蛋白激酶SAPK2響應水稻缺鉀脅迫的機制研究

婁燈吉，陳 禎，李沁妍，陳 琴，趙秋紅，楊曉艷，余迪求

(1.玉溪師范學院 化學生物與環(huán)境學院/云南省高校滇中道地藥材研究重點實驗室,云南 玉溪 653100；2.昆明理工大學 生命科學與技術學院,云南 昆明 650500；3.云南大學 云南省生物資源保護與利用國家重點實驗室,云南 昆明 650091)

在植物的營養(yǎng)生長階段和生殖生長階段都需要鉀(K)元素。一般來說，植物細胞質(zhì)中的K濃度保持在100 mmol/L左右，以維持各種生理和生化代謝過程的順利進行[1]。植物受到低K或缺K脅迫信號時，首先被根系表皮細胞的質(zhì)膜(Plasma membrane)所感知，然后傳遞到細胞中，植物體會產(chǎn)生一系列的生理生化反應來應對K逆境脅迫[2]。短時間缺K，植物在開始的幾個小時內(nèi)最明顯的特征就是細胞膜電位的改變和ROS(Reactive oxygen species)產(chǎn)生等[3]。盡管細胞外的K濃度低，短期缺K時細胞內(nèi)的K濃度不會有太大變化，但是長期缺K會導致細胞內(nèi)的K濃度顯著降低，植物會出現(xiàn)典型的缺K癥狀，一些代謝活動也會受到抑制[4]。

K是影響水稻(Oryzasativa)產(chǎn)量和品質(zhì)的關鍵因子之一，由于我國K肥資源匱乏，且長期高密度種植，造成土壤缺K現(xiàn)象越來越嚴重，這一情況已嚴重制約我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展和糧食安全。20世紀60年代，研究人員對大麥K吸收動力學進行研究，提出了植物K吸收的2種機制：機制Ⅰ和機制Ⅱ。其中，機制Ⅰ在K濃度極低(≤0.2 mmol/L)條件下起作用，因此被稱為高親和性K吸收系統(tǒng)；機制Ⅱ在高K濃度(≥1 mmol/L)條件下起作用，被稱為低親和性K吸收系統(tǒng)。2002年BAFIUELOS等[5]報道了KUP/HAK/KT(K+uptake permeases/high-affinity K+transporter/K+transporter)家族的17個成員(OsHAK1—OsHAK17)，此后，又發(fā)現(xiàn)了10個成員(OsHAK18—OsHAK27)[6]。研究表明，在缺K和鹽脅迫下，OsHAK1—OsHAK17在不同程度上受缺K和鹽脅迫誘導表達，其中OsHAK1、OsHAK7、OsHAK16上調(diào)表達較明顯[5]。

SnRK(Sucrose non-fermenting1-related protein kinase )在植物激素信號傳導、逆境脅迫響應和生長發(fā)育調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮重要作用[7-10]，其中SnRK2可通過激活離子通道蛋白KAT1(Potassium channel 1)、SLAC1(Slow anion channel 1)來響應滲透脅迫和ABA[7,9]。植物SnRK家族可以分為3個亞家族:SnRKl、SnRK2和SnRK3[11]。水稻基因組中有10個SnRK2成員，命名為SAPKs(Osmotic stress/ABA-activated protein kinases)，依次是SAPK1—SAPK10，可分為3個亞家族，SnRK2Ⅰ包含SAPK4—SAPK7，SnRK2Ⅱ包含SAPK1—SAPK3，SnRK2Ⅲ包含SAPK8—SAPK10[12]。許多研究表明，SnRK2Ⅰ和SnRK2Ⅲ在水稻逆境脅迫和生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[13-15]。對于水稻中SnRK2 Ⅱ相關基因的研究相對較少，SAPK2是水稻SnRK2 Ⅱ亞家族成員，并且是擬南芥中SnRK2.7和SnRK2.8的同源基因，其生物學功能和作用機制相關信息較匱乏。KIM等[16]研究發(fā)現(xiàn)，SAPK2與OsPYL/RCAR5(Pyrabactin resistance-like/regulatory component of ABA receptor 5)互作，超表達OsPYL/RCAR5基因的轉(zhuǎn)基因水稻種子萌發(fā)和萌發(fā)后生長階段對ABA敏感。最近的研究表明，OsbZIP23(Basic region-leucine zipper 23)和OsbZIP46都可以被SAPK2、6、9磷酸化并提高水稻抗旱性[17-18]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，SAPK2在水稻干旱脅迫和ABA條件下作為正調(diào)控因子發(fā)揮作用[19]。 UMEZAWA等[20]報道，SAPK2基因在擬南芥中的同源基因SnRK2.8，在K元素缺乏的條件下表達量下調(diào)，參與鉀元素的代謝過程。但關于SAPK2基因是否參與水稻中K元素代謝的報道至今未見。為此，對SAPK2基因在水稻缺N、P、K元素條件下的表達模式進行分析，并對SAPK2基因響應缺K脅迫的機制進行了初步探究，以期為進一步揭示SnRK2蛋白激酶家族的作用機制奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試水稻材料為粳稻日本晴(OryzasativaL.spp.)。突變體株系sapk2-1和sapk2-7(S2-1和S2-7)均為本實驗室保存，sapk2突變體在設計靶點序列時選在了SAPK2的第三外顯子的編碼序列(即111—118位氨基酸對應的CDS序列)。經(jīng)鑒定，sapk2單突變體在相應位置均有移碼突變，導致SAPK2的氨基酸序列在158位氨基酸(Ser)處過早終止[19]。試驗中所有的水稻材料種子均為同一批次收獲，并在同一條件下保存。

1.2 水稻SAPK2基因的序列分析

經(jīng)生物信息學分析，SAPK2是水稻SnRK2Ⅱ家族成員。SAPK2的開放閱讀框為1 020 bp，編碼一個含339個氨基酸的多肽(LOC_Os07g42940)。

1.3 水稻SAPK2基因缺素表達模式分析

為了研究水稻SAPK2在不同元素(K、P、N)缺乏處理下的表達模式，對野生型和突變體材料進行了K、P、N缺乏處理。將野生型和突變體材料種子去種皮，經(jīng)30%次氯酸鈉消毒30 min后，用滅菌的雙蒸水清洗5～6次，直至將殘留的次氯酸鈉洗凈。隨后將洗好的種子播種在MS培養(yǎng)板上，并置于人工氣候室(光照周期為14 h光照/10 h黑暗，生長溫度為白天28 ℃、晚上20 ℃)內(nèi)萌發(fā)，7 d后用1/2 MS營養(yǎng)液培養(yǎng)。待水稻長至兩葉一心后分別進行缺K(0 μmol/L K,-K)、缺磷(0 μmol/L P,-P)和缺氮(20 μmol/L N,-N)處理，分別在0、3、6、9、12、24 h采集葉片，液氮冷凍備用。根據(jù)NCBI 網(wǎng)站提供的mRNA 序列，利用軟件Primer Premier 5.0設計水稻SAPK2基因的實時熒光定量PCR(qRT-PCR)引物(表1)，根據(jù)TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR Primix ExTaq試劑盒配置試劑，并在RocheLightCycler480 定量PCR 儀上進行反應,選OsActin為內(nèi)參基因。

表1 SAPK2基因qRT-PCR引物信息Tab.1 Information of primers used in qRT-PCR of SAPK2 gene

1.4 水稻萌發(fā)試驗

將野生型和突變體種子去種皮，經(jīng)30%次氯酸鈉消毒30 min后，用滅菌的雙蒸水清洗5～6次，直至將殘留的次氯酸鈉洗凈。隨后將洗好的種子播種在不同的MS培養(yǎng)板上(正常MS培養(yǎng)板和缺K的MS培養(yǎng)板)，并置于人工氣候室(光照周期為14 h光照/10 h黑暗，生長溫度為白天28 ℃、晚上20 ℃)內(nèi)萌發(fā)10 d，每天固定時間統(tǒng)計萌發(fā)率直至第10天。

1.5 水稻缺K水培試驗

野生型和突變體種子在1/2 MS 培養(yǎng)基上萌發(fā)，7 d后選取長勢一致的幼苗移入同規(guī)格的水培盆中，先清水緩苗，然后MS全營養(yǎng)液培養(yǎng)，每盆30株(野生型和突變體各半)。調(diào)營養(yǎng)液pH值至5.8，每2 d 換一次營養(yǎng)液。水培21 d后移入正常培養(yǎng)液和缺K培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)14 d，將幼苗分成地上部和根，分別測定其長度及干質(zhì)量。

1.6 K+代謝相關基因的表達水平檢測

野生型及突變體幼苗在1/2 MS營養(yǎng)液中培養(yǎng)，長至兩葉一心后分別進行缺K(0 μmol/L K,-K)處理24 h，采集葉片，液氮冷凍備用。根據(jù)NCBI 網(wǎng)站提供的mRNA 序列，利用軟件Primer Premier 5.0設計OsKAT1、OsKAT2、OsAKT1(Shaker K+channel 1)和OsHAK1等基因的qRT-PCR引物(表2)，根據(jù)TaKaRa公司生產(chǎn)的SYBR Primix ExTaq試劑盒配置試劑，并在RocheLightCycler480 定量PCR 儀上進行反應,選OsActin為內(nèi)參基因。

表2 K+代謝相關基因qRT-PCR引物信息Tab.2 Information of primers used in qRT-PCR of K+metabolisme related genes

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用Excel 2010整理，用SPSS 22.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻SAPK2基因表達模式分析

qRT-PCR結(jié)果顯示，SAPK2基因在缺N、P、K條件下表達量極顯著下降，且隨著處理時間的延長表達量不斷下降(圖1)。表明SAPK2可能參與了缺N、P、K脅迫的響應。

**表示0 h和其他時間之間存在極顯著差異(P<0.01)** indicates statistically significant differences between 0 hour and other times (P<0.01)圖1 水稻SAPK2基因在缺N、P、K條件下的表達模式分析Fig.1 Analysis of rice SAPK2 expression levels under K,N,P-deficient conditions

2.2 sapk2突變體在缺K條件下種子萌發(fā)情況分析

為了探討SAPK2是否在種子萌發(fā)過程中參與K元素的代謝調(diào)節(jié)，研究了sapk2-1和sapk2-7突變體株系在種子萌發(fā)階段響應缺K脅迫的情況。從2個突變體株系(sapk2-1和sapk2-7)的種子萌發(fā)試驗結(jié)果可以看出，在正常MS培養(yǎng)板上，sapk2突變體和野生型之間無明顯差異(圖2A)。然而，缺K處理條件下，野生型種子在處理7 d時萌發(fā)率已經(jīng)達到100%，而sapk2突變體種子在處理10 d時仍有部分種子沒有萌發(fā)，萌發(fā)率約為92%(sapk2-1和sapk2-7種子萌發(fā)率分別為91%和93%)(圖2B、C)。以上這些結(jié)果表明，SAPK2在種子萌發(fā)階段，作為正調(diào)節(jié)因子響應K缺乏。

A：sapk2突變體與野生型水稻種子在正常固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)率； B：sapk2突變體與野生型水稻種子在缺K固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)率； C：sapk2突變體與野生型水稻種子在缺K固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況A：Germination rates of seeds from sapk2 mutants and wild type plants grown on MS agar medium under control conditions; B：Germination rates of seeds from sapk2 mutants and wild type plants grown on MS agar medium under K deprivation condition; C：Germination phenotype of seeds from sapk2 mutants and wild type plants grown on MS agar medium under K deprivation condition圖2 野生型和sapk2突變體種子在缺K條件下的萌發(fā)情況Fig.2 Germination phenotype of WT and sapk2 mutants under K deprivation condition

2.3 sapk2突變體在缺K條件下苗期生長情況分析

缺K脅迫通常會對水稻幼苗的生長產(chǎn)生嚴重的抑制。由圖3可知，正常培養(yǎng)條件下，sapk2突變體和野生型地上部、根的長度和干質(zhì)量均無明顯差異；但是在缺K培養(yǎng)條件下，sapk2突變體與野生型相比，地上部長、干質(zhì)量和根干質(zhì)量均極顯著下降，根長顯著下降。表明SAPK2在水稻缺K響應中作為正調(diào)節(jié)因子發(fā)揮重要作用。

*、**分別表示突變體和野生型之間有顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)差異，下同 * and ** indicate significant differences between mutant lines and wild type plants at 0.05 and 0.01 levels,the same below圖3 缺K脅迫下野生型和sapk2突變體苗期生長情況Fig.3 Growth phenotype of WT and sapk2 mutants under K deprivation condition

2.4 sapk2突變體中K+代謝相關基因的表達水平分析

已有研究表明，內(nèi)流型K離子通道是植物K吸收的主要途徑，電化學分析表明,OsKAT1和OsKAT2能夠作為內(nèi)流型鉀離子通道起作用，且OsKAT2比OsKAT1具有更高的K+吸收能力[21]。OsAKT1基因的突變體表現(xiàn)出K+吸收降低，老葉出現(xiàn)斑點，整個生長周期發(fā)育受到抑制，抽穗期和灌漿期延遲，產(chǎn)量降低[22]。OsHAK1在主根和側(cè)根中表達，在表皮細胞和中柱、根莖結(jié)合部、莖、葉片以及小穗軸中均有表達[23]。K缺乏或者鹽脅迫條件會誘導水稻中OsHAK1表達，與野生型相比，oshak1突變體對鹽脅迫的敏感性增加，K的吸收以及K/Na降低，OsHAK1過表達則會增加水稻對K的吸收以及K/Na[23]。

為了進一步探究SAPK2參與調(diào)節(jié)K+平衡的可能途徑，分析了OsKAT1、OsKAT2、OsAKT1和OsHAK1等K+代謝相關基因在缺K處理前后的表達水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，在缺K條件下，與野生型植株相比，sapk2突變體中OsKAT1、OsKAT2、OsAKT1和OsHAK1基因的表達水平均極顯著下調(diào)(圖4)。綜合這些結(jié)果可知，SAPK2可能通過直接或者間接途徑調(diào)節(jié)K+代謝相關基因的表達水平，參與調(diào)節(jié)K+在植物體內(nèi)的平衡，從而參與水稻的缺K脅迫響應。

圖4 水稻K+代謝調(diào)節(jié)基因的表達分析 Fig.4 Analysis of K+ homeostasis genes expression level in rice

3 結(jié)論與討論

SAPK2是水稻SnRK2 Ⅱ亞家族成員，并且是擬南芥中SnRK2.7和SnRK2.8的同源基因。擬南芥中SnRK2.7和SnRK2.8基因的研究報道較多，但大多與逆境脅迫響應相關，關于參與元素代謝的報道僅見于UMEZAWA等[20]在2004年的報道，SAPK2的同源基因SnRK2.8參與K元素的代謝過程，而水稻中SAPK2參與K元素代謝至今未見報道。

擬南芥SRK2C/SnRK2.8正調(diào)控根系抗旱響應，超表達SnRK2.8基因可以上調(diào)相關脅迫響應基因的表達從而增加擬南芥植株的抗旱性[24]。SRK2C/SnRK2.8也參與根的生長代謝過程，超表達SRK2C/SnRK2.8基因可以促進根的伸長[25]。此外，研究表明，在擬南芥中超表達SnRK2.8基因能夠明顯促進根的發(fā)育和增加植株鮮質(zhì)量，缺K處理會導致SnRK2.8基因的表達量明顯下降[25]。本研究對SAPK2表達模式進行分析發(fā)現(xiàn)，缺N、P、K處理導致水稻中SAPK2表達量極顯著下降，此結(jié)果說明SAPK2可能具有SnRK2.8類似的功能，參與N、P、K的代謝過程。

研究表明，ABA在抑制種子萌發(fā)和幼苗生長過程中發(fā)揮了重要作用[22]。最新研究報道指出，SAPK2參與水稻中ABA信號的傳導，SAPK2依賴ABA對種子萌發(fā)和萌發(fā)后生長起正調(diào)節(jié)作用[19]。本研究中，在種子萌發(fā)期進行缺K處理的研究結(jié)果顯示，與野生型相比，sapk2突變體在缺K條件下萌發(fā)明顯延遲。此結(jié)果表明，SAPK2在缺K條件下的水稻種子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要的正調(diào)節(jié)作用。為了進一步分析SAPK2在水稻缺K條件下的功能，分析了水稻苗期缺K條件下的生長情況，結(jié)果顯示，與野生型相比，sapk2突變體在缺K條件下苗期生長受到嚴重的抑制，根和地上部的長度和干質(zhì)量均顯著下降。此結(jié)果表明，SAPK2在缺K環(huán)境下水稻苗期營養(yǎng)生長階段發(fā)揮重要的正調(diào)節(jié)作用。另外，與野生型植株相比，sapk2突變體中OsKAT1、OsKAT2、OsAKT1和OsHAK1等K+代謝相關基因的表達水平明顯下調(diào)，表明SAPK2可能通過調(diào)節(jié)K+代謝相關基因的表達水平，參與調(diào)節(jié)K+在植物體內(nèi)的平衡，從而參與到水稻的缺K脅迫響應中，但其具體的信號通路有待于進一步研究。