秈稻品種Y兩優(yōu)886高氮素利用效率機制研究

祁雪姣，謝乾坤，謝雨欣，梁曉婭，李俊周，孫虎威

(河南農(nóng)業(yè)大學 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省水稻生物學重點實驗室，河南 鄭州 450046)

水稻是全世界主要的糧食作物之一，世界上近一半的人口以稻米為主糧。水稻的生長發(fā)育需要多種營養(yǎng)元素，而氮素尤為重要，由于水稻生長發(fā)育對氮需求量較大，因此，氮缺乏是限制水稻生長的主要因素。在田間生長過程中，土壤肥力是水稻獲得高產(chǎn)最重要的保障，而土壤大多存在氮素缺乏、肥力不足的狀況，這種狀況嚴重制約了作物的生長。因此，施氮成為提高作物產(chǎn)量的主要途徑。由于我國水稻氮素利用率較低，因此氮肥施用量遠遠高于世界平均水平[1]。在過去的數(shù)年里，我國主要農(nóng)作物氮肥利用效率有所回升，但是相對于發(fā)達國家而言仍然偏低[2]。氮肥施用量過多、氮肥利用率低下和損失嚴重以及由此產(chǎn)生的環(huán)境問題成了目前農(nóng)業(yè)和資源與環(huán)境領(lǐng)域非常突出的問題。因此，充分挖掘水稻本身高效吸收利用氮素的機制，培養(yǎng)氮高效品種至關(guān)重要。

一氧化氮是一種氣體分子物質(zhì)，它廣泛存在于動植物體內(nèi)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮不僅可以作為第二信使參與動物生理代謝活動，而且在植物體內(nèi)還是一種重要的信號分子[8]。研究表明，在氮缺乏和銨硝混合條件下，水稻根系能夠通過一氧化氮合酶和硝酸還原酶途徑大量合成一氧化氮，一氧化氮能夠調(diào)控水稻根系生長，并通過上調(diào)氮轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達量來提高水稻對氮素的吸收[9-10]。

與粳稻相比，秈稻具有更高的氮素利用效率，近年來在秈稻中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多個氮素高效利用基因，如NRT1.1b[11]、GRF4[12]。秈稻的氮轉(zhuǎn)運基因NRT1.1b能夠調(diào)控水稻氮素吸收利用效率[11]，而GRF4基因調(diào)控多個氮吸收和同化基因的表達，進而提高水稻氮素利用效率[12]。目前，關(guān)于秈稻氮素高效利用的研究主要集中在這些氮高效利用基因的功能挖掘方面[11-12]，而能夠調(diào)控水稻氮素高效利用的信號分子一氧化氮在秈稻氮素高效利用過程中的作用及其調(diào)控機制尚不清楚。Y兩優(yōu)886是以光溫敏不育系Y88S作為母本、恢復系益恢66作父本組配育成的兩系雜交秈稻品種，該品種抗病性強、穩(wěn)產(chǎn)性好，米質(zhì)優(yōu)良、氮素利用率高[13-14]。為此，以粳稻品種日本晴和秈稻品種Y兩優(yōu)886為試材，在水培和土培條件下對2個水稻品種進行不同氮濃度處理，測定其生物量、株高、氮含量、根系形態(tài)、根系一氧化氮含量以及氮轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達水平，以揭示秈稻品種Y兩優(yōu)886高效利用氮素的機制。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及生長條件

供試水稻品種為粳稻日本晴和秈稻Y兩優(yōu)886。

水培試驗：種子經(jīng)30% H2O2消毒30 min，在清水中育苗7 d，選擇地上部及根系大小形態(tài)均一致的幼苗，然后移栽至全濃度修正營養(yǎng)液中進行氮處理，即正常供氮(1.25 mmol/L NH4NO3)和低氮(0.1 mmol/L NH4NO3)處理，每個處理5個重復，試驗時每2 d換一次營養(yǎng)液，處理14 d后收獲植株，進行相關(guān)指標的測定。

土培試驗：試驗地點為河南農(nóng)業(yè)大學龍子湖校區(qū)認知園基地，土培處理采用盆栽，水稻四葉一心時進行插秧，設(shè)置2個氮濃度處理，正常供氮處理：尿素(含N 14%)0.326 0 g/kg；低氮處理：尿素0.065 2 g/kg。每個盆內(nèi)裝干土10 kg，每個處理設(shè)置5個重復。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 株高及側(cè)根密度 灌漿期，用刻度尺測量土培處理的水稻株高。氮處理14 d后，用刻度尺測量水培處理種子根長，裸眼數(shù)出種子根上的側(cè)根數(shù)(≥0.5 mm)，計算出種子根上的側(cè)根密度，側(cè)根密度=側(cè)根數(shù)/種子根長。

1.2.2 生物量及總氮含量 灌漿期，取土培處理的水稻植株地上部，稱取鮮質(zhì)量。將水培試驗中氮處理7 d的水稻單株分成地上部和根系兩部分，烘干后稱干質(zhì)量。然后稱取烘干磨碎的地上部和根系樣品0.05 g左右至100 mL消化管中，濃H2SO4-H2O2高溫消煮至清亮，冷卻后定容。利用流動分析儀(型號AAA3 )測定總氮含量[15]。

1.2.3 一氧化氮水平 采用一氧化氮特異性染料DAF-FM DA對水培試驗中氮處理7 d的水稻根系進行染色，然后在熒光顯微鏡下進行觀察。水稻根系浸泡在20 mmol/L HEPES-NaOH 緩沖液(包含10 μmol/L DAF-FM DA)(pH值7.5)中，于黑暗條件下靜置30 min，根系用新鮮的緩沖液清洗3次，使用熒光體式顯微鏡(Olympus Optical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan)進行觀察，彩色CCD相機進行拍照，熒光體視顯微鏡的激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為495～575 nm(OLYMPUS MVX10)。綠色熒光信號值通過Photoshop軟件進行量化[16]。

1.3 水稻總RNA提取與實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

采集水培試驗中氮處理7 d的水稻根系樣品，立即凍存于液氮中，保存于-70 ℃冰箱，采用Trizol法提取RNA。cDNA合成采用Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，然后進行氮轉(zhuǎn)運相關(guān)基因(OsAMTs、OsNRTs和OsNARs)的表達分析，引物見表1。qRT-PCR采用Transgen公司的qPCR SuperMix試劑盒。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA稀釋20倍作為反應(yīng)模板。20 μL的反應(yīng)體系：2×qPCR SuperMix 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 模板5 μL，ddH2O 4 μL。qRT-PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。OsACTIN作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計算相對表達量。

表1 基因的qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR of genes

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進行ANVOA方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮濃度處理對水稻生物量的影響

由圖1可知，在水培條件下，與日本晴相比，低氮條件下Y兩優(yōu)886地上部干質(zhì)量顯著增加37%，根系干質(zhì)量顯著增加 47%；正常供氮條件下，Y兩優(yōu)886地上部干質(zhì)量顯著增加33%。在土培條件下，與日本晴相比，Y兩優(yōu)886在低氮條件下株高顯著增加11%，地上部干質(zhì)量顯著增加77%；在正常供氮條件下，株高顯著增加17%，地上部干質(zhì)量顯著增加76%(圖2)。這些結(jié)果表明，無論在低氮還是正常供氮處理條件下，Y兩優(yōu)886具有較高的物質(zhì)積累能力。

a、b分別為不同供氮水平下日本晴、Y兩優(yōu)886表型；c、d分別為低氮、正常供氮水平下不同水稻品種地上部干質(zhì)量； e、f分別為低氮、正常供氮水平下不同水稻品種根系干質(zhì)量。*表示品種間在0.05水平上差異顯著，下同 a,b represent phenotype of Nipponbare and Yliangyou 886 under different N concentrations; c,d represent dry weight of shoot of different rice varieties under low N concentration and normal N concentration respectively; e,f,represent dry weight of root of different rice varieties under low N concentration and normal N concentration respectively. * indicates significant difference between varieties at 0.05 level，the same below圖1 水培條件下不同氮水平對水稻生物量的影響 Fig.1 Effects of different nitrogen levels on biomass of rice under hydroponics condition

a為不同供氮水平下日本晴和Y兩優(yōu)886表型；b、c分別為正常供氮、低氮水平下不同水稻品種株高； d、e分別為正常供氮、低氮水平下不同水稻品種地上部鮮質(zhì)量 a represents phenotype of Nipponbare and Yliangyou 886 under different N concentrations; b,c represent plant height of different rice varieties under normal N concentration and low N concentration respectively；d,e represent fresh weight of shoot of different rice varieties under normal N concentration and low N concentration respectively圖2 土培條件下不同氮水平對水稻株高和生物量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen levels on shoot height and biomass of rice under soil culture

2.2 不同氮濃度處理對水稻總氮含量的影響

為了研究不同氮濃度處理對水稻體內(nèi)總氮含量的影響，檢測日本晴與Y兩優(yōu)886地上部和根系中的總氮含量。結(jié)果(圖3)發(fā)現(xiàn)，與日本晴相比，Y兩優(yōu)886在低氮條件下地上部總氮含量顯著增加14%；在正常供氮條件下，地上部總氮含量顯著增加7%；正常供氮和低氮條件下，Y兩優(yōu)886根系總氮含量均與日本晴無顯著差異。這些結(jié)果表明，在低氮條件下，Y兩優(yōu)886有較高的氮素吸收利用效率。

a、b分別為低氮水平下日本晴和Y兩優(yōu)886地上部、根系總氮含量；c、d分別為正常供氮水平下日本晴和Y兩優(yōu)886地上部、根系總氮含量 a,b represent total N contents of shoots and roots of Nipponbare and Yliangyou 886 under low N concentration respectively; c,d represent total N contents of shoots and roots of Nipponbare and Yliangyou 886 under normal N concentration respectively圖3 水培條件下不同氮水平對水稻總氮含量的影響 Fig.3 Effects of different nitrogen levels on total nitrogen content of rice under hydroponics condition

2.3 不同氮濃度處理對水稻側(cè)根密度的影響

因為側(cè)根是作物吸收利用氮素的主要器官，因此，分析了不同氮濃度處理下日本晴與Y兩優(yōu)886側(cè)根密度的差異。結(jié)果(圖4)表明，與日本晴相比，無論在低氮還是正常供氮條件下，Y兩優(yōu)886的側(cè)根密度均沒有發(fā)生顯著變化，說明Y兩優(yōu)886可能并不通過增加側(cè)根數(shù)量來提高對氮素的利用效率。

2.4 不同氮濃度處理對水稻根系一氧化氮水平的影響

研究表明，根系中的一氧化氮能夠提高水稻對氮素的吸收效率[9]。因此，本研究檢測了日本晴與Y兩優(yōu)886根尖的一氧化氮水平。結(jié)果(圖5)發(fā)現(xiàn)，與日本晴相比，Y兩優(yōu)886在低氮條件下根尖的一氧化氮水平顯著增加 46%；在正常供氮條件下，Y兩優(yōu)886根尖的一氧化氮水平顯著增加1.3倍。這些結(jié)果表明，在低氮和正常供氮條件下，Y兩優(yōu)886可能通過增加根系中的一氧化氮水平來提高對氮素的利用效率。

a、b分別為不同供氮水平下日本晴、Y兩優(yōu)886根系形態(tài)；c、d分別為低氮、正常供氮水平下不同水稻品種的側(cè)根密度 a,b represent root morphology of Nipponbare and Yliangyou 886 under different N concentration respectively; c,d represent lateral root density of different rice varieties under low N concentration and normal N concentration respectively圖4 水培條件下不同氮水平對水稻根系形態(tài)和側(cè)根密度的影響Fig.4 Effects of different nitrogen levels on root morphology and lateral root density of rice under hydroponics condition

a：不同供氮水平下日本晴和Y兩優(yōu)886根尖一氧化氮綠色熒光；b：不同供氮水平下日本晴和Y兩優(yōu)886根尖一氧化氮相對熒光強度 a：NO production shown as green fluorescence in root tip of Nipponbare and Yliangyou 886 under different N concentration; b：NO production in the root tips expressed as relative fluorescence intensity in Nipponbare and Yliangyou 886 under different N concentration圖5 不同氮水平對水稻根系一氧化氮水平的影響 Fig.5 Effects of different nitrogen levels on nitric oxide levels in rice

2.5 不同氮濃度處理對水稻根系中氮轉(zhuǎn)運基因表達量的影響

為了進一步證實Y兩優(yōu)886對氮素利用率高的原因，研究了不同氮濃度處理下日本晴與Y兩優(yōu)886根系中氮轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達量(圖6)。結(jié)果表明，與日本晴相比，在低氮條件下，Y兩優(yōu)886根系中OsAMT2.3、OsNRT2.1、OsNRT2.3a、OsNRT2.4和OsNAR2.1基因表達量顯著升高；在正常供氮條件下，Y兩優(yōu)886根系中OsNRT2.1、OsNRT2.3a和OsNRT2.4基因表達量顯著升高。說明Y兩優(yōu)886可能通過增加根系中一氧化氮水平來提高這些基因的表達量，進而提高對氮素的吸收利用。

a： 低氮水平下日本晴和Y兩優(yōu)886根系中氮轉(zhuǎn)運基因相對表達量；b： 正常供氮水平下日本晴和Y兩優(yōu)886根系中氮轉(zhuǎn)運基因相對表達量a:The relative expression levels of N transport genes under low N concentration; b：The relative expression levels of N transport genes under sufficient N concentration圖6 不同氮水平對水稻氮轉(zhuǎn)運基因表達量的影響Fig.6 Effects of different nitrogen levels on nitrogen transport gene expression levels in rice

3 結(jié)論與討論

氮是限制植物生長的主要因素，是作物生長所依靠的主要肥力要素[17]。鑒于目前全球人口大量增加所造成的糧食壓力[18]，在較低農(nóng)業(yè)投入的同時獲得較高的養(yǎng)分吸收效率是全球科學家的主要目標[17,19]。在氮缺乏條件下，植物形態(tài)的可塑性最重要的作用是提高氮素的利用率，它們通過改變根系形態(tài)來獲得最大的養(yǎng)分吸收能力[17]。硝態(tài)氮能夠通過調(diào)控側(cè)根的生長來影響根系的發(fā)育，這主要是通過硝態(tài)氮的分布和內(nèi)源的濃度決定[20]。

一氧化氮作為一種信號分子參與到植物根系生長發(fā)育過程[21-23]。硝酸還原酶和L-精氨酸途徑是植物體內(nèi)2條重要的一氧化氮合成途徑[24]。使用動物一氧化氮合酶(NOS)抑制劑進行的試驗結(jié)果表明，植物體內(nèi)似乎存在L-精氨酸途徑[21,25]。與野生型擬南芥相比，noa1突變體根系內(nèi)的一氧化氮水平顯著降低[16,26]。研究表明，與單獨供應(yīng)銨態(tài)氮相比，在銨硝混合供氮條件下，氮高效水稻品種的根系能夠通過硝酸還原酶途徑產(chǎn)生大量的一氧化氮，且一氧化氮能夠促進其側(cè)根的發(fā)生，進而促進水稻的生長發(fā)育、氮素吸收和積累，而氮低效水稻品種在銨硝處理條件下則不能大量合成一氧化氮，從而不能提高氮素的利用效率[9,27]。在低氮脅迫誘導一氧化氮產(chǎn)生的過程中，一氧化氮合酶途徑比硝酸還原酶途徑更重要，且低氮條件下產(chǎn)生的一氧化氮參與了根系的伸長[10,21]。這些結(jié)果證實，大量產(chǎn)生的一氧化氮能夠促進水稻對氮素的高效利用。

在本研究中，與日本晴相比，Y兩優(yōu)886在不同氮濃度條件下均具有較大的生物量，且地上部總氮含量顯著升高，說明Y兩優(yōu)886比日本晴的氮素利用率更高。而對根系的研究表明，與日本晴相比，Y兩優(yōu)886的側(cè)根密度并沒有發(fā)生顯著變化，說明Y兩優(yōu)886可能不通過增加側(cè)根密度來提高對氮素的吸收利用。通過檢測水稻根尖一氧化氮水平發(fā)現(xiàn)，Y兩優(yōu)886無論在低氮還是正常供氮條件下，根尖的一氧化氮水平均顯著高于日本晴，且多個氮轉(zhuǎn)運基因的表達量顯著升高。這些結(jié)果表明，Y兩優(yōu)886可能通過增加一氧化氮水平來提高這些基因的表達量，進而提高對氮素的吸收利用。本研究也在一定程度上揭示了秈稻Y兩優(yōu)886氮素利用率高的原因。