(dòng)組比較，▲P＜0.05。

CD36 蛋白0.55±0.14 1.01±0.21*0.56±0.12#0.99±0.10▲組別空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組GLP?1 激動(dòng)組GLP?1 抑制組ACAT1 蛋白0.55±0.07 0.98±0.09*0.65±0.15#0.91±0.24▲

圖1 各組CD36 、ACAT1 的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Fig 1 The relative expression level of CD36 and ACAT1 proteins in each group

2.4 各組膽固醇水平比較

與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組TC、FC、CE 水平均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與實(shí)驗(yàn)組比較，GLP-1 激動(dòng)組TC、FC、CE 水平均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與GLP-1 激動(dòng)組比較，GLP-1 抑制組TC、TC、CE 水平均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 各組膽固醇表達(dá)比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of cholesterol expression level between experimental group and blank control group（n=8，±s）

表3 各組膽固醇表達(dá)比較（n=8，±s）Tab 3 Comparison of cholesterol expression level between experimental group and blank control group（n=8，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，#P＜0.05；與GLP?1 激動(dòng)組比較，▲P＜0.05。

CE 6.55±1.01 50.87±0.56*10.36±0.65#35.84±0.78▲組別空白對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組GLP?1 激動(dòng)組GLP?1 抑制組TC 20.22±0.99 81.43±0.87*29.21±0.65#59.29±0.84▲FC 13.47±0.02 30.60±0.31*18.99±0.65#23.44±0.06▲

3 討論

細(xì)胞中膽固醇代謝主要包括膽固醇的攝取和酯化以及流出等過程［8］，整個(gè)過程在正常情況下都會(huì)受到嚴(yán)格的調(diào)控，從而維持巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平的正常。若是攝取和酯化過程遭到干擾，導(dǎo)致調(diào)控能力下降，則可引起巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)高膽固醇水平。過高的膽固醇水平會(huì)使巨噬細(xì)胞朝泡沫細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，致使動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程進(jìn)一步加快［9］。在ox-LDL 攝取過程中，當(dāng)CD36 特異性結(jié)合ox-LDL 后，其13-羥基十八碳二烯酸和9-羥基十八碳二烯酸被釋放出，并通過絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶B 以及蛋白激酶C 等路徑使氧化物酶增殖活化受體γ 被激活，被激活后的氧化物酶增殖活化受體γ 再進(jìn)一步與視黃醇受體結(jié)合，開始了CD36 mRNA 的轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而使CD36 表達(dá)上調(diào)，CD36表達(dá)上調(diào)又進(jìn)一步增加對(duì)ox-LDL 的攝取，且此反應(yīng)不受負(fù)反饋的調(diào)節(jié)［10，11］。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，先天性CD36 缺乏的患者，其發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的概率相較正常人而言相對(duì)處于較低水平。另有研究發(fā)現(xiàn)［12］，在高脂血癥患者的體內(nèi)，其外周血中CD36mRNA 的表達(dá)量也會(huì)遠(yuǎn)高于正常人。在膽固醇合成較高會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇大量蓄積，使其代謝失衡，而作為此合成過程的關(guān)鍵酶，ACAT1 則能夠 有 效 的 調(diào) 節(jié) 細(xì) 胞 內(nèi) 的 膽 固 醇 水 平［13，14］。ACAT1與ACAT2 同屬ACAT 的兩個(gè)亞型，前者高表達(dá)于巨噬細(xì)胞內(nèi)，而后者則主要表達(dá)在小腸中［15］，參與脂蛋白加工過程。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ACAT1 在巨噬細(xì)胞內(nèi)可以將游離膽固醇合成為膽固醇酯，當(dāng)血脂較高時(shí)，巨噬細(xì)胞膽固醇酯會(huì)處于高水平狀態(tài)，在此水平下，巨噬細(xì)胞泡沫化發(fā)展進(jìn)程也會(huì)逐步加快。

本研究中實(shí)驗(yàn)組中CD36 、ACAT1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平及TC、FC、CE 的含量均高于空白對(duì)照組，這表明CD36 與ACAT1 在巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)與泡沫化程度呈正相關(guān)。因此是否可以通過藥物作用于CD36、ACAT1 靶點(diǎn)，并降低其表達(dá)，從而減少巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，并起到抑制巨噬細(xì)胞泡沫化成為本實(shí)驗(yàn)的主要研究目的。在本實(shí)驗(yàn)中，GLP-1 激 動(dòng) 組 中CD36 、ACAT1 mRNA 和 蛋 白 的表達(dá)水平及其胞內(nèi)的TC、FC、CE 的含量要低于實(shí)驗(yàn)組，進(jìn)一步證明GLP-1 可通過下調(diào)ACAT1、CD36 表達(dá)來降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平。尤其是對(duì)于患有2 型糖尿病的動(dòng)脈粥樣硬化癥患者，可以更好的降低心血管病風(fēng)險(xiǎn)［16，17］。有研究證實(shí)［18］，GLP-1類似物與其受體相結(jié)合后，可以起到增強(qiáng)胰島素分泌、降低胰島素抵抗等降糖作用，亦可使冠心病病人從中獲益。此外，GLP-1 激動(dòng)劑還能夠起到獨(dú)立于降糖作用以外的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［19］，減少冠脈的斑塊面積。一項(xiàng)Mate 分析表明，GLP-1 受體激動(dòng)劑還能夠降低缺血性腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［20］。

綜上所述，GLP-1 對(duì)于人體多個(gè)系統(tǒng)均有益處，本研究在冠脈粥樣硬化方面發(fā)現(xiàn)，GLP-1 受體激動(dòng)劑可以減少巨噬細(xì)胞內(nèi)CD36、ACAT1 mRNA和蛋白得表達(dá)水平，減少膽固醇的攝取及合成，從而減少巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積，并阻止其泡沫化，達(dá)到抑制動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的目的，降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)。所以，應(yīng)用GLP-1 類似藥物來針對(duì)CD36、ACAT1 這兩個(gè)靶點(diǎn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行預(yù)防具有重要意義。