柳枝稷PvJAZ1基因的克隆、表達(dá)特性與亞細(xì)胞定位

王 燕， 趙曉曉， 王偉偉

(1. 楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 陜西 楊凌 712100； 2. 高邑縣第一中學(xué)， 河北 石家莊 051330；3. 西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

茉莉酸是一種脂蛋白類植物激素，它可以作為信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫信號(hào)應(yīng)激反應(yīng)的多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程[1]。JAZ蛋白(JAZs)屬于TIFY基因家族的JAZ亞家族成員，主要包含ZIM和Jas兩個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域，ZIM結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)保守的TIF [F/Y] XG(TIFY)基序[2-3]；此外，C末端的Jas結(jié)構(gòu)域中還存在著核定位信號(hào)，這使得JAZ蛋白具有核定位的特性[4-5]。JAZ蛋白是JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵調(diào)控因子，當(dāng)植物細(xì)胞含有較低濃度的JA時(shí)，JAZ蛋白與轉(zhuǎn)錄激活因子MYC2使得JA早期應(yīng)答基因受到抑制，植物受到上游信號(hào)刺激后，JA在植物細(xì)胞中合成并積累，高濃度的JA可以解除JAZ蛋白對(duì)轉(zhuǎn)錄激活因子MYC2轉(zhuǎn)錄活性的抑制，從而激活JA早期應(yīng)答基因的表達(dá)[6-8]。

柳枝稷(PanicumvirgatumL.)是多年生禾本科黍?qū)貱4草本植物，它植株高大、根系發(fā)達(dá)，生物質(zhì)產(chǎn)量可達(dá)20 t·hm-2以上，可用于火力發(fā)電、以木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乙醇和生態(tài)環(huán)境保護(hù)等[17-18]。因具有生物質(zhì)產(chǎn)量大、纖維素含量高、抗逆性強(qiáng)、可在邊際土地生長(zhǎng)、水肥需求少、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，柳枝稷被認(rèn)為是一種具有較大發(fā)展?jié)摿Φ哪茉醋魑颷17,19]。由于植物的固著特性，柳枝稷經(jīng)常會(huì)受到干旱、洪澇和鹽堿等非生物脅迫，對(duì)其生物質(zhì)產(chǎn)量造成較大影響[20-21]。JAZ基因的功能研究多集中在擬南芥和水稻中，在柳枝稷中還未見報(bào)道，本研究從柳枝稷中克隆獲得PvJAZ1基因，并對(duì)其分子特征、表達(dá)特性和亞細(xì)胞定位等進(jìn)行了分析，以期為探討柳枝稷生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆性分子調(diào)控機(jī)制解析提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)中PvJAZ1基因的克隆和定量分析使用的是柳枝稷‘Alamo’群體品種，亞細(xì)胞定位使用的是本氏煙草(Nicotianabenthamiana)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥柳枝稷遺傳改良研究團(tuán)隊(duì)提供。

1.2 試驗(yàn)材料的種植和處理

挑選籽粒飽滿、大小均勻的‘Alamo’種子，先后使用70%無水乙醇表面消毒1 min、10%次氯酸鈉溶液滅菌5 min，然后使用無菌水沖洗3～4次，置于4℃條件下過夜，次日將處理過的種子置于帶有濾紙的培養(yǎng)皿上，于27℃(光照16 h/黑暗8 h)光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。待幼苗根長(zhǎng)2 cm左右時(shí)，轉(zhuǎn)移至水培容器內(nèi)繼續(xù)在光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔兩天換一次培養(yǎng)液，水培3周后用于激素與脅迫處理。激素處理是在葉片上噴灑0.01 mM JA(茉莉酸)，0.01 mM IAA(生長(zhǎng)素)，0.01 mM SA(水楊酸)，0.03 mM Eth(乙烯)，0.01 mM GA(赤霉素)和0.01 mM ABA(脫落酸)，在處理0，2，6和12 h后取樣[22]；冷處理是將幼苗轉(zhuǎn)移到4℃的培養(yǎng)箱中，干旱處理是將完整的植株暴露在空氣中，不進(jìn)行水分補(bǔ)給，鹽處理是將幼苗轉(zhuǎn)移到200 mM的NaCl鹽脅迫溶液中，在處理0，4，12和24 h后取樣[23]。取材部位均為葉片，每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，經(jīng)液氮迅速冷凍處理后于-80℃超低溫冰箱中保存。

取大田正常生長(zhǎng)柳枝稷的幼穗用于基因克隆的模板，取大田正常生長(zhǎng)柳枝稷E4期生長(zhǎng)的根、莖、葉、節(jié)、鞘、R3期的小穗和S5期的種子進(jìn)行組織特異性表達(dá)分析[24-25]，每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，液氮迅速冷凍后置于-80℃超低溫冰箱中保存。試驗(yàn)地位于西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)(108°04′26″ E，34°17′49″ N)，取材日期為2018年5-10月。

采用土培法種植本氏煙草于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件為：25℃，14 h光照/10 h黑暗，光照強(qiáng)度為150 μmol·m-2·s-1，相對(duì)濕度為70%。

1.3 基因克隆

通過JGI數(shù)據(jù)庫(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#)進(jìn)行blastn比對(duì)，獲取OsJAZ1(LOC_Os04g55920.1)在柳枝稷中的同源基因?yàn)镻avir.7KG425400.1。利用TRIZOL法提取柳枝稷幼穗的總RNA，以RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit,TaKaRa,Dalian,China)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：2 × Phanta Max Buffer 25 μL，滅菌ddH2O 18 μL，稀釋5倍后的cDNA 3 μL，10 mM的dNTP Mix 1 μL，10 μM的上下游引物各1 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL；PvJAZ1基因的上下游引物序列分別為PvJAZ1-F和PvJAZ1-R(表1)。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72℃徹底延伸7 min，4℃保存。利用瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶(1%瓊脂)，經(jīng)回收純化后連接到克隆載體pClone007(TsingKe Biotech,Beijing,China)，菌液PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序。

1.4 基因的分子特征

利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析基因的開放閱讀框，ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)對(duì)基因編碼蛋白進(jìn)行疏水性分析，SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的信號(hào)肽位點(diǎn)，TMHMM Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，利用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用NCBI-blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)搜索PvJAZ1蛋白的同源序列，在DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，分析PvJAZ1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，利用MEGA5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法，1 000次自舉值)，通過MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)在線軟件對(duì)PvJAZ1蛋白進(jìn)行保守基序的分析(查找數(shù)量為10個(gè)，其它參數(shù)默認(rèn))。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在PvJAZ1基因編碼區(qū)上游2 000 bp序列中檢測(cè)順式作用元件。

1.5 基因的表達(dá)特性

利用TRIZOL試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分別提取激素處理、脅迫處理和組織特異性表達(dá)材料的總RNA，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa,Dalian,China)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用Primer Premier 6.0(PRIMER-e,Auckland,NZ)設(shè)計(jì)基因上下游特異引物qPCR-F和qPCR-R(表1)，內(nèi)參基因?yàn)镋F-1-alpha[26](表1)，按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa,Dalian,China)說明書配置熒光定量PCR體系；使用QuantStudioTM3 Flex Real-Time PCR System(Thermo Fisher，MA，USA)進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)步驟為兩步法：95℃下10 min；95℃下5 s，60℃下30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。利Microsoft Excel 2016(Microsoft Corporation,Redmond,WA,USA)和SigmaPlot 12.5 (Systat Software Inc,Washington,USA)軟件處理數(shù)據(jù)和制作圖表，以2-△△CT法計(jì)算PvJAZ1基因的相對(duì)表達(dá)量[27]，通過IBM SPSS Statistics 23.0(IBM Corporation,Armonk,NY,USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

表1 引物序列

1.6 基因的亞細(xì)胞定位

以載有目的基因的克隆載體pClone007質(zhì)粒為模板，按照ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit說明書設(shè)計(jì)引物進(jìn)行一步克隆(Vazyme Biotech Co.,Ltd,Nanjing,China)，上下游引物分別為GFP-F和GFP-R(表1)，利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)使用BglⅡ與SpelⅠ酶切瞬時(shí)表達(dá)載體pCEGFP-sGFP65T，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與雙酶切產(chǎn)物回收純化后重組并轉(zhuǎn)化大腸桿菌以進(jìn)行PCR檢測(cè)，重組步驟和體系按照ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit說明書進(jìn)行操作，選取陽性菌液送測(cè)序。以構(gòu)建成功的瞬時(shí)表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，選取陽性菌液送測(cè)序，測(cè)序無誤后將對(duì)應(yīng)菌液擴(kuò)繁以備侵染。參照Sparkes等人[28]的方法將農(nóng)桿菌重懸液注射于生長(zhǎng)狀態(tài)較好的煙草葉片，2天后取注射部位葉片于激光共聚焦顯微鏡FV1000(OLYMPUS,Tokyo,Japan)下觀察GFP融合蛋白綠色熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 柳枝稷PvJAZ1基因的克隆和氨基酸序列分析

通過JGI基因組數(shù)據(jù)庫獲取柳枝稷Pavir.7KG425400.1基因的mRNA序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，在750 bp處發(fā)現(xiàn)符合預(yù)期大小的特異條帶如圖1，經(jīng)產(chǎn)物回收、連接克隆載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和菌液PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如圖2所示，Pavir.7KG425400.1克隆全長(zhǎng)為690 bp，包含的ORF序列長(zhǎng)630 bp，通過DNAMAN序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與Pavir.7KG425400.1的CDS序列完全匹配；柳枝稷Pavir.7KG425400.1基因是通過對(duì)水稻OsJAZ1基因進(jìn)行同源比對(duì)獲取的，因而命名為PvJAZ1。

圖1 柳枝稷PvJAZ1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 PvJAZ1的CDS全長(zhǎng)及對(duì)應(yīng)的蛋白序列

2.2 柳枝稷PvJAZ1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過ExPASy ProtParam tool分析PvJAZ1理化性質(zhì)，結(jié)果如下：該蛋白的分子式為C951H575N273O313S11，相對(duì)分子量為22.19 kDa，理論等電點(diǎn)是6.64，含量較高的氨基酸包括Ala(13.4%)、Ser(11.5%)、Glu(9.6%)和Pro(8.6%)。正負(fù)電荷殘基數(shù)均為25，消光系數(shù)為0.207(假定半胱氨酸都是胱氨酸)或0.201(假定半胱氨酸都被還原)，半衰期為30 h，脂肪系數(shù)為72.01；不穩(wěn)定系數(shù)為80.89，屬于不穩(wěn)定蛋白；總平均親水性為—0.429，屬于親水性蛋白。

利用SOPMA軟件預(yù)測(cè)PvJAZ1的二級(jí)結(jié)構(gòu)有4種類型，包括α螺旋(27.75%)、延伸鏈(11.48%)、β轉(zhuǎn)角(6.70%)和無規(guī)則卷曲(54.07%)，具體分布如圖3所示。

2.3 柳枝稷PvJAZ1的序列保守性分析

將PvJAZ1的氨基酸序列提交到NCBI進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，如圖4所示，PvJAZ1含有TIFY基因家族JAZ亞家族保守的TIFY與CCT-2/Jas結(jié)構(gòu)域，表明PvJAZ1屬于JAZ轉(zhuǎn)錄因子家族成員。

圖3 PvJAZ1二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖4 PvJAZ1的保守結(jié)構(gòu)域

將PvJAZ1蛋白序列提交到NCBI-blastp進(jìn)行同源比較，結(jié)果表明PvJAZ1與哈氏黍Panicumhallii(XP_025824963.1)同源性最高，為93.20%；其次是糜子Panicummiliaceum(RLM65417.1)、谷子Setariaitalica(XP_004960252.1)、玉米Zeamays(PWZ38779.1)，同源性分別為87.08%，81.25%，79.82%；與高粱Sorghumbicolor(XP_002447236.1)、二穗短柄草Brachypodiumdistachyon(XP_003580712.1)、彎葉畫眉草Eragrostiscurvula(TVU16401.1)、水稻Oryzasativa(XP_015635689.1)和小麥Triticumaestivum(SPT20417.1)的同源性分別為76.82%，76.33%，72.99%，69.27%和68.25%。對(duì)以上同源蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)分析(圖5)，結(jié)果顯示這些蛋白都具有高度保守的TIFY結(jié)構(gòu)域和CCT-2/Jas結(jié)構(gòu)域。

圖5 柳枝稷PvJAZ1蛋白與其它物種的同源序列比對(duì)

2.4 柳枝稷PvJAZ1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將各物種的同源序列提交至MEGA 5.05，經(jīng)多重序列比對(duì)后采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)，發(fā)現(xiàn)柳枝稷PvJAZ1與糜子親緣關(guān)系最近，其次是哈氏黍、玉米和高粱。模體分析顯示這些物種具有相似的保守結(jié)構(gòu)域，并且它們都包含有保守的TIFY(Motif2)結(jié)構(gòu)域和CCT-2/Jas(Motif1)結(jié)構(gòu)域。

圖6 PvJAZ1蛋白及其同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化和模體分析

2.5 柳枝稷PvJAZ1基因的啟動(dòng)子分析

通過PlantCARE對(duì)PvJAZ1的啟動(dòng)子進(jìn)行順式作用元件分析(表2)，發(fā)現(xiàn)PvJAZ1基因啟動(dòng)子主要包含有光響應(yīng)元件、非生物脅迫響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)元件等。參與光響應(yīng)的元件主要包含有G-box，GT1-motif，AE-box，GATA-motif，TCT-motif和Box 4；參與干旱、低溫和傷害等非生物脅迫相關(guān)元件主要包含有DRE core，MBS，LTR，ARE，W box和WUN-motif；與MeJA，ABA和IAA等激素相關(guān)的順式作用元件主要包含有TGACG-motif，ABRE，CGTCA-motif和TGA-element；參與分生組織特異性激活和種子特異性調(diào)控的順式作用元件包含有CCGTCC-box和RY-element。

2.6 柳枝稷PvJAZ1基因的表達(dá)特性分析

柳枝稷PvJAZ1在不同激素與脅迫處理下的表達(dá)特性如圖7所示(P<0.05)：PvJAZ1在JA處理下的2 h表達(dá)量下降為對(duì)照的0.7倍；在IAA處理下表達(dá)量迅速升高，在12 h處上調(diào)達(dá)到了對(duì)照的3.4倍；SA處理下在12 h達(dá)到最大，為對(duì)照的1.9倍；Eth和GA處理下的表達(dá)量在6 h的表達(dá)量最大，分別為對(duì)照的2和2.2倍；ABA處理下在2 h的表達(dá)量為對(duì)照組的1.4倍，之后下降后升高。PvJAZ1在鹽脅迫下表達(dá)量迅速升高后逐漸降低，在2 h處理下上調(diào)達(dá)到了對(duì)照的31倍；在干旱脅迫下表達(dá)量則先降低后逐漸升高，在24 h處理下的表達(dá)量達(dá)到了對(duì)照的2.8倍；在冷脅迫下表達(dá)量有降低的趨勢(shì)，在24 h下下降為對(duì)照組的0.6倍?？偟膩碚f，PvJAZ1受IAA的誘導(dǎo)而被JA抑制，對(duì)Eth和ABA的響應(yīng)強(qiáng)度相對(duì)較弱；PvJAZ1對(duì)鹽脅迫的誘導(dǎo)響應(yīng)最為迅速且強(qiáng)烈，同時(shí)受到干旱脅迫的誘導(dǎo)，在冷脅迫下則呈現(xiàn)較低的敏感性。

基因在不同的組織、器官和生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期具有不同的表達(dá)模式。本研究選取柳枝稷的根、莖、葉、節(jié)、葉鞘、種子和小穗用于組織特異性表達(dá)分析(P<0.01)，結(jié)果表明PvJAZ1基因在小穗中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于根、莖、葉、節(jié)、鞘和種子，是根含量的739倍；PvJAZ1在根、莖、葉、節(jié)、鞘和種子之間的相對(duì)表達(dá)量不具有顯著差異。

表2 PvJAZ1啟動(dòng)子區(qū)域包含的順式作用元件

圖7 PvJAZ1在多種激素與脅迫處理下的表達(dá)模式

圖8 PvJAZ1的組織特異性表達(dá)模式

2.7 柳枝稷PvJAZ1的亞細(xì)胞定位分析

為了確定柳枝稷PvJAZ1在本氏煙草中的的亞細(xì)胞定位，本研究構(gòu)建了pCEGFP-sGFP65T-PvJAZ1融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101后侵染煙草植株。如圖8所示，pCEGFP-sGFP65T(空載)在煙草表皮細(xì)胞和細(xì)胞核中能檢測(cè)到熒光信號(hào)；pCEGFP-sGFP65T-PvJAZ1在煙草表皮細(xì)胞、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上能檢測(cè)到熒光信號(hào)，證明PvJAZ1在細(xì)胞核和煙草表皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上表達(dá)。

圖9 PvJAZ1的亞細(xì)胞定位

3 討論與結(jié)論

TIFY家族已經(jīng)在擬南芥、水稻和柳枝稷等物種中進(jìn)行了全基因組鑒定和分析[4,29-30]，JAZ屬于TIFY基因家族的JAZ亞家族成員，JAZ基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[31-33]。本研究從柳枝稷中克隆了PvJAZ1基因，PvJAZ1克隆全長(zhǎng)為690 bp，該基因的開放閱讀框全長(zhǎng)為630 bp，編碼209個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)域分析、序列多重比較分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析和模體分析表明PvJAZ1蛋白具有一定的保守性和同源性，這些都可以解釋為它們同為禾本科植物，柳枝稷PvJAZ1基因也可能與它們具有功能相似性。

JAZ蛋白作為樞紐蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫信號(hào)應(yīng)答的調(diào)控過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[34-35]。研究表明水稻OsJAZ9抑制OsbHLH062和OsMYB30的表達(dá)，導(dǎo)致鹽和耐寒性增加[12]；OsJAZ1依賴ABA和JA信號(hào)負(fù)調(diào)控水稻的耐旱性[14]。本研究通過啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)了與光響應(yīng)、非生物脅迫響應(yīng)、激素響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，表明PvJAZ1可能參與多種激素信號(hào)途徑，并參與調(diào)控柳枝稷的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境調(diào)控過程；qRT-PCR結(jié)果表明PvJAZ1在6種激素處理中對(duì)IAA的誘導(dǎo)反應(yīng)最強(qiáng)烈，同時(shí)受到JA明顯的抑制作用，并且在SA，Eth，GA和ABA的處理上有上調(diào)趨勢(shì)，表明PvJAZ1可能參與柳枝稷IAA與JA信號(hào)的調(diào)控；PvJAZ1對(duì)鹽脅迫與干旱脅迫反應(yīng)強(qiáng)烈而對(duì)冷脅迫不敏感，這一結(jié)果同OsJAZ1的脅迫響應(yīng)特性相似[14]。結(jié)合PvJAZ1的啟動(dòng)子分析和表達(dá)特性分析，PvJAZ1可能在柳枝稷JA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及鹽與干旱脅迫防御反應(yīng)中發(fā)揮作用。

OsJAZ1是JA信號(hào)阻遏物，與假定的JA受體OsCOI1b相互作用，在小穗發(fā)育過程中觸發(fā)OsJAZ1的降解；OsJAZ1還與JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的轉(zhuǎn)錄因子OsMYC2相互作用，并抑制OsMYC2在激活OsMADS1中的作用，OsMADS1是對(duì)小穗發(fā)育至關(guān)重要的基因[16]。在組織特異性表達(dá)的分析中發(fā)現(xiàn)柳枝稷PvJAZ1在小穗中表達(dá)量極顯著高于其它組織，結(jié)合以前的研究可以推測(cè)PvJAZ1可能參與調(diào)節(jié)小穗生長(zhǎng)發(fā)育的生命進(jìn)程，在花分生組織中具有重要作用。

有研究表明，OsJAZ9和OsJAZ10蛋白都定位在細(xì)胞核內(nèi)[2,23,36]；OsJAZ1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，但在JA處理?xiàng)l件下定位于細(xì)胞核[14]；Cai等[37]通過雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)OsJAZ1與MYC2在細(xì)胞核中進(jìn)行互作[16]。GsTIFY10,GsTIFY11b,MaTIFY1等TIFY基因家族成員多定位在細(xì)胞核內(nèi)[38-40]。本研究中煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)GFP融合蛋白結(jié)果顯示PvJAZ1定位煙草表皮細(xì)胞、細(xì)胞核和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，這可能是該基因在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行頻繁交流的證據(jù)，其具體行使功能機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

本研究從柳枝稷中克隆獲得PvJAZ1的基因序列，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、表達(dá)特性分析以及亞細(xì)胞定位分析，初步確定PvJAZ1基因在柳枝稷響應(yīng)JA信號(hào)以及鹽和干旱脅迫中發(fā)揮功能，為柳枝稷PvJAZ1基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。