GeneXpertMTB/RIF Assay對(duì)肺部結(jié)核的臨床診斷及治療價(jià)值

胡新

（甘孜藏族自治州州人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 甘孜 626000）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium Tuberculosis，MTB）引起的全身多器官系統(tǒng)感染性疾病，以肺結(jié)核最為常見[1]。由于結(jié)核的治療一般需要多種藥物聯(lián)合使用，長(zhǎng)期規(guī)律治療，并且在治療中可能會(huì)存在耐藥，因此選擇合適的方法快速、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核及耐藥情況是患者治療開展的基礎(chǔ)[2]。GeneXpert MTB/RIF Asaay檢測(cè)系統(tǒng)系統(tǒng)是由美國(guó)Cepheid公司研發(fā)，將樣品準(zhǔn)備、定量PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)集于一身并自動(dòng)進(jìn)行MTB核酸分析的系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR，針對(duì)rpoB基因81 bp利福平（Rifampicin，RIF）耐藥區(qū)間設(shè)計(jì)引物、探針，檢測(cè)其是否有突變，能夠在2 h內(nèi)檢測(cè)出患者是否感染結(jié)核或?qū)Ｆ侥退帲艽蟪潭葷M足臨床需求[3]。基于此，本研究選取2019年1月至2019年12月在甘孜藏族自治州人民醫(yī)院住院的臨床癥狀和影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本148份，同時(shí)選取50份肺部感染（非結(jié)核感染）的痰液標(biāo)本，采用GeneXpertMTB/RIF Assay以及傳統(tǒng)的涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT960檢測(cè)法對(duì)結(jié)核桿菌進(jìn)行測(cè)定，旨在探討GeneXpertMTB/RIF Assay檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)將研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月至2019年12月在甘孜藏族自治州人民醫(yī)院住院的臨床癥狀和影像學(xué)檢查診斷為肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本148份，同時(shí)選取50份肺部感染（非結(jié)核感染）的痰液標(biāo)本；分別采用涂片抗酸桿菌檢查、BACTEC MGIT960檢測(cè)法和GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)法檢測(cè)痰液標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌表達(dá)情況，并分別采用MGIT960藥敏法和GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)法測(cè)定MTB對(duì)RIF耐藥的情況。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

所有患者均符合肺結(jié)核的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并經(jīng)影像學(xué)及細(xì)菌學(xué)檢查確診；未合并其他肺部疾病。

1.3 儀器與試劑

抗酸染液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供；羅氏固體培養(yǎng)基與分枝桿菌培養(yǎng)添加劑、培養(yǎng)管以及分枝桿菌用聯(lián)合藥敏試劑盒和痰消化液均由碧迪醫(yī)療器械有限公司提供；BACTECMIT960、全自動(dòng)GeneXpert儀器及GeneXpert Mtb/RIF檢測(cè)試劑盒GeneXpert MTB/RIF Asaay檢測(cè)系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Cepheid公司。儀器包括四通道半巢式熒光定量PCR分析儀，計(jì)算機(jī)及操作系統(tǒng)軟件、KDC-2046低速冷凍離心機(jī)。

1.4 方法

1.4.1 MGIT960檢測(cè)MTB及MGIT960藥敏法

痰液標(biāo)本加入等量體積4%氫氧化鈉溶液，置震蕩器振蕩液化15 s后，孵育不超過(guò)20 min，加入PBS后振蕩離心（3950 r·min-1，15 min，離心半徑8 cm）后棄上清液，加入PBS 2 ml混勻，取0.5 ml標(biāo)本處理液上機(jī)測(cè)試，若結(jié)果為陽(yáng)性，則挑選陽(yáng)性菌落涂片、轉(zhuǎn)種于羅氏培養(yǎng)基；取出陽(yáng)性第3天～第5天培養(yǎng)管，取1 ml標(biāo)本液和4 ml無(wú)菌生理鹽水作為稀釋菌液，再以此稀釋菌液1∶100稀釋作為對(duì)照菌液，分別加入500 μl對(duì)照菌液和稀釋菌液于BACTEC MGIT960對(duì)照管及加有RFP的藥物培養(yǎng)管中顛倒混勻。放入BACTEC MGIT960培養(yǎng)箱中，15 d內(nèi)儀器自動(dòng)報(bào)告敏感與耐藥結(jié)果。

1.4.3 GeneXpertMTB/RIF Assay檢測(cè)法

（1）前處理：取1 ml痰標(biāo)本于樣品管中，加入2倍體積的SR，震蕩20 s后靜置15min。取2 ml處理后樣本液，加入Cartrige反應(yīng)盒內(nèi)。

（2）檢測(cè)：將含標(biāo)本液的Cartrige盒放入模塊中，系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)行核酸提取、擴(kuò)增，以及目標(biāo)序列的檢測(cè)和結(jié)果判斷。反應(yīng)結(jié)束后判讀痰液標(biāo)本中是否存有MTB以及是否對(duì)RIF耐藥。

（3）GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)法對(duì)MTB的結(jié)果分為：MTB檢出（極低，低，中，高）和未檢出。GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)法對(duì)RIF耐藥的檢測(cè)結(jié)果分為：RIF Resistance檢出，即RIF耐藥；RIF resistance未檢出，即RIF敏感。本次對(duì)GeneXpertMTB/RIF檢出都判定為MTB檢出陽(yáng)性。

1.4.4 涂片抗酸桿菌檢查

涂片經(jīng)火焰固定，加石碳酸復(fù)紅液染色5~10 min后，加酸性酒精溶液脫色1~2 min，重復(fù)操作直至紅色完全脫掉，加亞甲基藍(lán)溶液染色30 s，水洗、干燥、鏡檢。

1.5 觀察指標(biāo)

以細(xì)菌學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較不同檢測(cè)方法對(duì)結(jié)核分枝桿菌檢出的情況；敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/（真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù)）×100%。

以MGIT960藥敏法為標(biāo)準(zhǔn)分析GeneXpertMTB/RIF Assay檢測(cè)法檢測(cè)RIF耐藥性的敏感性及特異性。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X ±SD）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率或構(gòu)成比表示，采用X2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測(cè)方法對(duì)MTB檢出情況比較

GeneXpertMTB/RIF、MGIT960培養(yǎng)法及直接涂片法檢測(cè)痰液標(biāo)本中MTB的敏感度分別為60.14%、58.11%、24.32%，GeneXpertMTB/RIF與MGIT960培養(yǎng)法比較無(wú)差異（P>0.05），與直接涂片法比較有明顯差異（P<0.05）；特異度分別為100.00%、92.00%、94.00%，GeneXpertMTB/ RIF與MGIT960培養(yǎng)法和直接涂片法比較均有顯著差異（P<0.05），見表1。

2.2 GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)法對(duì)RIF耐藥性測(cè)定的敏感性及特異性

148例肺結(jié)核標(biāo)本中，BACTECMIT960法檢測(cè)86例陽(yáng)性，其中有79例GeneXpertMTB/ RIF也為陽(yáng)性；以MGIT960藥敏法為標(biāo)準(zhǔn)，79例標(biāo)本的GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)法檢測(cè)RIF耐藥性 的敏感度為100.00%，特異度為95.31%，見表2。

表1 不同檢測(cè)方法對(duì)MTB的檢出情況

表2 GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)法檢測(cè)RIF耐藥性的敏感性及特異性

3 討論

利福平是治療結(jié)核病的常用藥物。但是，研究發(fā)現(xiàn)利福平在耐多藥結(jié)核中非常常見，發(fā)生頻率超過(guò)95%，因此對(duì)于肺結(jié)核來(lái)說(shuō)，快速明確診斷、確定結(jié)核菌耐藥情況對(duì)結(jié)核病臨床治療意義重大[5]。

傳統(tǒng)痰涂片抗酸染色，雖然費(fèi)用低，但假陰性很高，容易漏診病人，并且對(duì)病人合理用藥無(wú)法提供參考。而液體培養(yǎng)法MGIT960檢測(cè)MTB及藥物敏感性準(zhǔn)確度高，但耗時(shí)長(zhǎng)，最快陰性報(bào)告需要一周的時(shí)間，而陽(yáng)性及藥敏報(bào)告在無(wú)污染和其他因素的干擾下也需要最少兩周左右的時(shí)間[6]，不利于早期診斷。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)被用于結(jié)核病和MTB RIF耐藥性的快速檢測(cè)和診斷。該系統(tǒng)為全自動(dòng)一體化半定量巢式實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)系統(tǒng)，主要針對(duì)MTB的81 bp利福平耐藥核心區(qū)間設(shè)定引物、探針并進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，根據(jù)其是否發(fā)生基因突變來(lái)檢測(cè)樣本中是否含有MTB及其是否對(duì)利福平耐藥，核酸提取、純化及濃縮均為全自動(dòng)化處理，因此可在2 h內(nèi)獲得結(jié)果[7]。本研究通過(guò)多種方法檢測(cè)痰液標(biāo)本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GeneXpertMTB/RIF對(duì)MTB檢出的敏感性和特異性均較傳統(tǒng)檢測(cè)方法高；GeneXpertMTB/RIF檢測(cè)示MTB對(duì)利福平耐藥的敏感度為100.00%，特異度為95.31%。

可見，GeneXpertMTB/RIF 檢測(cè)法的檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)，有助于實(shí)驗(yàn)室結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的快速鑒定和篩查，對(duì)結(jié)核病患者的早期診斷和治療有著非常重要的價(jià)值。