微小RNA-195與急性胰腺炎進(jìn)展的相關(guān)性研究

安超 朱代生 張鵬飛 張麗娜 金珂

（漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河南 漯河 462300）

急性胰腺炎（Acute pancreatitis，AP）是臨床上最常見(jiàn)的急性腹部疾病之一，通常由膽石癥、酒精中毒和高脂血癥引起[1]。盡管國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)AP的發(fā)病機(jī)制已有一些共識(shí)，但仍然缺乏有效的診斷和治療策略。在重癥急性胰腺炎病例中，炎性細(xì)胞因子的釋放可引起全身性炎性反應(yīng)綜合征，并與器官功能障礙有關(guān)，其中多器官功能衰竭是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，在急性胰腺炎患者中發(fā)生率占10%至15%。急性胰腺炎的初始病理變化是胰腺內(nèi)胰蛋白酶的失控導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞損傷，誘發(fā)炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子的積累[2]。

MicroRNA（miRNA）是一類短的非編碼RNA，對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、壞死和炎癥起著關(guān)鍵作用。研究表明，循環(huán)中miRNA表達(dá)水平與胰腺腺泡細(xì)胞損傷和預(yù)后密切相關(guān)[3]。miR-195位于染色體17p13.1上，是microRNA-15/16/195/424/497家族的一員，能調(diào)節(jié)增殖、凋亡和炎癥等各種病理生理過(guò)程[4]。而對(duì)于miR-195在急性胰腺炎的發(fā)生、進(jìn)展中的作用研究甚少，本研究重點(diǎn)分析miR-195與急性胰腺炎進(jìn)展相關(guān)性，為急性胰腺炎的發(fā)生、進(jìn)展提供新的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2019年12月在我院接受治療的62例AP患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18至65歲之間；符合AP診斷標(biāo)準(zhǔn)。AP診斷標(biāo)準(zhǔn)：急性突然持續(xù)性上腹痛、腹脹，腹部觸診壓痛陽(yáng)性；經(jīng)上腹部CT檢查呈現(xiàn)AP影像學(xué)改變。排除標(biāo)準(zhǔn)：癌癥患者；孕婦；精神病患者或拒絕合作的患者；放棄治療，轉(zhuǎn)院或死亡的患者。62例AP患者依據(jù)患者的嚴(yán)重程度分為兩組，輕度患者30例（輕度組），其中男16例，女14例；年齡26-78歲，平均年齡45.26±13.22歲；中重度患者32例（中/重度組），其中男18例，女14例；年齡26-77歲，平均年齡45.26±13.22歲。選擇20例同期進(jìn)行體檢的健康志愿者作為對(duì)照組，其中男12例，女8例，年齡25-77歲，平均年齡45.57±13.14歲；三組成員的性別、年齡等一般資料無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。本研究在患者入院后均告知并簽署知情同意書，并經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 急性胰腺炎CT分級(jí)

A級(jí)：胰腺邊界清晰，血淀粉酶輕度升高；B級(jí)：胰腺頭、體、尾部局限性腫大或胰腺體積彌漫性腫大，血尿淀粉酶中度升高；C級(jí)：胰腺實(shí)質(zhì)形態(tài)及密度異常伴有胰腺周圍脂肪炎性改變，血尿淀粉酶明顯升高；D級(jí)：胰腺周圍多個(gè)間隙出現(xiàn)積液，血尿淀粉酶趨向下降；E級(jí)：胰腺周圍多個(gè)間隙中2個(gè)或2個(gè)胰腺間隙積液，胰腺實(shí)質(zhì)或胰周膿腫形成，血尿淀粉酶下降明顯。其中A-C級(jí)為輕度胰腺炎，D、E級(jí)為重度胰腺炎[5]。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)血清中miR-195水平

患者及志愿者入院當(dāng)日，采集空腹外周靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min，3000 rpm離心15 min，取血清，-80℃凍存。Trizol法提取總RNA，并測(cè)定RNA的純度。RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄生成cDNA后，加入BeyoFast? SYBR Green qPCR Mix等進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參。miR-195上游序列：5′-AGCTTCCCTGGCTCTAG CA-3′；miR-195下 游 序 列：5′-CTGGAGCAGCA CAGCCAATA-3′。產(chǎn)物大小76 bp。內(nèi)參U6上游引物：5′-GA CAGTCAGCCGCATCTTCT-3′，下游引物：5′-GC GCCC AATACGACCAAATC-3′，長(zhǎng)度228bp。反應(yīng)條件：95℃ 2min預(yù)變性，95℃ 15s變性，60℃ 30 s退火延伸，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法分析miR-195相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MCTSI評(píng)分、BISAP評(píng)分、Ranson評(píng)分和APACHEII評(píng)分

所有患者入院后即進(jìn)行改良的CT嚴(yán)重指數(shù)（Modified CT severity index，MCTSI）評(píng)分、急性胰腺炎嚴(yán)重程度床邊指數(shù)（Beside index of severity in acute pancreatitis，BISAP）評(píng)分、Ranson評(píng)分，急性生理與慢性健康評(píng)分 II（Acute physiology and chronic health evaluation，APACHEII）。其中MCTSI分為3級(jí)，I級(jí)：0-2分；II級(jí)：4-6分；III級(jí)：8-10分；BISAP評(píng)分<3分為輕癥急性胰腺炎，≧3分為中重癥急性胰腺炎；Ranson 評(píng)分<3分為輕癥急性胰腺炎，≧3分為重癥急性胰腺炎；APACHEⅡ評(píng)分評(píng)分<8分為輕癥急性胰腺炎，≧8分為重癥急性胰腺炎。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q法，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，分析采用X2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清miR-195水平

中/重度組miR-195為8.03±2.02，輕度組為4.32±1.27，對(duì)照組為1.52±0.76，中/重度組和輕度組患者血清miR-195相對(duì)表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，且中/重度組血清miR-195水平明顯高于輕度組血清（F=32.267，P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 血清miR-195表達(dá)水平

2.2 血清miR-195與患者臨床特征的關(guān)系

血清miR-195與MCTSI評(píng)分、BISAP評(píng)分、Ranson評(píng)分、APACHEII存在相關(guān)性（P<0.05），而與性別、年齡無(wú)相關(guān)性（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.3 miR-195診斷AP的ROC曲線下面積

miR-195診斷AP的ROC曲線下面積為0.881，診斷AP的準(zhǔn)確性較好。截?cái)嘀禐?.08，靈敏度為91.7%，特異度為86.2%，見(jiàn)圖2。

3 討論

AP是一種常見(jiàn)的臨床疾病，近年來(lái)其發(fā)病率一直在上升。它是由胰腺酶活化失調(diào)引起的急性炎癥反應(yīng)引起的，還可引發(fā)其他一系列并發(fā)癥的產(chǎn)生，并出現(xiàn)多器官功能障礙[6]。AP患者可能伴有惡心、嘔吐和疼痛等各種臨床癥狀，易誤診為 消化不良。目前，AP的發(fā)病機(jī)制仍不明確。

表1 血清 miR-195與患者臨床特征的關(guān)系

圖2 miR-195診斷AP的ROC曲線下面積

MicroRNA（miRNA）是內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合以進(jìn)行切割（完美匹配）或翻譯抑制（不完美的目標(biāo)雙鏈體）而在機(jī)體中發(fā)揮重要作用，主要參與生理和病理?xiàng)l件下多種細(xì)胞類型的調(diào)節(jié)，例如發(fā)育、增殖、凋亡、新陳代謝以及疾病[7]。近年來(lái)研究主要集中在胰腺癌中miRNA的表達(dá)，而關(guān)于miRNA在AP發(fā)生中的作用研究很少。miR-195屬于一種多功能miRNA，研究顯示miR-195在糖尿病患者玻璃體、視網(wǎng)膜組織中被上調(diào)并參與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞損傷[8]。

本文采用qRT-PCR技術(shù)分析AP患者及志愿者血清miR-195水平。顯示，AP患者血清miR-195水平明顯高于對(duì)照組，而中/重度組明顯高于輕度組，說(shuō)明miR-195參與了AP的發(fā)生和進(jìn)展。而且miR-195與MCTSI評(píng)分、BISAP評(píng)分、Ranson評(píng)分、APACHEII密切相關(guān)，進(jìn)一步證明miR-195水平與患者的疾病的嚴(yán)重程度存在一定的相關(guān)性，并可能成為判斷AP嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物。而且通過(guò)計(jì)算miR-195診斷AP的ROC曲線下面積發(fā)現(xiàn)其AUC值介于0.7-0.9之間，診斷準(zhǔn)確性較好，并具有較高的靈敏度和特異度。

綜上所述，miR-195參與了AP的發(fā)生和發(fā)展，其水平能反應(yīng)AP患者的嚴(yán)重程度，可以作為診斷AP嚴(yán)重程度的標(biāo)記物，值得臨床推廣。