燕麥劣變種子吸脹過(guò)程中線(xiàn)粒體AsA-GSH循環(huán)的生理響應(yīng)

劉 備， 宋玉梅， 孫 銘， 毛培勝

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 草業(yè)科學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100193)

種子在合適的條件下吸水膨脹、胚重新恢復(fù)代謝、胚根突破胚乳和種皮等外圍包被組織的一系列生理形態(tài)變化過(guò)程被稱(chēng)為種子萌發(fā)，這是植物發(fā)育的重要階段，也是決定植物生產(chǎn)力的重要因素[1]。種子吸脹過(guò)程中種胚細(xì)胞內(nèi)發(fā)生著一系列的生理生化變化，比如代謝活動(dòng)的激活、細(xì)胞呼吸的恢復(fù)、線(xiàn)粒體生物發(fā)生、儲(chǔ)藏mRNAs的翻譯和降解、DNA修復(fù)、新mRNAs的轉(zhuǎn)錄和翻譯以及儲(chǔ)藏動(dòng)員的開(kāi)始[2]。由于細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)物在吸脹早期的明顯增加導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)開(kāi)始積累[3-4]。ROS的積累造成與種子活力喪失和老化相關(guān)的損傷[5]。線(xiàn)粒體是產(chǎn)生ROS的主要位點(diǎn)[6-7]。種子吸脹過(guò)程中線(xiàn)粒體內(nèi)ROS積累、清除以及代謝調(diào)控是決定種子萌發(fā)的重要因素，相關(guān)研究也在逐步成為種子老化研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。

在低溫、干旱等非生物脅迫下抗氧化酶的活性與種子萌發(fā)及幼苗的生長(zhǎng)有著直接的關(guān)系[8]。過(guò)氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)等均能清除種子萌發(fā)階段產(chǎn)生的ROS。該結(jié)論已經(jīng)在多種植物種子材料研究中得到證實(shí)。在芍藥(Paeonialactiflora)種子中，SOD和過(guò)氧化氫酶(peroxidase，POD)活性在萌發(fā)期間降低，而CAT活性升高，且SOD較POD，CAT更早發(fā)揮作用[9]。沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)種子則隨聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)脅迫程度的加深，發(fā)芽率和鮮重降低，死亡率、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和相對(duì)電導(dǎo)率升高，萌發(fā)過(guò)程SOD，CAT和POD活性均為先上升后下降[10]。而加速老化使大麥(Hordeumvulgare)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、正常種苗數(shù)、CAT和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)活性明顯降低，酶活性的降低使種子呼吸能力減弱，種子老化與酶活性的下降有著密不可分的聯(lián)系[11]。此外，線(xiàn)粒體通過(guò)抗壞血酸-谷胱甘肽(ascorbate-glutathione，AsA-GSH)循環(huán)系統(tǒng)對(duì)過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)等ROS進(jìn)行清除[12-13]。該循環(huán)包括APX、單脫氫抗壞血酸還原酶(monodehydroascorbatereductase，MDHAR)、脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbatereductase，DHAR)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)，以及AsA/脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate，DHA)，GSH/氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione，GSSG)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原型輔酶Ⅱ)(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(還原型輔酶Ⅰ)(nicotinamide adenine dinucleotide，NADP)三對(duì)獨(dú)立的氧化還原對(duì)[14]。關(guān)于老化種子影響線(xiàn)粒體AsA-GSH循環(huán)的研究正在逐步引起關(guān)注，對(duì)4℃吸脹24 h豌豆(Pisumsativum)種子的研究發(fā)現(xiàn)，PEG處理之后子葉線(xiàn)粒體SOD，APX，MDHAR和GR等抗氧化酶活性升高，H2O2含量降低，種子耐寒性增強(qiáng)[15]。而在大豆(Glycinemax)種子的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著老化程度的加劇，吸脹24 h胚軸線(xiàn)粒體SOD，APX，GR和MDHAR活性降低[16]。同時(shí)種子劣變的內(nèi)部生理變化與其水分狀況密切相關(guān)[17]。在燕麥(AvenasativaL.)種子45℃老化40 d的研究中，與16%含水量的種子相比，4%含水量種子的種胚線(xiàn)粒體SOD，APX，MDHAR，DHAR和GR活性較強(qiáng)[18]。10%含水量燕麥種子隨著老化時(shí)間延長(zhǎng)，APX，DHAR，MDHAR，GR活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)[19]。但目前線(xiàn)粒體AsA-GSH循環(huán)在老化種子吸脹過(guò)程中的作用機(jī)理仍缺少深入研究。

燕麥(AvenaSativa.L)作為一種優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)牧草，隨著我國(guó)草地畜牧業(yè)的快速發(fā)展和奶牛飼養(yǎng)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，其種植面積和市場(chǎng)需求都大幅度增加。正常燕麥種子在一定時(shí)間內(nèi)可以保持活力，但隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，貯存條件及內(nèi)外環(huán)境的脅迫，種子的生理代謝功能和細(xì)胞結(jié)構(gòu)便會(huì)遭受不同程度的損傷，導(dǎo)致不可逆且不可避免的老化[20]。同時(shí)燕麥種子內(nèi)不飽和脂肪酸含量較高，更容易導(dǎo)致老化的發(fā)生，從而降低其利用價(jià)值，故而近年來(lái)對(duì)燕麥劣變種子的研究已受到普遍關(guān)注[21]。本試驗(yàn)針對(duì)不同活力燕麥種子吸脹過(guò)程中發(fā)芽特性變化，探索種胚線(xiàn)粒體AsA-GSH循環(huán)的生理響應(yīng)規(guī)律，以期揭示種胚線(xiàn)粒體AsA-GSH循環(huán)在保持種子活力方面的作用機(jī)制，為燕麥種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存提供理論指導(dǎo)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料燕麥(品種名：‘挑戰(zhàn)者’，‘Challenger’)購(gòu)買(mǎi)于北京陽(yáng)光綠地生態(tài)科技有限公司。種子2018年收獲于加拿大，發(fā)芽率為100%，含水量為8.7%。篩選大小均勻一致的種子保存至-20℃冰箱中，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2 種子含水量測(cè)定與調(diào)整

參照國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)種子檢驗(yàn)規(guī)程測(cè)定種子含水量[22]。樣品盒和蓋從干燥器里取出后置于130℃烘箱中30 min，之后放入干燥器里冷卻30 min，稱(chēng)得的重量記為M1(精確到0.001 g)；稱(chēng)取4.5 g左右的燕麥種子放入樣品盒，稱(chēng)得的重量記為M2(精確到0.001 g)；樣品盒、蓋開(kāi)啟后放入烘箱內(nèi)，溫度達(dá)到130℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)2 h，到達(dá)規(guī)定的時(shí)間后，放入干燥器里冷卻30 min，稱(chēng)得的重量記為M3。設(shè)置2個(gè)重復(fù)，根據(jù)公式算得種子含水量(%)=(M2-M3)/(M2-M1)×100%。

將已知質(zhì)量和初始含水量的種子放入含有飽和硝酸鉀溶液的干燥器中，多次稱(chēng)量種子的質(zhì)量，直至達(dá)到含水量為10%時(shí)的目標(biāo)質(zhì)量，而后立即裝入鋁箔袋中密封，每袋40 g。根據(jù)公式計(jì)算目標(biāo)質(zhì)量(g)=(100-MC0)/(100-MCr)×W0。式中MC0為初始含水量(%)；MCr為需要達(dá)到的含水量(%)，本試驗(yàn)中為10%；W0為種子初始質(zhì)量(g)。

1.3 種子控制劣變及吸脹處理

將10%含水量燕麥種子置于45℃恒溫水浴箱中進(jìn)行控制劣變處理，每隔1～2 d取出一袋，室溫下平衡1 d，測(cè)定其發(fā)芽率。以劣變時(shí)間為橫坐標(biāo)，發(fā)芽率為縱坐標(biāo)制作老化曲線(xiàn)。發(fā)芽率高于90%為高活力種子(HVS)，大于80%而低于90%為中活力種子(MVS)。

選取HVS，MVS和未老化的正常種子(對(duì)照,CK)進(jìn)行吸脹處理，吸脹的前6 h每隔1 h取出種子，吸干表面水分置于培養(yǎng)皿內(nèi)稱(chēng)重，4次重復(fù)。以吸脹時(shí)間為橫坐標(biāo)，種子增重為縱坐標(biāo)繪制吸脹曲線(xiàn)。根據(jù)種子吸脹的階段性變化規(guī)律，分別在快速吸水階段(階段Ⅰ)中段區(qū)域選擇第1個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在緩慢吸水階段(階段Ⅱ)選擇第2個(gè)時(shí)間點(diǎn)，在生長(zhǎng)吸水階段(階段Ⅲ)露白之后曲線(xiàn)開(kāi)始上升的區(qū)域選擇第3個(gè)時(shí)間點(diǎn)。

1.4 粗線(xiàn)粒體的提取

采用Yin等[23]的方法提取線(xiàn)粒體。將100粒燕麥吸脹種子樣品置于冰上剪取種胚。之后將其轉(zhuǎn)入預(yù)冷的研缽中，用2 mL研磨液(pH7.5，0.3 M甘露醇，50 mM焦磷酸四鈉，2 mM EDTA-2 Na，0.5% PVP，0.5% BSA，20 mM半胱氨酸)研磨成勻漿，倒入10 mL離心管中，再用2 mL研磨液沖洗研缽2次，分別倒入10 mL離心管中，一共6 mL。2 000 g離心10 min，取上清；將上清液移至新預(yù)冷的10 mL離心管中，12 000 g離心15 min，倒掉上清液留沉淀；用2 mL加BSA的洗滌液懸浮沉淀，12 000 g離心15 min，倒掉上清液留沉淀；用2 mL未加BSA的洗滌液懸浮沉淀，保存于4℃冰箱中用于后續(xù)生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.5 種子發(fā)芽特性的測(cè)定

參照國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)(ISTA)種子檢驗(yàn)規(guī)程(2019)規(guī)定的發(fā)芽條件[22]，選取50粒大小均勻一致的燕麥種子，擺放于裝有3張濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿(11.5 cm×11.5 cm)中，然后置于溫度20℃，光照時(shí)間8 h，黑暗時(shí)間16 h的光照培養(yǎng)箱(GXZ-380B)中進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)4次重復(fù)。第5 d進(jìn)行初次計(jì)數(shù)，第10 d末次計(jì)數(shù)，最終統(tǒng)計(jì)正常種苗數(shù)，并測(cè)量其根長(zhǎng)(Root length，RL)、苗長(zhǎng)(Shoot length，SL)以及鮮重(Fresh weight，F(xiàn)W)，培養(yǎng)期間每24 h統(tǒng)計(jì)胚根突破2 mm的種子數(shù)。按下列公式計(jì)算發(fā)芽率(Germination percentage，GP)[24]、平均發(fā)芽時(shí)間(Mean germination time，MGT)[25]、發(fā)芽指數(shù)(Germination index，GI)[24]和活力指數(shù)(Vigour index，VI)[24]。GP(%)=(G10/N)×100%；MGT(d)=∑(n×t)/ ∑n；GI=∑(Nt/t)；VI=∑(Nt/t)×FW。式中G10為第10 d所有正常種苗數(shù)；N為供試種子數(shù)；t為發(fā)芽天數(shù)；n為第td胚根突破2 mm的種子數(shù)；Nt為第td的發(fā)芽數(shù)。

1.6 抗氧化酶活性的測(cè)定

將粗制線(xiàn)粒體提取液用于SOD，APX，GR，MDHAR，DHAR以及可溶性蛋白的測(cè)定，具體測(cè)定方法參照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)試劑盒(SOD-2-Y，APX-2-W，GR-2-W，MDHAR-2-W，DHAR-2-W)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 活性氧和抗氧化物質(zhì)的測(cè)定

將粗制線(xiàn)粒體提取液用于MDA，H2O2，AsA，DHA，GSH，GSSH含量測(cè)定，具體測(cè)定方法參照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)試劑盒(MDA-2-Y，H2O2-2-Y，ASA-2A-W，DHA-2-G，GSH-2-W，GSSG-2-W)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)在Microsoft Excel和SPSS 22.0中進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，在GraphPad Prism 7中進(jìn)行作圖。多重比較采用Duncans法進(jìn)行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子老化曲線(xiàn)與吸脹曲線(xiàn)的制作

將含水量為10%燕麥種子在45℃恒溫水浴條件下進(jìn)行控制劣變處理，老化曲線(xiàn)的變化顯示隨著劣變處理時(shí)間的延長(zhǎng)，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)由慢到快的下降規(guī)律(圖1A)。參照種子活力水平確定20 d為高活力(HVS)，27 d為中活力(MVS)。

將HVS，MVS和CK種子進(jìn)行吸脹處理，吸脹曲線(xiàn)變化顯示CK吸脹曲線(xiàn)變化中0～6 h為快速吸水階段，6～14 h為遲滯階段，14 h種子露白，進(jìn)入發(fā)芽階段(圖1B)。HVS，MVS吸脹曲線(xiàn)變化趨勢(shì)與CK類(lèi)似，但吸水進(jìn)程相對(duì)延長(zhǎng)，0～6 h為快速吸水階段，HVS在吸脹6～24 h為遲滯階段，24 h種子露白；MVS在吸脹6～36 h為遲滯階段，36 h種子露白。綜合各樣品種子吸脹變化規(guī)律，確定選取試驗(yàn)樣品的時(shí)間分別為吸脹4 h，12 h和24 h。

圖1 燕麥種子老化和吸脹曲線(xiàn)

2.2 不同活力燕麥種子發(fā)芽特性變化規(guī)律

燕麥種子發(fā)芽特性的測(cè)定結(jié)果顯示，隨著種子活力的下降，發(fā)芽率、平均發(fā)芽時(shí)間、活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)呈顯著變化(圖2B，2C，2D和2E)(P<0.05)。HVS的發(fā)芽率和苗長(zhǎng)與CK無(wú)顯著差異，MVS的發(fā)芽率和苗長(zhǎng)顯著低于CK和HVS(圖2A和2F)(P<0.05)。同時(shí)MVS的活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)和根長(zhǎng)顯著降低(P<0.05)，平均發(fā)芽時(shí)間顯著增加(圖2B，2C，2D和2E)(P<0.05)。

圖2 不同活力水平燕麥種子發(fā)芽特性變化

2.3 不同活力燕麥種子吸脹過(guò)程中種胚線(xiàn)粒體抗氧化酶活性變化

燕麥種胚線(xiàn)粒體抗氧化酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，吸脹4 h時(shí)，GR，APX和MDHAR活性在CK，HVS，MVS內(nèi)無(wú)顯著差異，但HVS和MVS內(nèi)SOD活性顯著高于CK(P<0.05)，且SOD活性在MVS內(nèi)最高(圖3A)；HVS內(nèi)DHAR活性顯著低于HVS(圖3E)(P<0.05)。

吸脹12 h時(shí)，CK，HVS，MVS內(nèi)APX，MDHAR和DHAR活性無(wú)顯著差異，但HVS內(nèi)SOD活性顯著低于CK和MVS(圖3A,P<0.05)；MVS內(nèi)GR活性顯著低于CK和HVS(P<0.05)，且GR活性在CK，HVS內(nèi)無(wú)顯著差異(圖3B)。

吸脹24 h時(shí)，GR，DHAR活性在CK，HVS，MVS內(nèi)無(wú)顯著差異，HVS內(nèi)SOD活性顯著高于CK和MVS(P<0.05)，且MVS內(nèi)SOD活性顯著低于CK(P<0.05)，變化規(guī)律與12 h時(shí)相反(圖3A)；APX活性在MVS內(nèi)顯著高于CK和HVS(P<0.05)，但CK，HVS內(nèi)APX活性無(wú)顯著差異(圖3C)；MDHAR活性在HVS內(nèi)顯著低于CK和MVS(P<0.05)，但在CK，MVS內(nèi)MDHAR活性無(wú)顯著差異(圖3E)。

圖3 燕麥劣變種子吸脹過(guò)程中種胚線(xiàn)粒體抗氧化酶活性變化

隨著吸脹時(shí)間的增加，SOD活性在CK，MVS內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在HVS內(nèi)隨吸脹時(shí)間的增加先下降后上升(圖3A)；APX活性在CK，HVS內(nèi)逐漸下降，但均無(wú)顯著差異，在MVS內(nèi)APX活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)(圖3C)；MDHAR活性在CK，HVS內(nèi)無(wú)顯著差異，在MVS內(nèi)MDHAR活性呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖3D)；DHAR活性在CK內(nèi)顯現(xiàn)先上升后下降，在MVS內(nèi)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在HVS內(nèi)DHAR活性隨吸脹時(shí)間的延長(zhǎng)差異不顯著(圖3E)；GR活性在吸脹期間無(wú)顯著差異(圖3B)。

2.4 不同活力燕麥種子吸脹過(guò)程中種胚線(xiàn)粒體抗氧化物質(zhì)含量變化規(guī)律

燕麥種胚線(xiàn)粒體AsA，DHA，GSH，GSSG含量和AsA/DHA，GSH/GSSG測(cè)定結(jié)果顯示，在吸脹4 h時(shí)，GSSG含量在CK，HVS，MVS間無(wú)顯著差異(圖4E)；AsA含量在MVS內(nèi)顯著低于CK和HVS(P<0.05)，且CK和HVS之間差異不顯著(圖4A)；DHA，GSH含量以及GSH/GSSG在HVS和MVS內(nèi)均顯著下降(P<0.05)，AsA/DHA在MVS內(nèi)顯著高于CK和HVS(P<0.05)，且CK和HVS之間差異不顯著(圖4B，4D，4F和4C)。

吸脹12 h時(shí)，AsA，DHA，GSH含量在HVS內(nèi)顯著低于CK和MVS(P<0.05)，其中MVS內(nèi)AsA含量顯著高于CK(P<0.05)，但DHA含量顯著低于CK(P<0.05)，GSH含量無(wú)顯著差異(圖4A，4B和4D)；GSSG含量在CK內(nèi)顯著低于HVS(P<0.05)，與MVS無(wú)顯著差異，且HVS與MVS之間也無(wú)顯著差異(圖4E)；AsA/DHA在MVS內(nèi)顯著高于CK和HVS(P<0.05)，且CK和HVS之間差異不顯著(圖4C)；GSH/GSSG在HVS內(nèi)顯著低于CK和MVS(P<0.05)，且CK顯著高于MVS(圖4F)(P<0.05)。

吸脹24 h時(shí)，GSSG含量、GSH/GSSG在CK，HVS，MVS間無(wú)顯著差異(圖4E和4F)；HVS內(nèi)AsA，DHA含量顯著低于CK和MVS(P<0.05)，且CK和MVS內(nèi)差異不顯著，但在CK內(nèi)AsA含量顯著高于MVS(P<0.05)，變化規(guī)律與吸脹12 h時(shí)相反，CK處理AsA/DHA顯著高于HVS和MVS(P<0.05)，且HVS和MVS之間差異均不顯著(圖4A-D)。

圖4 燕麥劣變種子吸脹過(guò)程中種胚線(xiàn)粒體抗氧化物質(zhì)含量變化

隨著吸脹時(shí)間的增加，AsA，DHA含量以及AsA/DHA在CK內(nèi)均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，在HVS內(nèi)AsA含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在MVS內(nèi)AsA含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)(圖4A)；在HVS內(nèi)DHA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在MVS內(nèi)DHA含量呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)(圖4B)(P<0.05)；在HVS和MVS內(nèi)AsA/DHA隨吸脹時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖4C)；GSH含量、GSH/GSSG在CK內(nèi)均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖4D和4E)；在HVS內(nèi)GSH含量、GSH/GSSG均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)(圖4D和4F)；在MVS內(nèi)GSH含量和GSH/GSSG均呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)(圖4D和4F)(P<0.05)；GSSG含量在CK內(nèi)無(wú)顯著差異，但在HVS和MVS內(nèi)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)(圖4E)。

2.5 不同活力燕麥種子吸脹過(guò)程中種胚線(xiàn)粒體H2O2和MDA含量變化規(guī)律

燕麥種胚線(xiàn)粒體H2O2和MDA含量測(cè)定結(jié)果顯示，在吸脹4 h時(shí)，H2O2，MDA含量在CK，HVS，MVS間均無(wú)顯著差異(圖5)。吸脹12 h時(shí)，MDA含量在CK，HVS，MVS間無(wú)顯著差異(圖5B)；H2O2含量在CK內(nèi)顯著低于HVS(P<0.05)，與MVS無(wú)顯著差異，HVS與MVS之間也無(wú)顯著差異(圖5A)。吸脹24 h時(shí)，H2O2含量在CK，HVS，MVS間無(wú)顯著差異(圖5A)；MDA含量在CK內(nèi)顯著低于HVS和MVS(P<0.05)，且HVS和MVS之間無(wú)顯著差異(圖5B)。隨著吸脹時(shí)間的增加，在CK和MVS內(nèi)H2O2含量無(wú)顯著差異，HVS內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖5A)；CK內(nèi)MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，HVS內(nèi)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，MVS內(nèi)無(wú)顯著差異(圖5B)。

3 討論

種子活力取決于其抵抗老化造成的有害影響的能力，種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是反映種子活力的重要指標(biāo)[26-27]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著燕麥種子活力的降低，發(fā)芽率、活力指數(shù)、和發(fā)芽指數(shù)均降低，這與糯玉米(Zeamays)在人工老化過(guò)程中種子活力變化的結(jié)果相似[28]；而平均發(fā)芽時(shí)間有所上升，這與鹽酸處理對(duì)白羊草種子活力的影響中的結(jié)果一致[29]。以上結(jié)果說(shuō)明控制劣變處理導(dǎo)致的種子活力下降主要表現(xiàn)為種子發(fā)芽特性和萌發(fā)能力的降低。

圖5 燕麥劣變種子吸脹過(guò)程中種胚線(xiàn)粒體H2O2和MDA含量變化

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在吸脹初期(4 h)，H2O2和MDA含量在CK，HVS，MVS內(nèi)均維持在一個(gè)較低的水平，說(shuō)明此時(shí)劣變處理對(duì)燕麥種胚線(xiàn)粒體的影響不大。高含水量(16%)老化燕麥種子在吸脹4 h時(shí)種胚線(xiàn)粒體內(nèi)MDA含量變化的測(cè)定也得出了同樣的結(jié)論[13]。SOD活性在老化種子內(nèi)顯著提高，APX，GR活性在CK，HVS，MVS內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，MDHAR，DHAR活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，但都沒(méi)有明顯差異，DHA，GSH含量顯著下降，H2O2含量沒(méi)有顯著變化，AsA含量在HVS較CK內(nèi)變化不顯著，AsA含量在MVS內(nèi)顯著下降。這表明此時(shí)老化種胚線(xiàn)粒體SOD具有清除ROS的功能，HVS內(nèi)依賴(lài)AsA的APX起清除H2O2的主要作用，而MVS內(nèi)則是由依賴(lài)MDHAR和DHAR的AsA再生進(jìn)行清除。在緩慢吸水階段(12 h)，H2O2含量在HVS和MVS內(nèi)升高，說(shuō)明此時(shí)線(xiàn)粒體內(nèi)正逐漸產(chǎn)生氧化損傷[30]。另外結(jié)果顯示MDA含量有所下降，但變化不明顯，推測(cè)可能和測(cè)定部位相關(guān)。SOD活性和GSH含量在CK，HVS，MVS內(nèi)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，APX，MDHAR，DHAR活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，AsA和DHA含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，GR活性在HVS和CK內(nèi)變化不明顯，在MVS內(nèi)則顯著下降，GSSG，H2O2含量在HVS，MVS內(nèi)顯著高于CK。這表明緩慢吸水階段HVS內(nèi)種胚線(xiàn)粒體中通過(guò)依賴(lài)AsA的APX和依賴(lài)MDHAR，DHAR的AsA再生部分清除H2O2，MVS內(nèi)種胚線(xiàn)粒體抗氧化系統(tǒng)功能大大減弱，這也可能是造成MDA含量降低的原因。老化燕麥種子吸脹12 h時(shí)種胚內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)變化結(jié)果與本試驗(yàn)中MVS結(jié)果一致[31]。在生長(zhǎng)吸水階段(24 h)，H2O2含量在MVS中達(dá)到最大，同時(shí)MDA含量在HVS和MVS內(nèi)均發(fā)生升高，說(shuō)明此時(shí)線(xiàn)粒體內(nèi)氧化損傷進(jìn)一步加劇。SOD，GR和DHAR活性在CK，HVS，MVS內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，MDHAR活性、AsA和DHA含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，GSSG含量升高；APX活性在MVS內(nèi)顯著高于CK，HVS，GSH含量在HVS,MVS內(nèi)顯著高于CK。SOD，APX，DR等酶的活性敏感于MDA含量的變化[32-33]。這表明生長(zhǎng)吸水階段HVS內(nèi)APX和依賴(lài)MDHAR再生的AsA清除H2O2的作用減弱，主要靠SOD清除ROS；MVS內(nèi)種胚線(xiàn)粒體通過(guò)依賴(lài)AsA的APX和依賴(lài)MDHAR的AsA再生清除H2O2，緩解劣變處理對(duì)其造成的氧化損傷。人工老化大豆種子吸脹24 h時(shí)胚軸線(xiàn)粒體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)的研究結(jié)果與本試驗(yàn)HVS吸脹24 h時(shí)種胚線(xiàn)粒體的變化一致[34]。隨著吸脹時(shí)間的延長(zhǎng)，MVS內(nèi)SOD活性呈先升高后下降的變化趨勢(shì)，GR活性呈先降低后升高的趨勢(shì)，與刺槐(Robiniapseudoacacia)種子中的結(jié)果一致[35]。APX，MDHAR，DHAR活性也呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，AsA/DHA比值下降。這表明在MVS內(nèi)SOD在吸脹前期發(fā)揮清除ROS的作用，而隨著吸脹緩慢吸水階段代謝活動(dòng)的恢復(fù)，抗氧化酶活性逐漸被激活，逐漸起到抵御氧化損傷的作用。

基于本研究的結(jié)果，按照種子樣品內(nèi)抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)的比值，即HVS/CK，MVS/CK，MVS/HVS變化制作了示意圖(圖6)，用以說(shuō)明燕麥老化種子吸脹過(guò)程中AsA-GSH循環(huán)抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)的變化規(guī)律。同CK相比，HVS在種子吸脹初期，H2O2含量下降，SOD活性增強(qiáng)，在AsA-GSH循環(huán)中APX，GR活性增強(qiáng)，MDHAR，DHAR活性減弱，DHA，GSH和GSSH含量下降，AsA含量保持不變；在種子緩慢吸水階段時(shí)，H2O2含量上升，SOD活性減弱，在AsA-GSH循環(huán)中APX，MDHAR和DHAR活性增強(qiáng)，GR活性減弱，DHA和GSSH含量上升，GSH含量下降，AsA含量增加；在種子生長(zhǎng)吸水階段時(shí)，H2O2含量下降，SOD活性增強(qiáng)，GR和DHAR活性增強(qiáng)，APX和MDHAR活性減弱，GSH和GSSH含量上升，DHA和AsA含量下降。以上結(jié)果說(shuō)明，與未老化種子相比，高活力種子在AsA-GSH循環(huán)主要是在緩慢吸水階段發(fā)揮了清除H2O2的作用。同CK相比，MVS在種子吸脹吸水階段時(shí)，H2O2含量上升，SOD活性增強(qiáng)，在AsA-GSH循環(huán)中MDHAR和DHAR活性增強(qiáng)，APX和GR活性減弱，DHA和GSH含量下降，GSSH含量上升，AsA含量下降；在種子緩慢吸水階段時(shí)，H2O2含量上升，SOD活性增強(qiáng)，在AsA-GSH循環(huán)中APX，GR，MDHAR和DHAR活性減弱，DHA含量下降，GSSH含量上升，GSH含量不變，AsA含量上升；在種子生長(zhǎng)吸水階段時(shí)，H2O2含量上升，SOD活性減弱，在AsA-GSH循環(huán)中APX，GR，和DHAR活性減弱，MDHAR活性不變，DHA，GSH和GSSH含量上升，AsA含量下降。以上結(jié)果說(shuō)明，與未老化種子相比，中活力種子在快速和緩慢吸水階段AsA-GSH循環(huán)發(fā)揮了部分清除H2O2的作用，在生長(zhǎng)吸水階段主要是AsA-GSH循環(huán)發(fā)揮清除H2O2的作用。同HVS相比，MVS在種子吸脹吸水階段時(shí)，劣變種胚內(nèi)H2O2含量增加，相應(yīng)地SOD活性增強(qiáng)，但在AsA-GSH循環(huán)中APX，GR活性下降，僅MDHAR，DHAR活性增強(qiáng)，盡管AsA含量增加，也無(wú)法通過(guò)AsA-GSH循環(huán)來(lái)清除H2O2的增加。種子緩慢吸水階段時(shí)，老化種胚內(nèi)H2O2含量下降，相應(yīng)地SOD活性仍然在增強(qiáng)，但在AsA-GSH循環(huán)中APX，GR，MDHAR，DHAR活性均下降，此時(shí)AsA-GSH循環(huán)處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)。種子生長(zhǎng)吸水階段時(shí)進(jìn)入胚根伸長(zhǎng)生長(zhǎng)階段后，劣變種胚內(nèi)H2O2含量又增加，SOD活性卻下降，但在AsA-GSH循環(huán)中APX，MDHAR活性增強(qiáng)，DHAR，GR活性下降，AsA含量增加，通過(guò)AsA-GSH循環(huán)來(lái)清除H2O2的增加。以上結(jié)果說(shuō)明，與高活力種子相比，中活力種子只有在進(jìn)入生長(zhǎng)吸水階段后AsA-GSH循環(huán)才發(fā)揮清除H2O2的作用，另外中活力種子H2O2含量在吸脹4 h和24 h的增加是導(dǎo)致種子萌發(fā)抑制的重要因素。

圖6 老化種子吸脹過(guò)程中AsA-GSH循環(huán)抗氧化酶和抗氧化物的變化示意圖

4 結(jié)論

隨著燕麥種子活力的下降，種子的發(fā)芽率、活力指數(shù)、發(fā)芽指數(shù)、根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)下降以及平均發(fā)芽時(shí)間增加。在劣變燕麥種子吸脹的不同階段，AsA-GSH循環(huán)抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)的變化不同。不同活力水平老化種子AsA-GSH循環(huán)抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，與未老化種子(CK)和高活力種子(HVS)相比，中活力種子(MVS)線(xiàn)粒體AsA-GSH循環(huán)只有進(jìn)入生長(zhǎng)吸水階段才發(fā)揮清除H2O2的作用，H2O2含量在吸脹4 h和24 h的增加是導(dǎo)致種子萌發(fā)抑制的重要因素。因此，燕麥種子劣變主要是通過(guò)降低AsA-GSH循環(huán)中APX，GR活性以及GSH/GSSG比值，使種胚線(xiàn)粒體內(nèi)ROS積累，產(chǎn)生氧化損傷，繼而抑制種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。