石灰和雙氰胺對(duì)紅壤酸化和硝化作用的影響及其機(jī)制*

張昊青，趙學(xué)強(qiáng)?，張玲玉，沈仁芳

（1. 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（中國科學(xué)院南京土壤研究所），南京 210008；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

中國南方酸性紅壤區(qū)面積218 萬km2，約占全國土地總面積的22.7%[1]。該地區(qū)水熱資源豐富，有著巨大的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)潛力[2]。然而，由于土壤鋁毒、錳毒、酸害及養(yǎng)分缺乏等一系列植物生長限制因子，酸性土壤的巨大生產(chǎn)潛力難以發(fā)揮[2-3]。近年來，由于氮肥的大量施用，我國農(nóng)田土壤酸化嚴(yán)重，不僅限制了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力，也威脅到生態(tài)環(huán)境質(zhì)量[4-5]。與全國其他地區(qū)相比，紅壤區(qū)的酸化問題更為突出[6]。實(shí)現(xiàn)酸性紅壤的可持續(xù)利用，是關(guān)系到國家糧食安全和環(huán)境保護(hù)的重要課題。

施用酸性土壤改良劑是提高酸性土壤作物生產(chǎn)力的一個(gè)主要策略[2，5]，其中石灰是最傳統(tǒng)且效果顯著的酸性土壤改良劑。施用石灰可快速提高土壤pH，顯著改善酸性土壤上植物的生長，但在土壤pH提高的同時(shí)，又會(huì)不可避免地加速土壤硝化作用[7]。硝化作用的加速，一方面引起質(zhì)子積累，加重土壤酸化程度；另一方面，增加土壤中硝態(tài)氮的累積，在高溫多雨的南方紅壤區(qū)，硝態(tài)氮極易發(fā)生徑流、淋洗和反硝化損失，從而對(duì)水體質(zhì)量和空氣質(zhì)量構(gòu)成潛在威脅[8]。由于土壤顆粒表面一般帶負(fù)電荷，與帶負(fù)電的硝酸根相比，帶正電的銨離子更易被土壤吸附和晶格固定，不易隨水淋失[9]。此外，與吸收硝態(tài)氮相比，植物根系吸收銨態(tài)氮不需要還原過程，一般耗能較少，速率較快，容易獲得較高生物量[10]。酸性土壤硝化作用較弱，銨態(tài)氮/硝態(tài)氮的比例較高，由于長期進(jìn)化適應(yīng)的原因，酸性土壤上生長的植物一般較為偏好銨態(tài)氮且耐鋁毒[11]。利用銨態(tài)氮和鋁的協(xié)同作用是提高酸性土壤氮效率的主要策略之一[12]。因此，若能有效抑制石灰誘導(dǎo)的酸性紅壤硝化作用，將土壤中的銨硝比維持在較高水平，不僅可以降低硝態(tài)氮淋失及反硝化造成的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，提高氮肥利用效率，同時(shí)也能減緩硝化作用引起的土壤酸化，維持酸性紅壤區(qū)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

硝化抑制劑種類較多， 其中， 雙氰胺（Dicyandiamide，DCD）是目前廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種硝化抑制劑。利用DCD 延緩銨態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，可有效降低土壤氮素?fù)p失，提高作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)，提高氮肥利用率[13]。DCD 在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用效果已有大量報(bào)道，其施用效果經(jīng)常依賴于土壤環(huán)境和管理措施，在不同條件下存在很大差異[13-15]。在酸性土壤地區(qū)，為了改善作物生長，經(jīng)常施用石灰以提高土壤pH。一方面，土壤pH 是調(diào)控土壤中的硝化過程和硝化微生物的關(guān)鍵因素[16]，施用石灰導(dǎo)致的土壤pH 增加會(huì)加速酸性土壤中的硝化過程，進(jìn)而可能會(huì)影響DCD 的作用效果。另一方面，DCD 通過抑制土壤硝化作用，減緩?fù)寥浪峄?，也可能改變石灰的作用效果。目前研究多集中于石灰或DCD 單一因素對(duì)土壤硝化作用的影響，對(duì)于石灰和DCD 配合施用對(duì)酸性土壤硝化過程的影響及其機(jī)制的研究尚鮮有報(bào)道?；谏鲜隹紤]，為了探究石灰和DCD 配合施用對(duì)酸性土壤pH 和硝化作用的影響及其機(jī)制，本文比較分析了石灰和DCD 交互作用對(duì)酸性土壤培養(yǎng)過程中pH、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量及硝化微生物（氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌）豐度的影響。研究結(jié)果旨在為酸性土壤改良和氮素優(yōu)化管理提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試紅壤發(fā)育于第四紀(jì)紅黏土，采集自江西省鷹潭市中國科學(xué)院紅壤生態(tài)試驗(yàn)站旱地農(nóng)田，該地區(qū)屬于亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年平均降水量 1882 mm。采集0～20 cm 的新鮮土壤樣品，剔除雜物及殘留根系后，風(fēng)干，磨細(xì)，分別過1 mm 和0.149 mm 孔徑篩備用。

于試驗(yàn)開始前進(jìn)行供試土壤的基本理化性質(zhì)分析。用pH 計(jì)（PB-21，Sartorius，德國）在土水比為1∶2.5 的條件下測(cè)得土壤pH 為4.80；用2 mol·L-1KCl 浸提，流動(dòng)分析儀（San++ System，SAKLAR，荷蘭）測(cè)得土壤初始硝態(tài)氮含量為1.42 mg·kg-1，銨態(tài)氮含量為3.10 mg·kg-1；用鹽酸-氟化銨浸提，鉬銻抗比色法測(cè)得土壤有效磷含量為3.00 mg·kg-1；用1 mol·L-1乙酸銨浸提，火焰光度法測(cè)得土壤速效鉀含量為67.90 mg·kg-1；用低溫外加熱重鉻酸鉀氧化—比色法測(cè)得土壤有機(jī)質(zhì)含量為8.9 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)包括兩個(gè)因素，A 因素為石灰（CaCO3）用量，分別為0、2、4、6 g·kg-1干土；B 因素為DCD，分為不施用DCD（-DCD）和施用DCD（+DCD）。共8 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3 次。同時(shí)，所有處理均供應(yīng)200 mg·kg-1（以N 計(jì)）尿素作為氮源。DCD用量為20 mg·kg-1干土（施氮量的10%）。DCD 由上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn)，含量980 g·kg-1。

首先，稱取50 g 過1 mm 篩的風(fēng)干土于培養(yǎng)瓶中，分別加入不同量的石灰，與土壤充分混勻，得到不同石灰添加量的土壤。再將同一石灰用量的土壤分為兩份，一份僅加入尿素溶液，另一份加入尿素和DCD 的混合溶液。另加入一定量去離子水以維持正常的水分含量和通氣狀態(tài)。用塑料膜將培養(yǎng)瓶封口，并在中間留出小孔以創(chuàng)造好氣環(huán)境。將培養(yǎng)瓶置于25 ℃人工氣候室中恒溫黑暗培養(yǎng)。培養(yǎng)期間每3 天采用稱重法補(bǔ)水1 次，使土壤水分保持基本恒定。于培養(yǎng)開始后的0、7、14、21 和35 d 分別取樣，取樣后立即用2 mol·L-1KCl 溶液浸提，浸提液置于4 ℃冰箱保存，用于測(cè)定土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量。同時(shí)，于培養(yǎng)開始后第35 天采集土壤樣品，置于-20 ℃冰箱，用于土壤DNA 的提取。

1.3 土壤微生物總DNA 的提取

于培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（第35 天），采用FastDNA Spin Kit For Soil 試劑盒（北京天根生化科技有限公司），提取土壤總DNA。稱取0.50 g 土壤樣品，按照試劑盒說明書進(jìn)行提取。用微量分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000 spectrophotometer，美國）檢測(cè)提取DNA樣品的濃度和純度，后保存至-20 ℃冰箱，以用于氨氧化微生物amoA基因拷貝數(shù)檢測(cè)。

1.4 氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌中amoA 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 分析

氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea；AOA）和氨氧化細(xì)菌（Ammonia-oxidizing bacteria；AOB）中amoA基因豐度采用PCR 擴(kuò)增儀（LightCycler 480real-time PCR system，Roche，德國）進(jìn)行定量分析。所采用的引物序列及反應(yīng)程序如表1 所示。試驗(yàn)采用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司生產(chǎn)，SYBR Premix Ex Taq 由日本TaKaRa 公司生產(chǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析以提取的土壤DNA 為模板，反應(yīng)體系為10 μL，包括1 μL DNA 模板、5 μL SYBR Premix Ex Taq，前后引物各1 μL 及2 μL 滅菌雙蒸水。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，即以滅菌雙蒸水代替土壤DNA 作為反應(yīng)模板。每個(gè)樣品3 次技術(shù)重復(fù)。

表1 氨氧化古菌（AOA）與氨氧化細(xì)菌（AOB）amoA 基因定量PCR 引物序列及反應(yīng)程序Table 1 Primer sequences and reaction procedures of ammonia-oxidizing archaea（AOA）and ammonia-oxidizing bacteria（AOB）amoA gene quantitative PCR

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：通過溶菌肉湯（LB，Lysogeny Broth）培養(yǎng)基培養(yǎng)含有目的基因的克隆子，按照試劑盒（FavorPrep Plasmid Extraction Mini Kit，F(xiàn)AVORGEN Bio，中國）的操作步驟進(jìn)行質(zhì)粒的提取和純化。提取后的質(zhì)粒用微量分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000 spectrophotometer，美國）檢測(cè)其濃度，并以10 倍梯度對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線重復(fù)3 次，擴(kuò)增效率均在92%～105%之間，決定系數(shù)R2均大于0.99。

1.5 數(shù)據(jù)處理

土壤表觀硝化率是土壤中硝態(tài)氮含量占土壤銨態(tài)氮含量和硝態(tài)氮含量之和的百分?jǐn)?shù)[19]。

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析檢驗(yàn)不同石灰用量處理間土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、表觀硝化率、土壤pH 及AOA 和AOB 中amoA基因豐度的差異顯著性。采用獨(dú)立樣本t-檢驗(yàn)分析同一石灰用量條件下施DCD 與不施DCD 處理之間上述測(cè)定指標(biāo)差異顯著性。多重比較采用鄧肯（Duncan）法，差異顯著性水平為5%。通徑分析方法參考杜家菊和陳志偉[20]的報(bào)道，通過SPSS19.0進(jìn)行線性回歸得到線性回歸方程的標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)，即為直接通徑系數(shù)，再乘以自變量之間的相關(guān)系數(shù)即得間接通徑系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 石灰和硝化抑制劑對(duì)土壤pH 的影響

由于尿素的水解，在培養(yǎng)0 d 時(shí)不施石灰處理pH 顯著高于試驗(yàn)初始pH（4.8）。在整個(gè)培養(yǎng)期間，無論是否施用 DCD，當(dāng)石灰用量從 0 增加至4 g·kg-1，土壤 pH 逐漸升高，但當(dāng)石灰用量大于4 g·kg-1時(shí)，繼續(xù)加大石灰用量對(duì)土壤pH 的提升幅度較低（圖1）。在不施DCD 的條件下，培養(yǎng)期間各石灰用量下的土壤pH 均有下降的趨勢(shì)（圖1a））；而在施用DCD 的條件下，土壤pH 基本保持不變（圖1b））。在整個(gè)培養(yǎng)期間，施用DCD 較不施DCD 處理土壤pH 均顯著增加，其中，以施用2 g·kg-1石灰處理下外加DCD 對(duì)土壤pH 的提升幅度最大。

2.2 石灰和硝化抑制劑對(duì)土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮含量的影響

在不施DCD 的條件下，施用石灰顯著增加土壤硝態(tài)氮含量，在培養(yǎng)7、14、21 d 時(shí)，施用石灰處理硝態(tài)氮含量較不施石灰處理分別增加 391.6%、127.3%和72.6%，其中以施用4 g·kg-1石灰處理對(duì)土壤硝態(tài)氮的提高幅度最大（圖2a））。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，不施石灰和施用2 g·kg-1石灰處理的土壤硝態(tài)氮含量均在培養(yǎng)35 d 達(dá)到峰值，而施用4 g·kg-1和6 g·kg-1石灰處理則在培養(yǎng)14 d 即達(dá)到峰值，后續(xù)有降低的趨勢(shì)。在培養(yǎng)第35 天時(shí)，各石灰用量之間硝態(tài)氮含量無顯著差異，這可能是由于各石灰處理土壤中的銨態(tài)氮已經(jīng)被完全硝化。在施用DCD 的條件下，土壤硝態(tài)氮含量在整個(gè)培養(yǎng)期間內(nèi)僅有少量增加，始終顯著低于不施DCD 處理。不同石灰用量對(duì)土壤硝態(tài)氮含量的影響并不顯著，且均保持較低水平（40 mg·kg-1以下），意味著土壤pH 的變化對(duì)DCD 自身的抑制效果無顯著影響（圖2b））。

與硝態(tài)氮的變化趨勢(shì)相反，在不施DCD 的條件下，石灰處理土壤銨態(tài)氮含量在整個(gè)培養(yǎng)期間均顯著低于對(duì)照處理，其中以施用4 g·kg-1石灰處理下銨態(tài)氮含量最低，較不施石灰處理降低62%（圖3a））。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，土壤中銨態(tài)氮含量急劇下降。培養(yǎng)21 d 后，除不施石灰處理外，其余處理土壤銨態(tài)氮含量均低于10 mg·kg-1，培養(yǎng)35d 后，各處理土壤銨態(tài)氮含量均降至3 mg·kg-1左右（圖3a））。在施用DCD 的條件下，不同石灰用量之間銨態(tài)氮含量差異不顯著，且整個(gè)培養(yǎng)期始終維持在100 mg·kg-1以上，顯著高于不施DCD 處理，進(jìn)一步證明了DCD 對(duì)硝化作用的抑制效果不受土壤pH 變化的影響（圖3b））。

2.3 石灰和硝化抑制劑對(duì)土壤表觀硝化率的影響

在不施DCD 的條件下，施用石灰顯著提高培養(yǎng)7～21 d 期間土壤的表觀硝化率。在培養(yǎng)7 d 時(shí)，在三種石灰用量中，4 g·kg-1石灰處理表觀硝化率最高，其次為6 g·kg-1石灰處理，最低為2 g·kg-1石灰，而在培養(yǎng)14 和21 d，三種石灰用量之間土壤表觀硝化率無顯著差異；在培養(yǎng)35 d 后，各處理表觀硝化率均達(dá)到98%以上（表2）。在施用DCD 的條件下，不同石灰用量對(duì)土壤表觀硝化率無顯著影響，且均維持在較低水平（<30%），顯著低于不施DCD處理（表2）。

表2 石灰和DCD 處理下的土壤表觀硝化率Table 2 Effects of lime and DCD addition on apparent soil nitrification rate/%

進(jìn)一步分析了施用石灰引起的土壤pH 變化與表觀硝化率之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，在培養(yǎng)第7、14、21 天，若不添加DCD，土壤表觀硝化率隨土壤pH的增加呈現(xiàn)先增加后降低的拋物線趨勢(shì)（圖4）。培養(yǎng)第7、14、21 天的表觀硝化率均在pH 6.9 左右達(dá)到峰值，峰值分別為72.2%、99.1%和98.8%。若添加DCD，土壤表觀硝化率不受土壤pH 影響（圖4）。

2.4 石灰和硝化抑制劑對(duì)土壤 AOA 和 AOB amoA 豐度的影響

在培養(yǎng)35 d 后，在不施DCD 的條件下，AOA 的豐度隨著石灰用量的增加逐漸降低（圖5a）），而石灰的施用卻顯著增加了土壤中AOB 的豐度（圖5b））。DCD 的添加僅在未施用石灰的條件下顯著降低AOA 的豐度，而在施用石灰的條件下對(duì)AOA 豐度無顯著影響（圖5a））。相反，DCD 的施加在各石灰用量條件下均造成了AOB 豐度的大幅度降低。由此證明，在低pH 條件下，DCD 可同時(shí)抑制AOA 和AOB 的數(shù)量，而在高pH 條件下，DCD 主要通過抑制AOB 的數(shù)量以抑制硝化。

通徑分析一方面可以確定自變量與因變量之間的直接關(guān)系（直接通徑系數(shù)），同時(shí)也可確定自變量1 通過影響自變量2 而對(duì)因變量產(chǎn)生的間接影響（間接通徑系數(shù)）[20]。由此可從直接影響和間接影響兩方面深入研究自變量與因變量之間的相關(guān)性。土壤硝化作用主要由AOA 和AOB 來主導(dǎo)，二者可以單獨(dú)或者聯(lián)合來控制土壤硝化作用。在添加DCD 的條件下，土壤硝化作用很弱。通過通徑分析進(jìn)一步分析了在不添加DCD 的條件下AOA 和AOBamoA基因豐度對(duì)7、14、21 d 土壤表觀硝化速率的影響（表3）。在不添加DCD 的條件下，AOA 豐度對(duì)土壤表觀硝化率的直接影響為負(fù)值，意味著隨著AOA 豐度的增加，土壤表觀硝化率降低，但二者之間相關(guān)性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著。同時(shí)，AOA 豐度也通過負(fù)面影響AOB 的豐度而間接降低土壤表觀硝化率；相反，在培養(yǎng)14 和21 d 后，AOB 豐度直接影響表觀硝化速率，且呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系（表3）。這些結(jié)果進(jìn)一步證明石灰誘導(dǎo)的酸性紅壤硝化作用增強(qiáng)是由AOB 所主導(dǎo)。

3 討 論

3.1 石灰和DCD 對(duì)紅壤酸化的影響

本研究表明，無論是否添加DCD，當(dāng)石灰用量小于4 g·kg-1時(shí)，土壤pH 隨石灰用量的增加顯著增加，而當(dāng)石灰用量大于4 g·kg-1時(shí)，繼續(xù)增施石灰對(duì)土壤pH 的提高并不顯著（圖1）。這可能是因?yàn)槭铱梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)中和土壤中的H+，對(duì)提高土壤pH有很強(qiáng)的瞬時(shí)效果，隨后由于土壤自身的緩沖作用，當(dāng)?shù)竭_(dá)土壤緩沖的臨界值時(shí)，繼續(xù)增加石灰用量不會(huì)造成土壤pH 的進(jìn)一步增加[21]。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，在不添加DCD 的條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，石灰對(duì)土壤pH 的提高效果有逐漸降低的趨勢(shì)（圖1），這與前人[21-22]的研究結(jié)果相似。其原因可能是由于施用石灰增強(qiáng)了土壤硝化作用，從而增加了H+的釋放[7]。在添加DCD 的條件下，在整個(gè)培養(yǎng)期間土壤pH 一直保持穩(wěn)定且始終高于不加DCD 處理。在施用2 g·kg-1石灰的條件下，添加DCD 處理的土壤pH 可基本與施用4 g·kg-1石灰處理相持平，這與劉源等[23]的研究結(jié)果相似。充分說明DCD 可通過抑制銨態(tài)氮的硝化過程以減緩酸化進(jìn)程。因此，在酸性土壤改良的過程中，不僅需要添加石灰提高土壤pH，還需從源頭抑制硝化作用，進(jìn)行酸化阻控。

表3 不施DCD 條件下對(duì)土壤AOA、AOB 豐度與表觀硝化率的通徑分析Table 3 Path coefficient analysis of the amoA gene copies in ammonia oxidizing archaea and bacteria and apparent nitrification rate without DCD

3.2 石灰用量對(duì)紅壤硝化作用的影響及其機(jī)制

硝化過程是對(duì)pH 高度敏感的生物學(xué)過程[16]。施用石灰在大幅度提高酸性紅壤pH 的同時(shí)，也顯著影響硝化反應(yīng)的進(jìn)行。在本研究中，土壤表觀硝化率在土壤pH 為7 左右時(shí)達(dá)到峰值，之后隨著土壤pH 的增加，表觀硝化率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)（表2）。這與Bramley 和White[24]的研究結(jié)果相似。究其原因主要有以下兩點(diǎn)：（1）pH 的升高會(huì)促進(jìn)氨揮發(fā)的發(fā)生，當(dāng)pH 達(dá)到7 左右時(shí)，繼續(xù)提高土壤pH 勢(shì)必會(huì)造成更多的氨揮發(fā)損失，進(jìn)而降低底物濃度；（2）高pH 有可能會(huì)抑制硝化細(xì)菌的活性。Bramley 和White[24]研究發(fā)現(xiàn)，土壤硝化細(xì)菌活性在土壤pH 6.0附近達(dá)到最高，其后隨著pH 的增加而降低。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)，隨著pH 的增加，AOA 豐度持續(xù)降低，AOB 豐度先增加后趨于平緩（圖5），與土壤表觀硝化率高度相關(guān)，進(jìn)一步證明高pH 環(huán)境對(duì)硝化微生物的抑制作用。但是，也有研究表明，將初始pH 為7.24 的紫色土用石灰調(diào)節(jié)至pH 為7.70，在培養(yǎng)18 d 后，表觀硝化率仍顯著增加[19]。一方面，在他們的研究中，施氮量為500 mg·kg-1土，遠(yuǎn)高于本試驗(yàn)施氮量（200 mg·kg-1土），因此底物濃度不會(huì)成為該試驗(yàn)中硝化過程的限制因子；另一方面，他們所采用的供試土壤初始pH 較高（7.24），其中的硝化微生物很可能已經(jīng)適應(yīng)高pH 環(huán)境，繼續(xù)提高土壤pH 則不會(huì)抑制其數(shù)量和活性。由此可見，對(duì)于不同土壤、不同培養(yǎng)環(huán)境，達(dá)到硝化作用峰值所對(duì)應(yīng)的土壤pH 也不盡相同，這可能與添加的底物濃度、土壤初始pH 及初始硝化微生物數(shù)量和活性有關(guān)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，酸性土壤中增施石灰所引起的硝化作用增強(qiáng)主要是由于AOB 豐度的增加，這與眾多其他研究結(jié)果相似[7，25-26]。與前人研究結(jié)果不同的是，在本研究中，由于AOA 的喜酸特性[27]，AOAamoA基因豐度隨著石灰用量的增加持續(xù)降低，而在Teutscherova 等[28]的研究中，施用石灰后土壤中AOA 和AOBamoA基因豐度均顯著增加，造成差異的原因可能與供試土壤中氮素礦化過程有關(guān)。AOA主要利用土壤有機(jī)氮礦化釋放的少量NH3生長，在Teutscherova 等[28]的研究中，供試土壤有機(jī)碳含量較高（25.8 g·kg-1），為氮素礦化過程提供了充足碳源。隨著pH 的增加，土壤中有機(jī)氮的礦化過程增強(qiáng)，NH3顯著增加，從而促進(jìn)了AOA 的生長。而在本研究中，土壤有機(jī)碳含量較低（8.9 g·kg-1），很可能限制了氮素礦化過程的發(fā)生，進(jìn)而對(duì)AOA 的生長無促進(jìn)作用。

3.3 添加DCD 對(duì)紅壤硝化作用的影響及其機(jī)制

本研究中，在不施用石灰的條件下，添加DCD與不施DCD 處理相比表觀硝化率顯著降低，且降低幅度始終保持在 70%左右，證實(shí)了 DCD 在抑制酸性紅壤硝化過程中的有效性。這與諸多前人[29-30]研究結(jié)果相同。其原因主要是由于DCD 在酸性條件下顯著降低了AOA 和AOB 豐度。但是，諸多研究指出，由于DCD 極易溶于水且移動(dòng)性較強(qiáng)，降雨會(huì)導(dǎo)致其在土壤中發(fā)生淋溶損失，減弱其抑制作用[31]。此外，也有研究表明，DCD 在高溫下降解較快，在熱帶地區(qū)不適合采用DCD 作為硝化抑制劑[32]。本研究在室內(nèi)開展，無法完全模擬實(shí)際生產(chǎn)中的水熱條件。紅壤地區(qū)多集中于我國東南丘陵區(qū)，降雨量大，水熱資源豐富，因此，DCD 田間的實(shí)際效果尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.4 石灰與DCD 配合施用對(duì)紅壤硝化的作用效果

在酸性土壤中，抑制銨態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化對(duì)提高酸性土壤氮素利用效率具有重要意義。盡管一般情況下酸性土壤本身的硝化作用較弱，但在生產(chǎn)過程中，人們通常會(huì)施用石灰以提高土壤pH，保證作物產(chǎn)量，由此間接促進(jìn)了土壤中的硝化過程。傳統(tǒng)的硝化抑制劑DCD 能否在石灰改變pH 的條件下始終有效抑制硝化是當(dāng)前紅壤區(qū)生產(chǎn)中亟需解決的問題。本研究發(fā)現(xiàn)，與不施 DCD 對(duì)照相比，施用DCD 在各石灰用量條件下均有效抑制了紅壤硝態(tài)氮的產(chǎn)生（圖2），顯著降低了表觀硝化率，且各石灰處理間表觀硝化率無顯著差異（表2），充分說明DCD 的抑制效果不受土壤pH 升高的影響。與本研究結(jié)果不同的是，史云峰等[32]在海南的磚紅壤上研究發(fā)現(xiàn)，用石灰調(diào)節(jié)pH 后，DCD 的硝化抑制作用隨pH 的升高而降低。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)，DCD在pH 較高的潮土和水稻土上對(duì)硝化作用的抑制效果較明顯，而在酸性紅壤上的抑制效果較差[14]，也表明DCD 對(duì)硝化作用的抑制效果依賴于土壤pH，這與本文結(jié)果也有所不一致。DCD 施用量的不同可能是造成結(jié)果差異的主要原因。在本研究中，DCD用量為20 mg·kg-1土，為史云峰等[32]DCD 用量的兩倍，早有研究表明，DCD 用量越大，其抑制效果越佳[33]。因此，需保證 DCD 的較高施用量，以維持較好的抑制效果。

進(jìn)一步探究DCD 的作用機(jī)理發(fā)現(xiàn)，在不同石灰用量條件下，DCD 對(duì)硝化作用的抑制機(jī)理也不同。在施用石灰的條件下，DCD 主要通過抑制AOB 的數(shù)量達(dá)到抑制效果。這與諸多研究[34]結(jié)果相似。原因一方面是由于AOA 的數(shù)量已經(jīng)被堿性環(huán)境強(qiáng)烈抑制，另一方面可能是由于基本代謝和細(xì)胞之間的差異，細(xì)菌相對(duì)古菌更容易受到抑制物的影響[16]。而在不施石灰的條件下，DCD 對(duì)AOA 和AOB 的豐度均有顯著抑制作用（圖5），意味著在酸性條件下，DCD 可能是通過同時(shí)抑制AOA 和AOB 來抑制硝化作用。這與Robinson 等[26]的結(jié)果相同，說明在不同石灰用量（即不同pH 條件下），DCD 主要通過抑制環(huán)境中的主導(dǎo)硝化微生物菌群的生長，從而抑制硝化過程。

4 結(jié) 論

通過短期土壤培養(yǎng)試驗(yàn)，本文研究了不同用量石灰和硝化抑制（DCD）對(duì)紅壤pH 和硝化作用的影響及其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：（1）施用石灰可以短期顯著提高紅壤的pH，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，石灰對(duì)紅壤 pH 的提高效果有逐漸降低的趨勢(shì)。施用DCD 可通過抑制硝化過程提高土壤pH，減緩?fù)寥浪峄唬?）紅壤表觀硝化率隨土壤pH 的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。在土壤pH 為6.9 左右時(shí)，表觀硝化率達(dá)到峰值。DCD 對(duì)硝化作用的抑制效果不受土壤pH 影響；（3）施用石灰提高紅壤pH，進(jìn)而增強(qiáng)硝化作用，其主要是由AOB 所主導(dǎo)。低pH（pH< 6.0）條件下，DCD 對(duì)AOA 和AOB 均有顯著抑制作用，而在高pH（pH 7.0～7.8）條件下，DCD 主要抑制AOB，而對(duì)AOA 的影響并不顯著。這些結(jié)果表明，在酸性紅壤上，石灰和DCD 相結(jié)合施用，不僅可以提高土壤pH，減緩?fù)寥浪峄?，而且可以抑制土壤硝化作用。上述研究結(jié)果為酸性紅壤改良利用和氮肥施用管理提供了理論支持。