不同乳酸菌組合對苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

王麗學， 韓 靜， 陳龍賓， 余新越， 劉景喜， 馬 毅*， 霍文娟

(1. 天津市農(nóng)業(yè)科學院信息研究所， 天津 300192； 2. 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室， 天津300384； 3. 天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所， 天津 300381； 4. 天津師范大學地理與環(huán)境科學學院， 天津 300387；5. 天津市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所， 天津 300381)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，為世界上廣泛種植的優(yōu)質(zhì)蛋白類牧草，被譽為牧草之王[1]。為避免雨季苜蓿收貯過程中的損失，通常制作青貯以減少養(yǎng)分流失，便于長期保存[2]。優(yōu)質(zhì)苜蓿青貯具有柔軟多汁、適口性好、消化率高等優(yōu)點，但因苜蓿水溶性碳水化合物低且緩沖能值高，在青貯過程中較難形成低pH值狀態(tài)，極易發(fā)生梭菌等有害菌發(fā)酵，進而降低其青貯品質(zhì)[3]。因此，在苜蓿青貯過程中通常需要添加青貯添加劑[2,4]。青貯添加劑按其作用效果可分為發(fā)酵促進劑、發(fā)酵抑制劑和營養(yǎng)性添加劑[5]。乳酸菌屬于發(fā)酵促進劑[3]，可促進乳酸發(fā)酵、抑制雜菌生長、減少養(yǎng)分損失同時提升青貯發(fā)酵品質(zhì)[6]。目前已發(fā)現(xiàn)的乳酸菌主要包括細菌界5門43屬[7]，其中青貯添加劑常用的有乳桿菌屬(Lactobacillus)、片球菌屬(Pediococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)等[8-12]，因乳酸菌特征不同，在實際應用中常搭配使用。

青貯是一個復雜的微生物菌群如乳酸菌、腐敗菌、酵母菌、霉菌、芽孢桿菌等的活動過程[13]，微生物群落組成可直接影響青貯品質(zhì)[14]，甚至進一步影響反芻動物瘤胃微生物群系[15-16]。研究表明，青貯微生物群落與青貯物料自身特征[17-20]、外源添加物質(zhì)[21-22]或添加劑[23-24]、青貯方式[25]及青貯物料所生長的土壤環(huán)境[26]等多種因素有關(guān)。不同微生物添加劑對苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)影響不同，有研究表明，接種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的苜蓿青貯由植物乳桿菌主導整個發(fā)酵過程[24,27]；接種產(chǎn)纖維素酶的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)后，苜蓿青貯腸球菌屬(Enterococcus)豐度增加，而當短小芽孢桿菌與植物乳桿菌混合應用時，苜蓿青貯腸球菌屬豐度降低而乳桿菌屬(Lactobacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)豐度增加[27]；大腸桿菌(EscherichiacoliO157:H7)與植物乳桿菌或布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)的組合處理降低了苜蓿青貯Shannon多樣性指數(shù)，且大腸桿菌與布氏乳桿菌的組合還降低了厚壁菌門(Firmicutes)豐度但增加了變形菌門(Proteobacteria)豐度[28]。由此可見，不同微生物添加劑對苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)的影響存在互作效應，揭示這種互作效應對于苜蓿青貯添加劑開發(fā)具有重要意義。

鑒于此，本研究在對5種乳酸菌對苜蓿青貯營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)影響[29]研究的基礎(chǔ)上，運用高通量測序技術(shù)分析了6種不同乳酸菌組合苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)差異，揭示其對苜蓿青貯營養(yǎng)和發(fā)酵品質(zhì)影響的作用機理，為后續(xù)相關(guān)乳酸菌在苜蓿青貯中的進一步應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用苜蓿為丹農(nóng)種子公司提供的‘北極熊’品種，種植于天津市農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所的濱海鹽堿地綠化土壤改良科研試驗基地。

試驗用乳酸菌：2種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，菌種保藏號分別為ACCC11016(記為L1)和CICC20765(記為L2)；乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici，記為P1)，菌種保藏號為CGMCC 1.4，戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，記為P2)，菌種保藏號為CICC 22737；凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans，記為B)，菌種保藏號為ACCC10229。其中植物乳桿菌CICC20765和戊糖片球菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，其他菌種均由天津市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保藏。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017年5月開展，設(shè)置6個菌種組合處理，分別為L1P1，L1P2，L2P1，L2P2，P1B，P2B。將菌種L1，L2，P1，P2，B分別活化后培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基中，稀釋或濃縮至菌落總數(shù)1.0×109CFU·mL-1；刈割后的苜蓿晾曬24 h，其干物質(zhì)含量為(29.03±0.79)%，切割成2～5 cm的小段，分別按1.5 mL·kg-1的劑量添加等比例混合的乳酸菌組合，以等量蒸餾水替代乳酸菌組合作為對照組(CK)，為確保添加劑與苜蓿均勻混合，將添加物稀釋4倍后均勻噴灑在切割好的苜蓿上，裝入特制聚乙烯塑料袋(25 cm×35 cm)，每袋300 g，每個處理3個重復，用真空封口機同時進行抽氣和封口。室溫避光保存45 d后，在每個樣品的非表層部分用經(jīng)高溫滅菌的鑷子按照五點采樣法采集苜蓿青貯樣品20 g左右，先液氮速凍，再存于-80℃冰箱中，用于細菌群落結(jié)構(gòu)測定與分析。

1.3 細菌群落結(jié)構(gòu)測定與分析

苜蓿青貯樣品細菌群落結(jié)構(gòu)測定由上海派森諾生物科技股份有限公司完成。采用Illumina MiSeq平臺選用長度約為280 bp的細菌16S rRNA基因的高度可變的V3-V4區(qū)進行測序分析，其PCR擴增引物為338F(5′-3′)ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R(5′-3′)GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR反應體系(25 μL)：Q5高保真DNA聚合酶0.25 μL，5×反應緩沖液5 μL，5×高GC緩沖液5 μL，10 mMdNTP0.5 μL，模板DNA1 μL，正向引物(10 μM)和反向引物(10 μM)各1 μL，ddH2O 11.25 μL。PCR程序：98℃30 s；98℃15 s，50℃30 s，25～27個循環(huán)；72℃ 30 s，72℃5 min，于4℃保存。PCR擴增結(jié)果進行2%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片段然后用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對PCR產(chǎn)物在Microplate reader (BioTek，F(xiàn)Lx800)上進行定量，然后按照每個樣品所需的數(shù)據(jù)量進行混樣。利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit構(gòu)建文庫。在Agilent Bioanalyzer機器上用Agilent High Sensitivity DNA Kit對文庫做2100質(zhì)檢，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Promega QuantiFluor上對文庫進行定量，合格的文庫在MiSeq機器上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)進行2×300 bp的雙端測序。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用R軟件對測序數(shù)據(jù)進行分析。首先對所獲序列預處理，評估有效序列質(zhì)量，獲得可用于后續(xù)分析的高質(zhì)量序列；然后對高質(zhì)量序列按照97%的序列相似度劃分可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)；再將豐度值高于0.001%的OTU代表序列與細菌16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫的模板序列進行比對，即可獲取每個OTU所對應的分類學信息。

細菌群落多樣性選擇Chao1，ACE，Shannon和Simpson4個指數(shù)進行分析。Chao1豐富度指數(shù)通過計算群落中只檢測到1次和2次的OTU數(shù)(即“Singleton”和“Doubleton”)，估計群落中實際存在的物種數(shù)；ACE豐富度指數(shù)默認將序列量10以下的OTU都計算在內(nèi)，從而估計群落中實際存在的物種數(shù)；多樣性指數(shù)Shannon和Simpson綜合考慮了群落的豐富度和均勻度，前者對群落豐富度和稀有OTU更敏感，后者對均勻度和群落中的優(yōu)勢OTU更敏感。

文中數(shù)據(jù)均以“均值±標準差”表示。通過IBM SPSS statistics 20.0對不同處理組數(shù)據(jù)進行多重比較，通過SigmaPlot12.0進行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌組合處理對苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

高通量測序結(jié)果顯示，21個苜蓿青貯樣品獲得46 551～63 375個有效序列(合計1 194 775個)，物種累計曲線最終趨于平緩，說明樣本量足以反映群落的豐富度，且所有的OTU均可歸屬至已知分類單元(門、綱、目、科、屬)。

由表1可知，CK，L1P1，L1P2，L2P1，L2P2，P1B和P2B的OTU總數(shù)分別為347，442，449，468，502，383，460個，其中P2B處理與CK的共有OTU數(shù)占比最高(58.26%)，其次是P1B(48.56%)，然后依次是L1P2(39.20%)，L2P2(38.05%)，L2P1(29.35%)，L1P1(20.81%)，說明含凝結(jié)芽孢桿菌的處理與對照組菌群相似性較高。由表2可知，對OTU進行劃分及分類地位鑒定，在門、綱、目、科及種水平下，OTU數(shù)量均表現(xiàn)為L1P2處理顯著高于CK(P<0.05)，其他處理組間差異均不顯著，而在屬水平OTU數(shù)量各處理組間差異均不顯著；對各分類水平的細菌類群數(shù)量進行統(tǒng)計，門、目、科、屬水平細菌類群數(shù)量處理組間差異均不顯著，在綱水平上細菌類群數(shù)量表現(xiàn)為L1P2和L2P1處理顯著高于P2B處理(P<0.05)，其他處理組間差異均不顯著，在種水平上細菌類群數(shù)量表現(xiàn)為CK顯著高于L2P2處理(P<0.05)。

2.1.1門水平細菌組間差異 由苜蓿青貯在門水平相對豐度的組間差異(表3)可知，各處理均以厚壁菌門(Firmicates)相對豐度最高，為69.3%～83.1%，然后是藍細菌門(Cyanobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)，分別為3.9%～26.4%和0.4%～14.6%，而放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、軟壁菌門(Tenericutes)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、綠彎菌門(Chloroflexi)、梭桿菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)相對豐度均小于2%(數(shù)據(jù)未在表3中體現(xiàn))。其中，厚壁菌門相對豐度在組間差異均不顯著；藍細菌門表現(xiàn)為L1P1處理顯著高于CK和P2B處理(P<0.05)；而變形菌門表現(xiàn)為P2B處理和CK顯著高于除P1B外的其他處理(P<0.05)。綜合而言，各處理的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門，乳酸菌處理組的次優(yōu)勢菌門為藍細菌門。

表1 乳酸菌組合處理苜蓿青貯細菌序列(OTU)與對照的對比關(guān)系

表2 苜蓿青貯樣品細菌序列(OTU)劃分及細菌類群分類地位統(tǒng)計

表3 苜蓿青貯細菌群落門水平相對豐度的組間差異

2.1.2屬水平細菌組間差異 分析苜蓿青貯組間相對豐度有顯著差異的目/科/屬共有28個，其中相對豐度大于1%的屬詳見表4。由表4可知，乳桿菌屬(Lactobacillus)在L1P1，L1P2，L2P1，L2P2處理顯著高于CK及P1B和P2B處理(P<0.05)，其他組間差異均不顯著；片球菌屬(Pediococcus)在P2B處理最高，然后依次是P1B和CK，三者差異不顯著，均顯著高于L1P1和L2P1處理(P<0.05)，P2B顯著高于L1P2(P<0.05)，P2B和P1B均顯著高于L2P2(P<0.05)；腸球菌屬(Enterococcus)在P1B處理顯著高于除CK和P2B以外的其他處理(P<0.05)；乳球菌屬(Lactococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)相對豐度均表現(xiàn)為CK顯著高于其他各處理(P<0.05)；棒球菌屬(Corynebacterium)相對豐度則表現(xiàn)為P1B處理顯著高于其他處理(P<0.05)；野豌豆屬(Viciafaba)表現(xiàn)為CK顯著低于除P1B和P2B外的其他處理(P<0.05)。

由此可見，CK的優(yōu)勢菌群為片球菌屬，相對豐度為43.5%，次優(yōu)勢菌群為乳桿菌屬(23.9%)；P1B和P2B處理優(yōu)勢菌群為片球菌數(shù)，相對豐度分別為46.9%，49.7%，次優(yōu)勢菌群是乳桿菌屬(20.2%，15.7%)和野豌豆屬(10.1%，14.6%)；L1P1，L1P2，L2P1，L2P2處理的優(yōu)勢菌則為乳桿菌屬，相對豐度分別為49.2%，43.8%，55.2%，54.2%，次優(yōu)勢菌群是片球菌屬(21.5%，28.1%，16.8%，24.8%)和野豌豆屬(24.9%，23.1%，22.9%，17.5%)。CK，L1P1，L1P2，L2P1，L2P2，P1B，P2B處理優(yōu)勢乳酸菌群(乳桿菌屬+片球菌屬)的相對豐度分別為67.4%，70.7%，71.9%，72.0%，79.0%，67.1%，65.4%。

表4 苜蓿青貯細菌群落屬水平相對豐度的組間差異

2.2 苜蓿青貯樣品細菌群落多樣性

Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)可體現(xiàn)群落豐富度，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)兼顧群落豐富度和均勻度。由表5可知，苜蓿青貯樣品的細菌群落Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)在添加劑處理均較CK有所增加，其中Chao1指數(shù)在L1P2處理顯著高于CK(P<0.05)，ACE指數(shù)在L1P2處理顯著高于P1B處理和CK(P<0.05)；Simpson和Shannon指數(shù)在添加劑處理均較CK有所下降但差異未達顯著水平。

表5 苜蓿青貯樣品細菌多樣性指數(shù)

對不同處理苜蓿青貯樣品的細菌豐度和細菌群落組成進行基于Unifrac距離的NMDS非度量多維尺度分析，結(jié)果表明，除L2P2處理外其他各組內(nèi)差異均相對較小，其中CK獨立分為一組，P2B和P1B處理分為一組，距離CK較近，L1P1，L1P2，L2P1組距離較近，可分為一組(圖1)。

圖1 不同苜蓿青貯樣品微生物豐度的NMDS分析圖

2.3 苜蓿青貯細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性與其營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)系

2.3.1細菌群落結(jié)構(gòu) 由表6可知，厚壁菌門和藍細菌門的相對豐度與苜蓿青貯營養(yǎng)和發(fā)酵指標之間的相關(guān)關(guān)系均未達顯著水平，但變形菌門的相對豐度與苜蓿青貯粗蛋白、非纖維性碳水化合物及乳酸含量極顯著負相關(guān)(P<0.01)，而與中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、灰分、pH值和乙酸含量極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明變形菌門豐度的增加容易造成養(yǎng)分損失，降低乳酸含量增加乙酸含量，不利于纖維分解和pH值的降低，對發(fā)酵品質(zhì)提升不利。

2.3.2細菌群落多樣性 由表7可知，Chao1和ACE指數(shù)與苜蓿青貯非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量極顯著負相關(guān)(P<0.01)，說明苜蓿細菌群落豐富度的增加會導致非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降低；Simpson指數(shù)與各營養(yǎng)指標之間的相關(guān)關(guān)系均未達到顯著水平；Shannon多樣性指數(shù)兼顧細菌群落豐富度和均勻度，對稀有菌群敏感，與粗蛋白含量極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與乳酸含量顯著負相關(guān)(P<0.05)，與中性洗滌纖維和乙酸含量顯著正相關(guān)(P<0.05)，說明苜蓿青貯雜菌數(shù)量增加引起的Shannon多樣性指數(shù)的提高，會導致其蛋白損失，乙酸含量增加，且不利于纖維可消化性的提高及乳酸的積累。

表6 苜蓿青貯樣品細菌群落結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)系

表7 苜蓿青貯樣品細菌群落多樣性與營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)系

3 討論

發(fā)酵過程即微生物群落的演替過程，經(jīng)過最初的有氧發(fā)酵和后續(xù)的厭氧發(fā)酵階段，不良菌群減少，乳酸菌開始主導發(fā)酵過程產(chǎn)生大量乳酸[30]。據(jù)報道，青貯飼料中參與乳酸發(fā)酵的菌群大多數(shù)屬于厚壁菌門[28]，其與變形菌門和藍細菌門共同構(gòu)成了鮮苜蓿的主要附生細菌群落[18,27]，發(fā)酵后厚壁菌門逐漸占優(yōu)勢[13,28]。本研究結(jié)果與之相似，各苜蓿青貯中細菌群落也是以厚壁菌門(Firmicates)為主，其次是藍細菌門(Cyanobacteria)，經(jīng)鑒定主要為Viciafaba屬，推斷其應該是來自于苜蓿青貯的植物樣本部分，第三大類群為變形菌門(Proteobacteria)，僅在對照組和P2B處理相對豐度大于10%。變形菌門部分菌屬可通過脫氨反應生成氨，減緩pH值的降低[23]，同時可與乳酸菌競爭可利用的水溶性碳水化合物[17]，故其相對豐度與苜蓿青貯非纖維性碳水化合物含量極顯著負相關(guān)而與pH值極顯著正相關(guān)(表6)，這與閆晶等[31]研究中認為變形菌門與pH成正相關(guān)的結(jié)果相似。

不同添加劑種類會導致青貯微生物群落結(jié)構(gòu)的差異[30]。乳酸菌是青貯發(fā)酵成功的關(guān)鍵微生物[32]，主要通過增加群落乳酸菌豐度促進乳酸發(fā)酵而實現(xiàn)抑制有害菌繁殖、保存青貯物料的目的[29]。一般而言，在不應用青貯添加劑的情況下，青貯優(yōu)勢菌群主要受植物附生菌影響，而附生菌因氣候、地理位置、管理措施等多方面因素而存在較大的異質(zhì)性[18,27]。Ni等[33]研究報道腸球菌科(Enterococcaceae)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)是鮮苜蓿的主要附生菌群；馬召穩(wěn)等[13]研究報道含水量65%的苜蓿青貯微生物群落在屬水平上主要為海洋桿菌屬(Oceanobacillus)、乳桿菌屬(Lactobacilli)、芽孢桿菌屬(Bacilli)、枝芽孢桿菌屬(Virgibacillus)、乳酸球菌屬(Lactococcus)等；Agarussi等[17]研究報道萎蔫的苜蓿青貯中植物乳桿菌(L.plantarum)占優(yōu)勢，同時也鑒定出乳酸片球菌(P.acidilactici)和戊糖片球菌(P.pentosaceus)等其他乳酸菌。本研究中，對照組未添加任何外源添加劑的情況下，其優(yōu)勢菌為片球菌屬(Pediococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)，說明苜蓿自身附著的細菌中有二者的存在，且推斷在發(fā)酵過程中片球菌的作用大于乳桿菌，故青貯后片球菌屬的相對豐度顯著高于乳桿菌屬。據(jù)報道，在應用乳酸菌劑后，苜蓿青貯優(yōu)勢菌群基本上是添加劑中使用的乳酸菌，如植物乳桿菌、乳酸片球菌、屎腸球菌(E.faecium)等[17,24]。本研究所用的乳酸菌組合中，含凝結(jié)芽孢桿菌處理的優(yōu)勢乳酸菌為片球菌屬，其次是乳桿菌屬，即在片球菌與凝結(jié)芽孢桿菌共同添加的情況下，片球菌屬具有一定的優(yōu)勢，但芽孢桿菌屬相對豐度甚至低于對照組(表4)，推測芽孢桿菌屬包括凝結(jié)芽孢桿菌的繁殖在苜蓿青貯過程中被抑制，可能其不宜應用于苜蓿青貯中；含植物乳桿菌處理的優(yōu)勢乳酸菌均為乳桿菌屬，其次為片球菌屬，說明在植物乳桿菌和片球菌共同添加的情況下，植物乳桿菌的優(yōu)勢明顯。

外源添加劑處理可影響細菌群落多樣性，且不同的多樣性指數(shù)變化趨勢不同[27]。有研究表明，苜蓿經(jīng)γ射線+外源菌劑處理后青貯微生物Chao1和Shannon指數(shù)降低，而僅添加外源菌劑處理與對照差異不顯著[18]；接種植物乳桿菌或布氏乳桿菌可增加苜蓿青貯優(yōu)勢菌屬的豐度從而降低細菌群落多樣性[28]。本研究中，苜蓿青貯菌群豐富度均較對照有所提高，菌群豐富度的增加可能導致更多青貯發(fā)酵底物的消耗，表現(xiàn)在營養(yǎng)成分上就是非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降低，故菌群豐富度指數(shù)與苜蓿青貯非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量極顯著負相關(guān)(表7)；對優(yōu)勢度敏感的菌群Simpson多樣性指數(shù)與苜蓿青貯營養(yǎng)指標的相關(guān)關(guān)系均不顯著(表7)；但對稀有菌群敏感的菌群Shannon多樣性指數(shù)卻與粗蛋白及乳酸含量極顯著或顯著負相關(guān)，與中性洗滌纖維和乙酸含量顯著正相關(guān)(表7)，說明該指數(shù)的增加不利于苜蓿青貯品質(zhì)相關(guān)指標的提升。

乳酸菌是一類能夠利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸的細菌，不同乳酸菌在青貯中的作用不同，有的乳酸菌代謝產(chǎn)物可抑制霉菌生長，有的可以抑制氨的產(chǎn)生等[7]。本研究中，凝結(jié)芽孢桿菌組與對照組距離較近(圖1)，說明其對苜蓿青貯菌群結(jié)構(gòu)的影響較小，甚至在一定程度上降低了苜蓿青貯中乳桿菌屬的相對豐度(表4)；含植物乳桿菌組距離對照組和凝結(jié)芽孢桿菌組均較遠(圖1)，說明植物乳桿菌對苜蓿青貯菌群結(jié)構(gòu)的影響較大，無論哪個含有植物乳桿菌的處理，苜蓿青貯后乳桿菌屬的相對豐度均較對照組顯著增加(表4)。

4 結(jié)論

通過對添加6種乳酸菌組合的苜蓿青貯樣品細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析，各乳酸菌組合的應用均在一定程度上改善了苜蓿青貯的細菌群落結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢乳酸菌群均為厚壁菌門(Firmicates)的乳桿菌屬(Lactobacillus)和片球菌屬(Pediococcus)，二者相對豐度之和為65.4%～79.0%，其中含植物乳桿菌的組合效果優(yōu)于含凝結(jié)芽孢桿菌的組合。