• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    甘草酸、桂皮酸干預(yù)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用研究
    ——基于MicroRNA22調(diào)控HIF-1α-MMP1/3通路

    2021-04-08 03:02:18鄒俊萍王永萍
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2021年3期
    關(guān)鍵詞:桂皮雷公藤甘草酸

    鄒俊萍,王永萍,張 陽(yáng)

    (貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550002)

    類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性免疫系統(tǒng)疾病,其病理組織學(xué)改變主要有滑膜組織增生、血管翳形成與關(guān)節(jié)軟骨及骨組織結(jié)構(gòu)的破壞[1]。本課題組前期研究[2]表明,甘草附子湯可以通過(guò)減少血清和滑膜組織中HIF-1α的含量,抑制炎癥和新生血管形成,從而治療RA。甘草酸、桂皮酸為甘草附子湯的活性成分,甘草酸類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[3-4]。桂皮酸能有效抑制多種癌癥細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。研究[6-8]發(fā)現(xiàn),微小RNA22(MicroRNA22,miRNA22)、缺氧誘導(dǎo)因子1α( Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α) 、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)與RA發(fā)病密切相關(guān)。故本實(shí)驗(yàn)用甘草酸、桂皮酸干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎( Collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠,觀察這兩種成分對(duì)CIA模型大鼠MicroRNA22、HIF-1ɑ、MMP1/3系統(tǒng)的影響,探討甘草酸、桂皮酸通過(guò)影響MicroRNA22,調(diào)控HIF-1α-MMP1/3通路干預(yù)RA的機(jī)制。

    1 材料與器材

    1.1 試驗(yàn)藥物

    甘草酸(上海麥克林生化科技有限公司,批號(hào):C10668627,含量93%);桂皮酸(江蘇永健醫(yī)藥,批號(hào):C10555085,含量99%);雷公藤多苷片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司,每片含10 mg,批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z42021212)。

    1.2 動(dòng)物

    48只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量130~170 g,購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤公司,大鼠合格證號(hào):NO.1107261911000163。

    1.3 試劑

    牛ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑(美國(guó) Sigma,批號(hào):170306、SLBJ2840V);HIF-1α/MMP1/MMP3一抗、二抗(美國(guó) Affinity,批號(hào):60h4847、47e7084、6542a14);HIF-1α/MMP1/MMP3 ELISA試劑盒 (上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):12/2019);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司,批號(hào):AK4601);引物mir22、U6(長(zhǎng)度分別為:171 bp、190 bp,均由北京擎科生物科技有限公司合成)。

    1.4 儀器

    EG115OH包埋機(jī)、RM2265切片機(jī)(德國(guó)Leica);XSZ-HS3顯微鏡(日本 OLYMPUS);mμlISKANMK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI QuantStudio 6)。

    2 方法

    2.1 造模與給藥

    將大鼠隨機(jī)分成6組,每組8只。參考文獻(xiàn)[9]的方法,先用 2 g/L牛Ⅱ型膠原溶液和不完全弗氏佐劑等體積乳化劑在除正常組外的其余5組大鼠右后足跖皮下注射0.4 mL/只,初步反應(yīng)14 d后,左后足跖同法注射0.1 mL/只,加強(qiáng)反應(yīng) 6 d,以此建立CIA大鼠模型。完成造模后,參考文獻(xiàn)[3,10]選定給藥劑量,甘草酸組予甘草酸100 mg·kg-1,桂皮酸組予桂皮酸8.68 mg·kg-1,甘草酸桂皮酸合用組予甘草酸100 mg·kg-1,桂皮酸8.68 mg·kg-1,雷公藤多苷組予雷公藤多苷10 mg·kg-1,模型組予2 mL生理鹽水。連續(xù)灌胃20 d,1次/ d。

    2.2 大鼠足爪圖片和X射線(xiàn)影像

    取材前拍取大鼠足爪圖片和 X射線(xiàn)影像,評(píng)估CIA造模和藥物對(duì)大鼠足爪病變的影響。

    2.3 取材

    大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)進(jìn)行麻醉。待大鼠完全麻醉后,股動(dòng)脈取血,靜置1.5 h后離心(4 000 r/min,20 min),取上清,-80 ℃保存。然后打開(kāi)腹腔,取出脾臟,以純水洗凈,-80 ℃保存。剪開(kāi)兩側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚,用刀片完整剝?nèi)∠ドw髕韌帶下淡黃色的滑膜組織,標(biāo)記后放入包埋盒,10%多聚甲醛浸泡48 h。

    2.4 血清HIF-1α、MMP1及MMP3含量檢測(cè)

    取大鼠血清,嚴(yán)格參照 HIF-1α/MMP1/MMP3 ELISA試劑盒說(shuō)明,檢測(cè)血清中HIF-1α、MMP1及MMP3的含量。

    2.5 組織切片的制作與觀察

    取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜,常規(guī)石蠟包埋,5 μm切片。采用HE染色觀察其形態(tài)學(xué)變化;采用免疫組化染色檢測(cè)HIF-1α、MMP1及MMP3陽(yáng)性表達(dá)。

    2.6 RT-PCR法檢測(cè)脾臟MicroRNA22表達(dá)

    剪取100 mg脾臟,加1 mL Trizol用勻漿器研磨成漿,轉(zhuǎn)至無(wú)RNase的1.5 mL EP管中,裂解10 min。加入200 μL氯仿,劇烈顛倒混勻數(shù)次,室溫靜置5 min。4 ℃,12 000 rpm,離心15 min,可見(jiàn)分成上(RNA)、中(蛋白)、下(DNA)三相。轉(zhuǎn)移上層水相(約400 μL)于另一干凈1.5 mL EP管中,加入400 μL異丙醇,混勻后室溫靜置10 min。4 ℃,12 000 rpm,離心10 min,管底可見(jiàn)白色的RNA沉淀。棄上清,加入無(wú)RNase的75%乙醇1 mL,渦旋混勻后,4 ℃,10 000 rpm,離心5 min,重復(fù)1次。棄上清,空氣中干燥RNA沉淀5~10 min,將沉淀溶于20 μL DEPC水中。取溶解后的RNA 2 μL用微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260、OD280以及OD260/OD280值,計(jì)算RNA的純度和濃度。依據(jù)OD260/OD280比值,估測(cè)RNA質(zhì)量,比值在1.8~2.0符合實(shí)驗(yàn)要求。依據(jù)吸光光度值,按公式[總RNA濃度(μg/μL)=OD260×40×10-3]計(jì)算樣品RNA的濃度。將總RNA放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。各取已知純度與濃度的RNA溶液5 μg,加入Oligo (dT) 18 (10 μmol/L)、dNTP (2.5 mmol/L)、5×Hiscript Buffer、Hiscript Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor,用ddH2O (Rnase free)配平至20 μL。加樣后以反應(yīng)條件:25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 5 min、4 ℃ 10 min行RNA逆轉(zhuǎn)錄,將生成的cDNA做6倍稀釋作為模板,在各基因中加入相應(yīng)目的基因上下游引物及SYBR熒光染料,設(shè)置反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 sec、60 ℃ 30 sec、40 cycles。繪制溶解曲線(xiàn),最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。引物序列見(jiàn)表1。

    表1 引物序列

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    3 結(jié)果

    3.1 大鼠足爪病變觀察

    造模后大鼠健康狀態(tài)逐漸惡化,消瘦,脫毛,足爪腫、畸形、溶骨、新骨增生,在造模第20天上述癥狀表現(xiàn)最突出。藥物干預(yù)后,足爪炎癥反應(yīng)減輕,尤其是甘草酸桂皮酸合用組、雷公藤多苷組減輕較明顯,溶骨現(xiàn)象基本消退,桂皮酸組癥狀減輕不明顯,關(guān)節(jié)畸形、溶骨仍然嚴(yán)重,并且可見(jiàn)明顯成骨現(xiàn)象,見(jiàn)圖1、圖2。綜上,類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型建立成功,甘草酸和桂皮酸能抗炎消腫,且甘草酸桂皮酸合用組作用較為明顯。

    3.2 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)的影響

    與正常組比較,模型組滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損,炎性細(xì)胞表達(dá)明顯增加,血管翳增生。與模型組比較,各給藥組滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少及血管翳增生被抑制,甘草酸桂皮酸合用組改善作用最強(qiáng),見(jiàn)圖3。綜上,甘草酸、桂皮酸可緩解炎癥反應(yīng)與血管翳增生,甘草酸桂皮酸合用組作用明顯。

    3.3 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠血清 HIF-1α、MMP1及MMP3含量的影響

    與正常組比較,模型組大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3含量均明顯升高。與模型組比較,各給藥組HIF-1α、MMP1及MMP3含量均明顯低于模型組。綜上,甘草酸、桂皮酸能顯著降低大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3含量,見(jiàn)表 2。

    3.4 大黃素對(duì)RA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)的影響

    與正常組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)顯著升高。與模型組比較,各給藥組HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)均明顯降低。上述3種蛋白表達(dá)均表現(xiàn)為甘草酸桂皮酸合用組下降最多,桂皮酸組下降最少,見(jiàn)表3及圖4、圖5、圖6。綜上,甘草酸、桂皮酸能顯著抑制大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá),甘草酸桂皮酸合用組時(shí)下調(diào)作用最強(qiáng)。

    注:A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組。

    注:A.正常對(duì)照;B.模型對(duì)照;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組。

    注:A.正常對(duì)照;B.模型對(duì)照;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組。

    表2 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠血清中HIF-1α與MMP1/3表達(dá)的影響

    注:A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組?;そM織免疫組化染色中棕黃色顆粒部分表示陽(yáng)性表達(dá)。

    注:A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組。

    3.5 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠脾臟MicroRNA22表達(dá)的影響

    與正常組比較,模型組大鼠脾臟中MicroRNA22基因表達(dá)明顯降低。與模型組比較,各給藥組MicroRNA22基因表達(dá)均明顯升高,甘草酸組和甘草酸桂皮酸合用組MicroRNA22基因表達(dá)比正常組還顯著上升。綜上,各給藥組各劑量均能顯著上調(diào)RA大鼠脾臟中MicroRNA22表達(dá),見(jiàn)表 4。

    表4 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠脾臟中MicroRNA22表達(dá)的影響

    4 討論

    MicroRNA是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的一類(lèi)內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子 RNA[11]。MicroRNA通過(guò)引起靶mRNA降解、翻譯抑制、脫腺苷酸化,調(diào)控多個(gè)上游基因表達(dá)及下游蛋白翻譯,是細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Cellular gene regulatory network)中的重要組成部分,約90%的蛋白編碼基因受MicroRNA的調(diào)控[12-13]。其中MicroRNA-22是由22個(gè)核苷酸組成的非編碼蛋白R(shí)NA,在細(xì)胞發(fā)育、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[14]。HIF-1α是體內(nèi)細(xì)胞應(yīng)答缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵因子[15]。研究[16]表明,HIF-1α在RA患者的受累關(guān)節(jié)中過(guò)度表達(dá)是RA的重要靶點(diǎn),本課題組前期實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn),RA大鼠中HIF-1α的表達(dá)是增強(qiáng)的。在RA發(fā)病過(guò)程中,大量關(guān)節(jié)軟骨的破壞是關(guān)鍵性的臨床癥狀。而這種破壞是由滑膜中,高活性的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)所介導(dǎo)。MMPs具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用,其中,MMP-1負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分Ⅰ型膠原蛋白,而MMP-3的作用則更廣泛,其與關(guān)節(jié)的炎癥及損壞密切相關(guān)[17]。有研究[18]表明,在缺氧條件下MMP-3的表達(dá)完全受HIF-1α調(diào)控,而 MMP-1表達(dá)也部分受其調(diào)控。RA中滑膜襯里層增生、滑膜細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及無(wú)功能血管形成,造成受累關(guān)節(jié)滑膜缺氧。此時(shí),MicroRNA22通過(guò)減少表達(dá)來(lái)激活靶基因:翻譯HIF-1α的mRNA,使HIF-1α分泌增多。MMP-3 /MMP-1表達(dá)量受HIF-1α調(diào)控上升,促進(jìn)軟骨降解及骨破壞,最終導(dǎo)致RA病情發(fā)展[18,19-21]。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模后大鼠逐漸出現(xiàn)倦怠、跛行、腹瀉、脫毛、厭食、消瘦等亞健康體征。雙后足爪逐漸出現(xiàn)軟組織紅腫、關(guān)節(jié)畸形、骨基質(zhì)破壞及后期新骨增生等現(xiàn)象,于造模第20天上述癥狀表現(xiàn)最嚴(yán)重。用甘草酸、桂皮酸干預(yù),大鼠體質(zhì)量下降幅度變小,腹瀉緩解,其中,甘草酸桂皮酸合用組效果比甘草酸組、桂皮酸組更佳。與模型組比較,甘草酸桂皮酸合用組大鼠足爪軟組織紅腫、關(guān)節(jié)畸形及溶骨現(xiàn)象基本消退。甘草酸組大鼠足爪軟組織紅腫、關(guān)節(jié)畸形明顯好轉(zhuǎn),但溶骨與成骨現(xiàn)象仍然明顯。桂皮酸組關(guān)節(jié)畸形、溶骨及成骨現(xiàn)象嚴(yán)重?;そM織HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)清晰。而模型組滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷,炎性細(xì)胞表達(dá)顯著上升,血管翳增生。連續(xù)灌胃甘草酸、桂皮酸20 d后,滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,血管翳增生被抑制,甘草酸桂皮酸合用組大鼠病變減輕較明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立成功,甘草酸、桂皮酸具有抗炎消腫、抑制新生血管形成、保護(hù)骨與軟骨的作用,甘草酸、桂皮酸協(xié)同作用,對(duì)RA的治療效果更佳。滑膜組織免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)均顯著增加;與模型組比較,各給藥組HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)。大鼠血清檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3水平均明顯增加;與模型組比較,各給藥組HIF-1α、MMP1及MMP3表達(dá)均明顯降低。而脾臟RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠脾臟中MicroRNA22基因表達(dá)水平明顯降低;甘草酸、桂皮酸干預(yù)20 d天后,與模型組比較,MicroRNA22基因表達(dá)水平均明顯上升,甘草酸組、甘草酸桂皮酸合用組還高于正常組水平。

    由此,可推測(cè)甘草酸、桂皮酸對(duì)RA的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制MicroRNA22,調(diào)控HIF-1α-MMP1/3信號(hào)通路中相關(guān)分子生成,從而控制炎性發(fā)展,降低骨與軟骨組織損傷,減少新生血管生成。

    猜你喜歡
    桂皮雷公藤甘草酸
    Effectiveness and safety of tripterygium glycosides tablet (雷公藤多苷片) for lupus nephritis: a systematic review and Meta-analysis
    雷公藤多苷片聯(lián)合甲氨蝶呤治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的療效
    桂皮多酚的提取及穩(wěn)定性研究
    HPLC法測(cè)定桂皮中的cinnamtannin D-1和cinnamtannin B-1
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:56
    桂皮水除口臭
    桂皮水除口臭
    關(guān)于召開(kāi)“第六屆全國(guó)雷公藤學(xué)術(shù)會(huì)議”的征文通知
    復(fù)方甘草酸苷片治療慢性濕疹56例臨床分析
    甘草酸二銨對(duì)大鼠背部超長(zhǎng)隨意皮瓣成活的影響
    雷公藤紅素通過(guò)ROS/JNK途徑誘導(dǎo)Saos-2細(xì)胞發(fā)生caspase依賴(lài)的凋亡
    av有码第一页| 日本av免费视频播放| 丝袜喷水一区| 久久久精品区二区三区| 9热在线视频观看99| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 在线观看免费高清a一片| av不卡在线播放| 高清毛片免费看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久99一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产片内射在线| 久久久久网色| 日本欧美视频一区| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 成人国产麻豆网| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 男人爽女人下面视频在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| kizo精华| 伊人亚洲综合成人网| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品少妇内射三级| 亚洲图色成人| 大陆偷拍与自拍| 69精品国产乱码久久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 久久99热6这里只有精品| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲经典国产精华液单| 国产一区二区在线观看av| 一区二区三区四区激情视频| 久久久久久久国产电影| 国产探花极品一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 免费大片18禁| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 国产av一区二区精品久久| 大话2 男鬼变身卡| 久久久国产一区二区| 久久国内精品自在自线图片| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 黄色一级大片看看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 亚洲精品久久午夜乱码| 亚洲色图综合在线观看| 精品一区二区三卡| 亚洲精品日本国产第一区| 多毛熟女@视频| 大片电影免费在线观看免费| 97在线视频观看| 国产精品不卡视频一区二区| 久久久久久久久久人人人人人人| a级片在线免费高清观看视频| 国产精品偷伦视频观看了| 国产探花极品一区二区| 成年动漫av网址| 一级黄片播放器| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品久久久久久久性| 美女视频免费永久观看网站| 国产又爽黄色视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 一本色道久久久久久精品综合| 人妻人人澡人人爽人人| 久久婷婷青草| 街头女战士在线观看网站| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产成人欧美| 久久久久久久久久久免费av| 日韩精品有码人妻一区| 国产1区2区3区精品| 晚上一个人看的免费电影| 在线天堂中文资源库| 国产精品无大码| 色哟哟·www| 97人妻天天添夜夜摸| 精品视频人人做人人爽| 免费高清在线观看视频在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 美女视频免费永久观看网站| 精品国产露脸久久av麻豆| 七月丁香在线播放| a 毛片基地| 午夜免费观看性视频| av网站免费在线观看视频| 有码 亚洲区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品不卡视频一区二区| 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品一二三| 国产成人av激情在线播放| 少妇的丰满在线观看| 日韩av免费高清视频| 久久婷婷青草| 久久久精品免费免费高清| 少妇高潮的动态图| 女人精品久久久久毛片| 欧美精品亚洲一区二区| 十八禁网站网址无遮挡| 亚洲av男天堂| 我要看黄色一级片免费的| 久久午夜福利片| 美女视频免费永久观看网站| 最近中文字幕2019免费版| 日韩大片免费观看网站| 水蜜桃什么品种好| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 亚洲国产最新在线播放| 午夜免费观看性视频| 久久99精品国语久久久| 最近中文字幕高清免费大全6| 熟妇人妻不卡中文字幕| 大话2 男鬼变身卡| 免费av中文字幕在线| 日韩一区二区三区影片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 一区二区av电影网| 欧美人与性动交α欧美软件 | 中文字幕人妻丝袜制服| 成人亚洲精品一区在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 青青草视频在线视频观看| 免费观看av网站的网址| 制服丝袜香蕉在线| 午夜日本视频在线| 国产av国产精品国产| av黄色大香蕉| 99国产综合亚洲精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 精品一区二区三区视频在线| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲国产最新在线播放| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲熟女精品中文字幕| videossex国产| 国产xxxxx性猛交| 久久免费观看电影| 黄色毛片三级朝国网站| 天天影视国产精品| 日本与韩国留学比较| 国产av国产精品国产| 丁香六月天网| 丝袜人妻中文字幕| 免费观看性生交大片5| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 免费观看在线日韩| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日本91视频免费播放| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 老司机亚洲免费影院| 秋霞伦理黄片| 99香蕉大伊视频| 精品久久久精品久久久| 一个人免费看片子| 国产成人精品一,二区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| videos熟女内射| 青春草视频在线免费观看| 亚洲av电影在线进入| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品一区www在线观看| 91精品三级在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 春色校园在线视频观看| 自线自在国产av| 国产成人精品久久久久久| 国产片内射在线| 成年av动漫网址| 免费高清在线观看日韩| www.熟女人妻精品国产 | 亚洲国产精品专区欧美| 99热这里只有是精品在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲成国产人片在线观看| 51国产日韩欧美| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩伦理黄色片| 老司机亚洲免费影院| 深夜精品福利| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲精品久久午夜乱码| 99久国产av精品国产电影| 黄色毛片三级朝国网站| 另类精品久久| kizo精华| 制服诱惑二区| 高清不卡的av网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产在线免费精品| 亚洲国产精品专区欧美| 一本久久精品| 在线观看www视频免费| 男人舔女人的私密视频| 在线观看www视频免费| 秋霞伦理黄片| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美97在线视频| 亚洲久久久国产精品| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 成人影院久久| 校园人妻丝袜中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 九九爱精品视频在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 午夜久久久在线观看| 女性被躁到高潮视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 在线看a的网站| 精品一区二区免费观看| videossex国产| 亚洲国产看品久久| 边亲边吃奶的免费视频| 男女国产视频网站| 国产一级毛片在线| 久久亚洲国产成人精品v| 观看av在线不卡| 午夜免费鲁丝| 韩国精品一区二区三区 | 观看美女的网站| 欧美精品亚洲一区二区| 尾随美女入室| 亚洲精品,欧美精品| 在线观看国产h片| 热99国产精品久久久久久7| 亚洲国产看品久久| 超色免费av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久精品久久精品一区二区三区| 在线观看www视频免费| 亚洲四区av| 一级黄片播放器| 精品一品国产午夜福利视频| 免费av不卡在线播放| 日韩精品有码人妻一区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲精品一区蜜桃| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲欧洲国产日韩| 美国免费a级毛片| 国产在线一区二区三区精| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 九色成人免费人妻av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产一区二区三区综合在线观看 | 91久久精品国产一区二区三区| 在线免费观看不下载黄p国产| 久久av网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| av不卡在线播放| 午夜福利视频在线观看免费| 香蕉丝袜av| 亚洲国产欧美在线一区| av电影中文网址| 老熟女久久久| 免费大片黄手机在线观看| 18在线观看网站| 亚洲欧洲日产国产| 人妻少妇偷人精品九色| 国产午夜精品一二区理论片| 黄片无遮挡物在线观看| 热re99久久国产66热| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产精品成人在线| 人妻人人澡人人爽人人| 免费在线观看完整版高清| 18在线观看网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美3d第一页| 亚洲欧美精品自产自拍| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产日韩欧美在线精品| 国产成人欧美| 亚洲丝袜综合中文字幕| 26uuu在线亚洲综合色| 男人爽女人下面视频在线观看| 九草在线视频观看| 欧美精品国产亚洲| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 9色porny在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 亚洲精品第二区| 久久女婷五月综合色啪小说| 中文字幕最新亚洲高清| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 男人舔女人的私密视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国精品久久久久久国模美| 人妻 亚洲 视频| 精品国产一区二区久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产成人精品福利久久| 亚洲av福利一区| 久久久久久人妻| 人体艺术视频欧美日本| 中文字幕最新亚洲高清| tube8黄色片| 亚洲天堂av无毛| 日本欧美国产在线视频| www.av在线官网国产| 免费av中文字幕在线| 高清在线视频一区二区三区| 一区二区三区精品91| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久99蜜桃精品久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 男人添女人高潮全过程视频| av网站免费在线观看视频| 一级毛片电影观看| 久久久久久人妻| 男女啪啪激烈高潮av片| 一级毛片我不卡| 蜜桃在线观看..| 99香蕉大伊视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| www.av在线官网国产| 亚洲av福利一区| 国产精品久久久久久久久免| 在线天堂最新版资源| 国国产精品蜜臀av免费| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲经典国产精华液单| 黑人猛操日本美女一级片| 晚上一个人看的免费电影| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 人人澡人人妻人| 涩涩av久久男人的天堂| freevideosex欧美| 国产免费视频播放在线视频| 日韩一区二区视频免费看| 99香蕉大伊视频| 女性被躁到高潮视频| 国产一区二区三区综合在线观看 | 久久精品国产亚洲av天美| 欧美精品一区二区大全| 国产av国产精品国产| 男女无遮挡免费网站观看| 99热国产这里只有精品6| 美国免费a级毛片| 在线观看免费视频网站a站| 国产极品天堂在线| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一级,二级,三级黄色视频| 国产视频首页在线观看| 国产乱来视频区| 国产不卡av网站在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 久久人妻熟女aⅴ| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国产精品偷伦视频观看了| 天天操日日干夜夜撸| 观看美女的网站| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产精品无大码| 精品久久久精品久久久| 国产又色又爽无遮挡免| 一区二区av电影网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 波野结衣二区三区在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 美女国产高潮福利片在线看| 99国产精品免费福利视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 国产精品久久久久久精品电影小说| 欧美人与善性xxx| 观看av在线不卡| 亚洲国产最新在线播放| 丝袜喷水一区| 日韩av在线免费看完整版不卡| 黑人猛操日本美女一级片| 久久久久久久大尺度免费视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 欧美bdsm另类| 9191精品国产免费久久| 亚洲图色成人| 免费观看av网站的网址| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 亚洲精品av麻豆狂野| 在线观看人妻少妇| av免费观看日本| 免费日韩欧美在线观看| 成年女人在线观看亚洲视频| 久久久久精品久久久久真实原创| 秋霞在线观看毛片| 久久国产精品大桥未久av| 2018国产大陆天天弄谢| 成年av动漫网址| 高清黄色对白视频在线免费看| 毛片一级片免费看久久久久| 熟女av电影| 国产亚洲欧美精品永久| 丝袜喷水一区| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 中文字幕制服av| 只有这里有精品99| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产在线视频一区二区| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产免费又黄又爽又色| 久久久久久伊人网av| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 国产高清不卡午夜福利| 天美传媒精品一区二区| 午夜免费男女啪啪视频观看| 七月丁香在线播放| 18禁动态无遮挡网站| 大香蕉久久成人网| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产综合精华液| 男女无遮挡免费网站观看| 桃花免费在线播放| 国产精品国产三级国产专区5o| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 在线天堂最新版资源| 国产1区2区3区精品| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久影院123| 日韩视频在线欧美| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲国产成人一精品久久久| 日本与韩国留学比较| 狂野欧美激情性bbbbbb| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 午夜免费观看性视频| 99热网站在线观看| 如何舔出高潮| 这个男人来自地球电影免费观看 | 成人免费观看视频高清| 亚洲欧洲日产国产| 老女人水多毛片| 五月伊人婷婷丁香| 午夜激情av网站| 少妇高潮的动态图| 国产精品女同一区二区软件| 欧美变态另类bdsm刘玥| 99热网站在线观看| 18禁动态无遮挡网站| 中文天堂在线官网| xxxhd国产人妻xxx| 少妇精品久久久久久久| 日本av免费视频播放| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 制服人妻中文乱码| 考比视频在线观看| 亚洲综合色网址| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲欧洲国产日韩| 美女视频免费永久观看网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲在久久综合| 国产精品三级大全| 丝袜喷水一区| 亚洲美女视频黄频| 久久狼人影院| 亚洲av电影在线进入| 免费观看性生交大片5| 深夜精品福利| 9色porny在线观看| av视频免费观看在线观看| 久久久国产一区二区| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 欧美日韩精品成人综合77777| a 毛片基地| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 日日爽夜夜爽网站| 蜜桃在线观看..| 久久人人爽人人爽人人片va| av线在线观看网站| 欧美日韩视频精品一区| 韩国av在线不卡| 黄色配什么色好看| 中文字幕最新亚洲高清| 久久久久久久亚洲中文字幕| 最新中文字幕久久久久| a级毛色黄片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲av日韩在线播放| a级毛片黄视频| 全区人妻精品视频| 亚洲精品国产av成人精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 日日撸夜夜添| 国产av一区二区精品久久| 亚洲 欧美一区二区三区| 免费观看av网站的网址| 久久99热6这里只有精品| www.色视频.com| 80岁老熟妇乱子伦牲交| av在线播放精品| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲成人一二三区av| 色吧在线观看| 亚洲国产精品999| 亚洲国产最新在线播放| 18在线观看网站| 老熟女久久久| 男女国产视频网站| 免费av不卡在线播放| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 精品国产一区二区久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 少妇的丰满在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 亚洲国产色片| 久久人妻熟女aⅴ| 在线 av 中文字幕| av网站免费在线观看视频| 人妻少妇偷人精品九色| 久久久久久久久久久久大奶| a级毛片黄视频| 交换朋友夫妻互换小说| 最近的中文字幕免费完整| 国产永久视频网站| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 99视频精品全部免费 在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 在线天堂中文资源库| 国精品久久久久久国模美| 久久久久国产网址| 久久久久久久精品精品| 99国产精品免费福利视频| 久久青草综合色| av有码第一页| 一区二区三区乱码不卡18| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 咕卡用的链子| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲国产最新在线播放| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 久久精品夜色国产| 中文天堂在线官网| 一级黄片播放器| 美女主播在线视频| 97在线人人人人妻| 亚洲内射少妇av| 熟女av电影| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 在线 av 中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 天堂中文最新版在线下载| 五月天丁香电影| 男女边摸边吃奶| 日韩一区二区三区影片| 大香蕉久久成人网| 另类精品久久| 国产一区二区在线观看日韩| 国产爽快片一区二区三区| 欧美bdsm另类| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 久久久久久人妻| 一区在线观看完整版| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲美女视频黄频| 乱人伦中国视频| 亚洲国产欧美在线一区| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久综合国产亚洲精品| 人妻一区二区av| 国产成人免费无遮挡视频| 全区人妻精品视频| 国产精品一区www在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 蜜桃国产av成人99| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 香蕉国产在线看| 青春草视频在线免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 久久99精品国语久久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 18在线观看网站| 午夜影院在线不卡| 91精品国产国语对白视频| 久久免费观看电影| 日本91视频免费播放| 久久97久久精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 男女午夜视频在线观看 | 亚洲国产精品999| 精品少妇内射三级| 永久网站在线| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲精品视频女| a级毛色黄片| www.色视频.com| av在线老鸭窝| 高清av免费在线| 亚洲性久久影院| 亚洲综合精品二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产69精品久久久久777片| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 欧美精品亚洲一区二区| 99香蕉大伊视频|