平菇培養(yǎng)料發(fā)酵后對(duì)霉菌抑制機(jī)制研究

崔 筱，劉 芹，丁亞通，康源春，胡素娟，宋凱博，張玉亭，孔維麗

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營(yíng)養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，河南 鄭州 450002； 2.周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 周口 466000)

平菇在全球廣泛栽培，主產(chǎn)國(guó)在中國(guó)、日本、印度、德國(guó)、韓國(guó)、法國(guó)等，目前是我國(guó)栽培量最大、栽培范圍最廣的食用菌[1-2]。平菇栽培主要有生料、熟料、發(fā)酵料等幾種方式，幾種方式各有利弊[3]。生料栽培污染率高，菌絲吃料慢，在當(dāng)前生產(chǎn)中很少使用[4]；熟料栽培培養(yǎng)料要經(jīng)過100 ℃以上蒸煮滅菌和無菌接種過程，可減少污染率，提高菌袋成活率；發(fā)酵料栽培要求將培養(yǎng)料堆制8～10 d，料溫上升至70 ℃以上時(shí)，每間隔24～36 h翻堆一次，維持5～6 d，發(fā)酵結(jié)束后采用開放式接種，菌袋成功率在98%以上[5]，與生料、熟料栽培方式相比，發(fā)酵料栽培具有工藝簡(jiǎn)單、污染率極低、菌絲生長(zhǎng)快、生產(chǎn)效率高等一系列優(yōu)點(diǎn)，成為目前我國(guó)北方地區(qū)應(yīng)用最為廣泛的栽培方式。但是，將培養(yǎng)料經(jīng)簡(jiǎn)單發(fā)酵并采用開放式接種方法抗雜菌污染機(jī)制，及培養(yǎng)料在堆制過程中產(chǎn)生的生理生化反應(yīng)目前還不清楚。

前期研究表明，使用堆肥或者有機(jī)肥提取物可控制植物病原菌生長(zhǎng)[6-9]，其抑菌機(jī)制主要包括：病原菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)受到抑制；病原真菌菌絲發(fā)生皺縮；細(xì)胞質(zhì)泄漏；細(xì)胞膜通透性、丙二醇(MDA)、活性氧含量和抗氧化酶等與代謝及呼吸作用相關(guān)的酶活性發(fā)生一系列變化。平菇培養(yǎng)料在發(fā)酵過程中微生物種群的種類及演變與堆肥初期較為相似，然而，平菇培養(yǎng)料發(fā)酵后對(duì)霉菌菌絲及孢子萌發(fā)是否有影響，其抑制機(jī)制尚未見相關(guān)報(bào)道。鑒于此，通過玉米芯配制，經(jīng)10 d發(fā)酵，提取不同時(shí)期發(fā)酵料的浸提液，培養(yǎng)深綠木霉(Trichodermaatroviride)、灰綠青霉(Penicilliumglaucum)菌絲及孢子，隨后觀察、檢測(cè)發(fā)酵料浸提液對(duì)菌絲長(zhǎng)勢(shì)、菌絲生物量、孢子萌發(fā)率、細(xì)胞形態(tài)、琥珀酸脫氫酶(SDH)活性、三磷酸腺苷酶(ATP)活性、堿性磷酸酶(AKP)含量變化的影響，以期揭示抑菌機(jī)制，為平菇生產(chǎn)工藝的改進(jìn)和提高提供理論參考，為進(jìn)一步研究鑒定發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)及分離培養(yǎng)微生物奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 參試菌株及培養(yǎng)基 深綠木霉(T.atroviride)、灰綠青霉(P.glaucum)為從感染的菌袋上分離并測(cè)序鑒定的菌株。培養(yǎng)料配方：玉米芯84%、麩皮10%、尿素1%、石灰5%，料水比1∶2.4[5]。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g，蒸餾水定容至1 L，121 ℃滅菌30 min。發(fā)酵料浸提液培養(yǎng)基：發(fā)酵料浸提液1 L、瓊脂粉17 g，混合攪拌均勻后加熱溶解，分裝入250 mL錐形瓶中，115 ℃滅菌30 min，液體培養(yǎng)基為不加瓊脂粉。

1.1.2 主要試劑 瓊脂粉、SDH試劑盒、AKP試劑盒、ATP試劑盒，均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵料浸提液樣品的制備 按照文獻(xiàn)[10]的發(fā)酵方法，共堆制3組培養(yǎng)料，每組培養(yǎng)料干料質(zhì)量為250 kg，共發(fā)酵10 d。以建堆第1天的培養(yǎng)料為對(duì)照(T1)，每2 d翻堆一次，每翻堆一次取一次樣品，至發(fā)酵結(jié)束共翻堆4次，5次取樣分別標(biāo)記為T1、T2、T3、T4、T5。按照料堆形狀分別從左中右、上中下9個(gè)位點(diǎn)取樣1 kg，然后均勻混合為1份樣品。稱取不同時(shí)期玉米芯發(fā)酵料250 g，加蒸餾水定容至500 mL，靜置浸泡4 h后用4層紗布過濾，得到終質(zhì)量濃度為500 g/L的浸提液。

1.2.2 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響 利用T1、T2、T3、T4、T5 5個(gè)時(shí)期發(fā)酵料浸提液，按照90%體積分?jǐn)?shù)添加到PDA培養(yǎng)基內(nèi)制成固體培養(yǎng)基，用直徑5 mm的打孔器打取深綠木霉、灰綠青霉菌塊分別接種于90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每個(gè)處理重復(fù)3次，采用十字劃線法記錄菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=(對(duì)照組菌落半徑-處理組菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑×100%[10]。

1.2.3 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將1.2.1中終質(zhì)量濃度為500 g/L的發(fā)酵料浸提液，按照10%、20%、40%、80%、100%的體積分?jǐn)?shù)比例分別添加到PDA培養(yǎng)基內(nèi)制成固體培養(yǎng)基，分別接種深綠木霉、灰綠青霉菌種塊，每個(gè)處理重復(fù)3次，以不添加浸提液的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，3 d后觀察記錄菌絲生長(zhǎng)情況，采用十字劃線法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，并計(jì)算抑菌率，方法同1.2.2。

1.2.4 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌孢子萌發(fā)的影響 將濃度為106cuf/mL的深綠木霉、灰綠青霉孢子懸浮液，接種于含有不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液(80%、100%)的250 mL三角瓶?jī)?nèi)，每瓶裝100 mL浸提液，以清水為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，于28 ℃，150 r/min搖床培養(yǎng)26 h，26 h后于40倍光學(xué)顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子數(shù)/觀測(cè)孢子總數(shù)×100%。

孢子萌發(fā)抑制率=(對(duì)照組孢子萌發(fā)率-處理組孢子萌發(fā)率)/對(duì)照組孢子萌發(fā)率×100%。

1.2.5 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌菌絲生物量的影響 將100 mL不同體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵料浸提液(10%、20%、40%、80%、100%)加入到250 mL三角瓶?jī)?nèi)，每瓶分別接種5塊直徑為5 mm的深綠木霉、灰綠青霉菌塊，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，濾紙過濾后，收集菌絲體，60 ℃烘干后稱量，以不加浸提液的PDB培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 將直徑5 mm的深綠木霉、灰綠青霉菌塊接種到80%體積分?jǐn)?shù)浸提液的PDA固體培養(yǎng)基上，插片培養(yǎng)，以不含浸提液的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每組重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)48 h后，取菌絲體制作樣本，用透射電鏡、掃描電鏡觀察2種霉菌菌絲體細(xì)胞形態(tài)。

1.2.7 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌細(xì)胞內(nèi)AKP含量的影響 將深綠木霉、灰綠青霉的菌絲體用直徑5 mm打孔器打孔，接種于100 mL含有80%、100%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液的PDB培養(yǎng)基內(nèi)，以不加浸提液的PDB培養(yǎng)基為對(duì)照，每瓶接種5塊菌塊，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，每間隔12 h取樣1.5 mL,于4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄沉淀后取上清液，用AKP試劑盒檢測(cè)AKP含量。

1.2.8 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌SDH活性的影響 將深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌的菌絲體用直徑5 mm的打孔器打孔，分別接種于100 mL含有80%體積分?jǐn)?shù)、100%體積分?jǐn)?shù)浸提液的PDB培養(yǎng)基內(nèi)，以不加浸提液的PDB培養(yǎng)基為對(duì)照，每瓶接種5塊AKP，28 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，每隔12 h取樣1.5 mL，于4 ℃、12 000 r/min離心10 min后，棄上清收集菌絲體，快速組織細(xì)胞研磨儀研磨菌絲體，利用SDH試劑盒測(cè)定SDH活性。

1.2.9 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌ATP活性的影響 按照1.2.8中的方法，將深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌的菌絲體用直徑5 mm的打孔器打孔，分別接種于100 mL含有80%、100%體積分?jǐn)?shù)浸提液的PDB培養(yǎng)基內(nèi)，以不加浸提液的PDB培養(yǎng)基為對(duì)照，每瓶接種5塊AKP，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，每隔12 h取樣1.5 mL，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，收集菌絲體，用快速組織細(xì)胞研磨儀研磨菌絲體后，超微量ATP試劑盒測(cè)定ATP活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響

2.1.1 發(fā)酵料浸提液對(duì)2種霉菌菌絲體生長(zhǎng)的影響 在發(fā)酵T1～T5周期內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵料浸提液對(duì)深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌菌絲的抑菌率逐漸升高，T4時(shí)期抑菌率達(dá)到最高，分別為100%、97.9%，較T1、T2、T3、T5時(shí)期分別高39.9、30.5、18.3、8.0個(gè)百分點(diǎn),41.6、25.4、19.7、3.0個(gè)百分點(diǎn)。發(fā)酵結(jié)束后，隨著培養(yǎng)料浸提液體積分?jǐn)?shù)的增加抑菌作用逐漸增強(qiáng)，體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，對(duì)深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌菌絲的抑菌率分別為81.1%、75.9%，但80%、100%體積分?jǐn)?shù)對(duì)2種菌絲抑菌率沒有差異(圖1a、b)。

圖1 不同體積分?jǐn)?shù)(a)和不同發(fā)酵時(shí)期(b)發(fā)酵料浸提液對(duì)深綠木霉、灰綠青霉菌絲的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of different concentrations(a) and different fermentation stages(b) of fermentation extract on T.atroviride and P.glaucum mycelium

2.1.2 發(fā)酵料浸提液對(duì)2種霉菌孢子萌發(fā)的影響 從表1可以看出，無菌水處理后，灰綠青霉、深綠木霉孢子的萌發(fā)率分別為87.6%、91.7%。與對(duì)照相比，體積分?jǐn)?shù)為80%的無菌發(fā)酵料浸提液處理時(shí)，2種霉菌孢子萌發(fā)率分別為26.2%、15.2%，抑制率分別為61.4%、75.3%；當(dāng)用100%體積分?jǐn)?shù)無菌發(fā)酵料浸提液處理時(shí)，2種霉菌孢子的萌發(fā)率分別為12.3%、3.6%，抑制率分別為76.5%、88.1%。發(fā)酵料浸提液對(duì)2種霉菌孢子萌發(fā)有顯著的抑菌作用，隨浸提液濃度增加，抑制作用增強(qiáng)，100%體積分?jǐn)?shù)較80%體積分?jǐn)?shù)抑制率分別高12.8、15.1個(gè)百分點(diǎn)(表1)。

表1 發(fā)酵料浸提液對(duì)深綠木霉、灰綠青霉孢子萌發(fā)的影響Tab.1 Effect of fermentation extract on spore germination of T.atroviride and P.glaucum %

2.1.3 發(fā)酵料浸提液對(duì)2種霉菌菌絲生物量的影響 不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液對(duì)深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌菌絲體的生物量積累有顯著抑制作用，不同處理間差異顯著，隨浸提液濃度的增加，菌絲生物量逐漸減少(表2)。當(dāng)發(fā)酵料浸提液體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，深綠木霉、灰綠青霉菌絲生物量最少，分別為2.2、2.3 mg/mL，較對(duì)照分別減少4.3、4.2 mg/mL，減少率分別為66.2%、64.6%(表2)，較80%時(shí)分別減少1.7、1.2 mg/mL，減少率為43.6%、34.3%。

表2 不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液對(duì)深綠木霉、灰綠青霉菌絲生物量的影響Tab.2 Effects of fermentation extracts at different concentration on the mycelial biomass of

2.2 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌細(xì)胞的影響

2.2.1 發(fā)酵料浸提液對(duì)2種霉菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響 掃描電鏡結(jié)果表明，加有80%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液的培養(yǎng)基培養(yǎng)后，菌絲細(xì)胞壁皺褶萎縮。未經(jīng)處理的深綠木霉菌絲細(xì)胞壁、細(xì)胞膜完整光滑，線粒體、液泡、核糖體完整，細(xì)胞質(zhì)均勻，內(nèi)容物豐富，孢子飽滿，菌絲直徑粗細(xì)均勻；發(fā)酵料浸提液處理后的木霉菌絲細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破裂，線粒體、液泡膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外流，正常生長(zhǎng)受阻(圖2a、b)。對(duì)照組灰綠青霉菌絲細(xì)胞邊緣光滑，液泡、細(xì)胞質(zhì)、核糖體、線粒體完整，細(xì)胞內(nèi)容物豐富均勻；發(fā)酵液處理后的青霉菌絲細(xì)胞壁邊緣粗糙，隔膜斷裂，液泡、線粒體膜破裂，核糖體分布不均勻；內(nèi)容物減少(圖3a、b)。

CW:細(xì)胞壁;V:液泡;CY:細(xì)胞質(zhì);M:線粒體;H:菌絲CW:Cell wall;V:Vacuole;CY:Cytoplasm;M:Mitochondria;H:Hypha圖2 80%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液處理前后深綠木霉菌絲(a)及菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)(b)的變化Fig.2 Morphological(a) and ultrastructural(b) changes of T.atroviride mycelium treated with 80% concentration of extract liquid

2.2.2 發(fā)酵料浸提液對(duì)2種霉菌細(xì)胞內(nèi)AKP含量的影響 AKP是存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的一種酶，正常情況下，該酶不能透過細(xì)胞壁或細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞外，當(dāng)細(xì)胞壁或細(xì)胞膜遭受到一定程度的破壞后，細(xì)胞透性增加，AKP會(huì)大量滲透到細(xì)胞外，結(jié)果表明，不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液培養(yǎng)后，深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌菌懸液中AKP含量明顯高于對(duì)照，100%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液處理的2種霉菌菌絲體AKP含量高于80%體積分?jǐn)?shù)處理的霉菌菌絲，對(duì)照組AKP含量變化趨勢(shì)不顯著；不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液培養(yǎng)木霉菌絲，培養(yǎng)液中AKP含量持續(xù)上升，48 h時(shí)，80%、100%體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)液中AKP含量分別較對(duì)照增加255.6%、333.3%；青霉菌絲培養(yǎng)液中AKP含量在24 h后迅速增加，80%、100%體積分?jǐn)?shù)浸液培養(yǎng)48 h時(shí)AKP含量較24 h分別增加320.0%、371.4%，較對(duì)照分別增加320.0%和560.0%(圖4a、b)。

CW:細(xì)胞壁;V:液泡;CY:細(xì)胞質(zhì);S:隔膜;M:線粒體CW:Cell wall;V:Vacuole;CY:Cytoplasm;S:Septum;M:Mitochondria圖3 80%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液處理前后灰綠青霉菌絲(a)及菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)(b)的變化Fig.3 Morphological (a) and ultrastructural (b) changes of P.glaucum mycelium treated with 80% concentration of extract liquid

圖4 發(fā)酵料浸提液處理不同時(shí)間對(duì)深綠木霉(a)、灰綠青霉(b)菌絲AKP含量的影響Fig.4 Effects of fermentation broth treatment at different time on AKP enzyme content of T.atroviride(a) and P.glaucum(b) hyphae

2.3 發(fā)酵料浸提液對(duì)霉菌代謝的影響

2.3.1 發(fā)酵料浸提液對(duì)2種霉菌SDH活性的影響 SDH是結(jié)合于線粒體內(nèi)膜上，連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一，可以為真核細(xì)胞線粒體需氧和產(chǎn)能的呼吸鏈提供電子，是線粒體的一種標(biāo)志性酶。由圖5a、b可知，不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液處理后深綠木霉、灰綠青霉SDH活性低于對(duì)照，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組SDH活性升高，不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液處理后2種霉菌菌絲體SDH活性降低，80%體積分?jǐn)?shù)處理SDH活性高于100%體積分?jǐn)?shù)處理，80%、100%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液處理木霉菌絲后，SDH活性呈下降趨勢(shì)，48 h降至最低，分別為12.4、8.1 U/mg，較初始活性分別下降26.6%、49.1%；80%、100%體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵料浸提液處理青霉菌絲后，SDH活性先升高后下降，24 h至最高，分別為24.1、22.3 U/mg，隨后開始下降，48 h降至最低，分別為15.9、10.3 U/mg，較24 h分別下降34.0%、53.8%。

圖5 發(fā)酵料浸提液處理不同時(shí)間對(duì)深綠木霉(a)、灰綠青霉(b)菌絲SDH活性的影響 Fig.5 Effect of fermentation broth treatment at different time on SDH enzyme activity of T.atroviride(a) and P.glaucum(b) hyphae

2.3.2 發(fā)酵料浸提液對(duì)2種霉菌ATP活性的影響 ATP活性與菌絲的生長(zhǎng)能量代謝關(guān)系密切。由圖6a、b可知，48 h培養(yǎng)過程中，深綠木霉菌絲ATP活性呈先上升后下降趨勢(shì)，36 h達(dá)到最高，為5.2 U/mg，80%、100%體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵料浸提液處理后的木霉菌絲ATP活性先下降后略有回升，且低于初始ATP活性，48 h升至3.3、1.9 U/mg，較對(duì)照降低15.4%、51.3%；灰綠青霉菌絲ATP活性呈先上升后下降趨勢(shì)，2組處理的ATP活性均低于對(duì)照組，80%體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵料浸提液處理后青霉菌絲ATP活性高于100%體積分?jǐn)?shù)處理，隨發(fā)酵料浸提液濃度增加，酶活性下降，對(duì)照組ATP活性在36 h升至最高，為4.3 U/mg，80%、100%體積分?jǐn)?shù)的發(fā)酵料浸提液處理后24 h升至最高，分別為2.3、1.9 U/mg，較對(duì)照組分別減少46.5%、55.8%，隨后酶活性下降，48 h降至最低。

圖6 發(fā)酵料浸提液處理不同時(shí)間對(duì)深綠木霉(a)、灰綠青霉(b)菌絲ATP活性的影響Fig.6 Effect of fermentation broth treatment at different time on ATP enzyme activity of T.atroviride (a) and P.glaucum(b) hyphae

3 結(jié)論與討論

木霉菌、青霉菌等是危害平菇菌絲體的主要雜菌，大量的青霉、木霉孢子飄散在平菇、蘑菇栽培場(chǎng)地上空，以尋找合適的環(huán)境生長(zhǎng)繁殖[11]，研究表明，這些雜菌被認(rèn)為是蘑菇大量減產(chǎn)的主要原因[12]。目前，在食用菌生產(chǎn)過程中綠色木霉等雜菌的防治主要采用化學(xué)殺菌劑，由于平菇等真菌與病原真菌的親緣關(guān)系較近，化學(xué)藥劑防治雜菌防治效果并不十分理想且容易造成環(huán)境污染[13]，因此，食用菌的病害防治比其他農(nóng)作物的病蟲害防治困難。有報(bào)道認(rèn)為，培養(yǎng)料經(jīng)堆制發(fā)酵后能降低雜菌污染，提高食用菌產(chǎn)量。吳小平等[14]用木屑發(fā)酵料栽培毛木耳，能大幅度降低霉菌污染，但并沒有揭示其抑菌機(jī)制。本研究以玉米芯為原料發(fā)酵后制備浸提液，系統(tǒng)研究其對(duì)霉菌的抑菌機(jī)制，結(jié)果表明，發(fā)酵后培養(yǎng)料浸提液通過破壞其細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)溶物外流，降低與代謝、呼吸相關(guān)酶活性，從而抑制雜菌的生長(zhǎng)繁殖。發(fā)酵料浸提液隨體積分?jǐn)?shù)增加抑菌率也增加，體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，對(duì)深綠木霉、灰綠青霉菌絲的抑菌率分別為81.1%、75.9%，孢子萌發(fā)抑制率分別為88.1%、76.6%，菌絲生物量分別較對(duì)照減少4.3、4.2 mg/mL；經(jīng)掃描電鏡、透射電鏡觀察，灰綠青霉菌絲細(xì)胞壁邊緣粗糙，隔膜斷裂，深綠木霉菌絲細(xì)胞壁、細(xì)胞膜破裂，液泡、線粒體膜破裂，核糖體分布不均勻，細(xì)胞內(nèi)容物減少，導(dǎo)致AKP外流，發(fā)酵料浸提液內(nèi)AKP含量分別高于對(duì)照330.0%、560.0%；與呼吸相關(guān)的SDH活性分別下降49.1%、53.8%；與代謝相關(guān)的ATP活性分別較對(duì)照低51.3%、55.8%，從而阻止雜菌的生長(zhǎng)，為后期平菇栽培提供優(yōu)良環(huán)境。

大量研究表明，化學(xué)試劑(多菌靈、甲基硫菌靈、苯菌靈等)、植物源農(nóng)藥(魚藤酮、苦參堿等)、殼聚糖類、生防菌等對(duì)霉菌病原菌的抑菌機(jī)制主要是破壞病原菌的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁，從而影響與病原菌呼吸、代謝相關(guān)的酶活性，最終抑制病原菌產(chǎn)生孢子及孢子萌發(fā)。本研究中，高溫滅菌后的發(fā)酵料浸提液既抑制深綠木霉、灰綠青霉孢子萌發(fā)，又抑制菌絲生長(zhǎng)。推斷發(fā)酵過程中微生物的代謝產(chǎn)生了某種抑菌活性物質(zhì)破壞了深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌細(xì)胞的完整性，無菌發(fā)酵料浸提液濃度越大，抑制效果越明顯，說明抑制活性與其產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)的量呈正相關(guān)，與劉芹等[15]研究的隨長(zhǎng)根菇多糖濃度增加對(duì)青霉的抑制作用增強(qiáng)一致。

細(xì)胞膜的完整性是維持菌體正常生長(zhǎng)代謝的一個(gè)主要影響因素。核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)貫穿于整個(gè)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，是維持生命活動(dòng)最重要的物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵料浸提液破壞了深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致AKP外流，從而影響菌絲體生長(zhǎng)，與王艷玲等[16]研究的Pseudomonassp. YL11抑制擴(kuò)展青霉結(jié)果一致。SDH在真核生物中是線粒體的一種標(biāo)志酶，ATP是生物膜上與能量代謝相關(guān)的酶。發(fā)酵料浸提液處理后，深綠木霉、灰綠青霉2種霉菌的SDH活性、ATP活性降低，與Pseudomonassp.YL11處理中SDH、ATP活性降低、抑制擴(kuò)展青霉結(jié)果總體趨勢(shì)一致。但是深綠木霉、灰綠青霉菌絲SDH、ATP活性變化與擴(kuò)展青霉在對(duì)照組培養(yǎng)液內(nèi)酶活性變化趨勢(shì)有差異，推測(cè)與不同的霉菌種屬有關(guān)。發(fā)酵料浸提液通過影響能量代謝及生物合成從而抑制了菌體的生長(zhǎng)，與黃現(xiàn)青等[17]報(bào)道的枯草芽孢桿菌fmbJ代謝產(chǎn)物會(huì)降低點(diǎn)青霉SDH活性結(jié)果一致。

LOFFREDO等[18]發(fā)現(xiàn)，橄欖油廠廢水污泥與木屑堆肥中含有的腐植酸和富里酸能抑制核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)菌絲的生長(zhǎng)，是否抑制霉菌需要進(jìn)一步驗(yàn)證，以水稻稻稈和油棕果實(shí)廢棄物為原料的堆肥高溫滅菌液含有大分子質(zhì)量、熱穩(wěn)定且非蛋白質(zhì)類的化學(xué)物質(zhì)或微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)草莓黃萎病菌具有顯著的抑制作用。推斷玉米芯發(fā)酵后浸提液中存在一些大分子、熱穩(wěn)定且非蛋白質(zhì)類的化學(xué)物質(zhì)或微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，腐植酸和富里酸是否抑制青霉、木霉的生長(zhǎng)、是否含有長(zhǎng)根菇多糖成分需要進(jìn)一步分析檢測(cè)。本研究將會(huì)繼續(xù)篩選分析發(fā)酵料浸提液有效抑菌物質(zhì)成分，開發(fā)相應(yīng)的抑菌制劑，探索發(fā)酵抑菌最佳條件，制定平菇培養(yǎng)料發(fā)酵料技術(shù)規(guī)程，提高發(fā)酵效率，從而提高產(chǎn)量。