熱暴露后大鼠食管緊密連接蛋白表達的改變

邢瀚文，陶 虹，趙玉瓊,牛世博，李 霞，羅 彥,4

消化系統(tǒng)的研究發(fā)現在中暑或運動引起的熱應激情況下，腸道黏膜屏障發(fā)生損傷，通透性增加，引起腸道內細菌入血，這可能與熱應激時的菌血癥有關[1]，而食管作為連接口腔和胃的器官，在吞咽食物的過程中發(fā)揮了重要的作用，食管黏膜上皮細胞層是保護食管免受食物的機械損傷或胃內反流物化學損傷的重要屏障。若將食管組織黏膜面直接暴露在模擬熱飲的48 ℃環(huán)境下，食管黏膜上皮的間隙變大，電阻變小，提示黏膜上皮功能屏障功能受損[2]。而在慢性束縛應激的小鼠食管發(fā)現，與上皮細胞屏障功能有關的緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達發(fā)生改變，同時應激時具有致炎和抗炎雙重作用的蛋白酶切激活受體-2(PAR-2)及其激活劑來源肥大細胞數目在食管或腸道中也發(fā)生了改變，它們可通過引起炎癥或氧化應激來影響上皮細胞的功能[3]。那么在熱暴露引起的熱應激情況下，食管黏膜上皮緊密連接蛋白及PAR-2又是如何變化的呢。本研究通過建立大鼠熱暴露的動物模型，觀察熱暴露引起的熱應激情況下大鼠食管組織緊密連接蛋白Occludin和ZO-1，PAR-2的表達情況。

1 材料與方法

1.1 建立大鼠熱暴露模型：8只成年雄性SD 大鼠隨機分為對照組和熱暴露組(每組4只)，體重190～200 g，各組大鼠分別正常飼養(yǎng)3 d 后，熱暴露組開始在人工氣候倉內進行適應性熱暴露2 h(32 ℃)/d，6 h(32 ℃)/d,14 h(32 ℃)/d,18 h(32 ℃)/d，共4 d，從第8天開始持續(xù)進行熱暴露24 h(32 ℃)共10 d，對照組始終正常飼養(yǎng)。每天記錄大鼠體重、飲食、飲水變化，觀察大鼠一般狀況。

1.2 大鼠食管組織石蠟切片：10%水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)大鼠后，開胸，用小鑷子原位游離分離頸胸段食管后，剪斷。在生理鹽水中反復沖洗使組織上無血液附著，小心去除附著的結締組織，濾紙吸干水分后投入4%多聚甲醛固定。經過固定的組織樣本經梯度乙醇脫水、二甲苯透明以后，55 ℃左右石蠟包埋，常規(guī)4 μm切片，貼于處理過的載玻片上，溫箱中烤片過夜后，收集至載片盒中保存。進行常規(guī)HE染色。

1.3 免疫組織化學染色：石蠟包埋食管組織進行4 μm切片，60 ℃烤片1 h 后，進行二甲苯脫蠟，水化，3%過氧化氫阻斷內源性生物素，微波修復，Occludin和ZO-1用EDTA抗原修復液進行微波修復，PAR-2用枸櫞酸鹽抗原修復液進行修復。然后兔抗occludin(1∶200,Abcam,ab216327),兔抗ZO-1(1∶500,Bioss,bs-1329-R),兔抗PAR-2(1∶250,Bioss,bs1178R)，4 ℃過夜，β-actin 為內參，免疫組化試劑盒進行后續(xù)實驗。

1.4 Western blot實驗：研磨缽中倒入少許液氮預冷，稱取食管組織，在液氮中盡量將食管組織研磨碎，待液氮揮發(fā)后，將食管組織倒入1.5 mL離心管中，管中預先根據重量體積比加入了預冷的裂解液。后將離心管置于渦旋振蕩器上充分震蕩裂解，每次震蕩30 s，重復3次，在低溫高速離心機中以12 000 rpm 的速度離心5 min，離心完成后小心吸取上清液，根據BCA法進行蛋白定量，之后按樣品∶loading-buffer= 4∶1 的比例加入 Loading-buffer，100 ℃熱水加熱變性。anti-Occludin(1∶1 000,Abcam,ab216327),anti-ZO-1(1∶500,Bioss,bs-1329-R),anti-PAR-2(1∶500,Bioss,bs1178R)，4 ℃過夜，二抗室溫1 h，ECL顯色。用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1 熱暴露后大鼠一般情況及體重變化：對照組與熱應激組大鼠均正常存活，隨著飼養(yǎng)時間的增加，2組大鼠的體重均持續(xù)增長,而從持續(xù)24 h熱暴露(第9天)開始，熱應激組大鼠體重增長比對照組多一點，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 熱暴露后大鼠食管組織學改變：食管組織進行HE染色，可見在食管腔面有角化細胞層，接著是多層多角形的鱗狀細胞，基底層可見顆粒細胞，熱暴露后，食管上皮未見明顯缺失和結構異常。

2.3 熱暴露后大鼠組織緊密連接蛋白Occludin、ZO-1和PAR-2的表達：從免疫組織化學染色結果看到緊密連接蛋白Occludin主要表達于食管黏膜復層扁平上皮細胞層，定位于細胞膜上，且熱暴露后陽性細胞數減少；ZO-1主要表達于復層扁平細胞的細胞核,熱暴露后表達不變或輕度增加；PAR-2主要表達于食管黏膜上皮細胞，定位于細胞漿，熱暴露后黏膜上皮細胞層PAR-2表達下降，見圖1(封三)。

取食管組織進行Western blot實驗，結果顯示，熱暴露后食管組織PAR-2表達減少，緊密連接蛋白Occludin表達下降，ZO-1表達升高,對照組PAR-2的灰度值是0.349±0.0765，熱暴露后下降為0.264±0.0392，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),Occludin的蛋白灰度值為1.354±0.520，熱暴露后為0.753±0.436(P<0.05)，ZO-1的表達從0.245±0.103升高為0.666±0.233，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

3 討論

消化道黏膜上皮形成了一層分隔消化道內容物和內環(huán)境的屏障，該屏障選擇性地過濾腸內容物，同時防止腸內有害病原微生物或抗原進入循環(huán)，其中位于細胞和細胞之間的緊密連接對于維持屏障功能的完整性尤為重要，可通過調節(jié)緊密連接蛋白來調節(jié)黏膜的屏障功能[4]。而緊密連接蛋白中的跨膜屏障蛋白 claudins，occludin 等能促進細胞粘附及形成細胞旁屏障。胞漿內“腳手架蛋白”(ZO)對于緊密連接的形成和細胞極性的調節(jié)而言非常重要。研究發(fā)現熱應激可降低育肥豬空腸Occludin和ZO-1的表達[5]。本研究也發(fā)現，在熱暴露的大鼠食管組織上皮細胞間緊密連接蛋白Occludin表達下降，陽性細胞數減少，而Occludin是形成細胞緊密連接及維持細胞屏障功能的重要蛋白，它的表達下降，提示細胞緊密連接減少，細胞屏障功能減弱，這與其他研究結果一致。同時，我們觀察到另一個重要的細胞緊密連接蛋白ZO-1表達升高，這與其他類似研究不一致，可能與熱暴露時間及模式不同有關。而與對照組相比，大鼠食管組織學觀察沒有發(fā)現明顯的損害，這與之前的研究一致，當兔食管組織暴露于40℃時，無論暴露時間長短，均不會造成組織學改變[6]。同時，熱暴露組大鼠的體重增長與對照組大鼠相比也沒有統(tǒng)計學差異，因此，本研究中熱暴露沒有明顯改變大鼠生長情況，在沒有對食管黏膜組織造成明顯組織學改變的情況下，熱暴露引起的熱應激也可改變食管上皮緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達，從而影響食管上皮細胞的屏障功能。

蛋白酶切激活受體-2(PAR-2)是蛋白酶切激活受體家族的一員，具備多種生物學功能，具有致炎和抗炎的雙重作用，它被肥大細胞來源的類胰蛋白酶激活。在大鼠避水應激時，腸道黏膜PAR-2表達上調，肥大細胞數目增加，緊密連接蛋白表達下調[7]。當慢性束縛應激時，小鼠食管上皮屏障功能紊亂，表現為細胞間隙增大，某些緊密連接蛋白表達降低，并且肥大細胞數目與PAR-2表達也升高[3]。當抗氧化物質表達下降時，食管及血漿中炎性因子水平顯著升高[8]，提示肥大細胞來源的類胰蛋白酶激活PAR-2可能參與了應激后食管上皮細胞屏障功能紊亂。本研究中發(fā)現熱應激后食管上皮細胞PAR-2表達下降，這一不同可能與應激的種類和程度不同以及器官功能特異性有關。食管的結構與消化道其他地方不同，與胃和腸道相比，具備獨特的黏膜下腺體，黏膜下神經叢，對于應激和損傷的反應因此也可能有所不同[9-10]。而對于慢性應激的刺激，近端結腸和遠端結腸PAR-2及肥大細胞的變化確實存在區(qū)域差異[11]。

屏障功能紊亂一方面可能引起腸道內微生物重定植，比如熱暴露引起的熱應激會損傷腸黏膜屏障，引起菌血癥；另一方面，慢性應激會增加小鼠食管炎性介質，促進氧化應激，參與內臟高敏感性的發(fā)生[1]，或者引起應激性潰瘍[12]。因此研究應激情況下引起屏障功能改變的機制非常重要，本研究沒有探討熱暴露引起的熱應激大鼠食管上皮緊密連接蛋白和PAR-2表達改變的詳細機制，而在應激情況下，糖皮質激素會抑制皮膚表皮層細胞的增殖和分化，減弱屏障功能的穩(wěn)定性,減少角質層的完整[13]。腎上腺素通過作用于β-1,2,3受體,減弱皮膚成纖維細胞的活動[14]，臨床研究也發(fā)現感染性休克的病人去甲腎上腺素的使用與腸細胞的損害有關[15]。因此，應激時各種體液因素可能參與了對食管上皮緊密連接蛋白及PAR-2表達的調控，但需要進一步的實驗進行驗證。