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    甘草酸、桂皮酸干預(yù)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用研究
    ——基于MicroRNA22調(diào)控HIF-1α-MMP1/3通路

    2021-04-08 03:02:18鄒俊萍王永萍
    亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥 2021年3期
    關(guān)鍵詞:桂皮雷公藤甘草酸

    鄒俊萍,王永萍,張 陽(yáng)

    (貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽(yáng) 550002)

    類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性免疫系統(tǒng)疾病,其病理組織學(xué)改變主要有滑膜組織增生、血管翳形成與關(guān)節(jié)軟骨及骨組織結(jié)構(gòu)的破壞[1]。本課題組前期研究[2]表明,甘草附子湯可以通過(guò)減少血清和滑膜組織中HIF-1α的含量,抑制炎癥和新生血管形成,從而治療RA。甘草酸、桂皮酸為甘草附子湯的活性成分,甘草酸類(lèi)具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等作用[3-4]。桂皮酸能有效抑制多種癌癥細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。研究[6-8]發(fā)現(xiàn),微小RNA22(MicroRNA22,miRNA22)、缺氧誘導(dǎo)因子1α( Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α) 、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)與RA發(fā)病密切相關(guān)。故本實(shí)驗(yàn)用甘草酸、桂皮酸干預(yù)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎( Collagen-induced arthritis,CIA)模型大鼠,觀察這兩種成分對(duì)CIA模型大鼠MicroRNA22、HIF-1ɑ、MMP1/3系統(tǒng)的影響,探討甘草酸、桂皮酸通過(guò)影響MicroRNA22,調(diào)控HIF-1α-MMP1/3通路干預(yù)RA的機(jī)制。

    1 材料與器材

    1.1 試驗(yàn)藥物

    甘草酸(上海麥克林生化科技有限公司,批號(hào):C10668627,含量93%);桂皮酸(江蘇永健醫(yī)藥,批號(hào):C10555085,含量99%);雷公藤多苷片(遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司,每片含10 mg,批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字Z42021212)。

    1.2 動(dòng)物

    48只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量130~170 g,購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤公司,大鼠合格證號(hào):NO.1107261911000163。

    1.3 試劑

    牛ⅱ型膠原和不完全弗氏佐劑(美國(guó) Sigma,批號(hào):170306、SLBJ2840V);HIF-1α/MMP1/MMP3一抗、二抗(美國(guó) Affinity,批號(hào):60h4847、47e7084、6542a14);HIF-1α/MMP1/MMP3 ELISA試劑盒 (上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào):12/2019);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司,批號(hào):AK4601);引物mir22、U6(長(zhǎng)度分別為:171 bp、190 bp,均由北京擎科生物科技有限公司合成)。

    1.4 儀器

    EG115OH包埋機(jī)、RM2265切片機(jī)(德國(guó)Leica);XSZ-HS3顯微鏡(日本 OLYMPUS);mμlISKANMK3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI QuantStudio 6)。

    2 方法

    2.1 造模與給藥

    將大鼠隨機(jī)分成6組,每組8只。參考文獻(xiàn)[9]的方法,先用 2 g/L牛Ⅱ型膠原溶液和不完全弗氏佐劑等體積乳化劑在除正常組外的其余5組大鼠右后足跖皮下注射0.4 mL/只,初步反應(yīng)14 d后,左后足跖同法注射0.1 mL/只,加強(qiáng)反應(yīng) 6 d,以此建立CIA大鼠模型。完成造模后,參考文獻(xiàn)[3,10]選定給藥劑量,甘草酸組予甘草酸100 mg·kg-1,桂皮酸組予桂皮酸8.68 mg·kg-1,甘草酸桂皮酸合用組予甘草酸100 mg·kg-1,桂皮酸8.68 mg·kg-1,雷公藤多苷組予雷公藤多苷10 mg·kg-1,模型組予2 mL生理鹽水。連續(xù)灌胃20 d,1次/ d。

    2.2 大鼠足爪圖片和X射線(xiàn)影像

    取材前拍取大鼠足爪圖片和 X射線(xiàn)影像,評(píng)估CIA造模和藥物對(duì)大鼠足爪病變的影響。

    2.3 取材

    大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)進(jìn)行麻醉。待大鼠完全麻醉后,股動(dòng)脈取血,靜置1.5 h后離心(4 000 r/min,20 min),取上清,-80 ℃保存。然后打開(kāi)腹腔,取出脾臟,以純水洗凈,-80 ℃保存。剪開(kāi)兩側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚,用刀片完整剝?nèi)∠ドw髕韌帶下淡黃色的滑膜組織,標(biāo)記后放入包埋盒,10%多聚甲醛浸泡48 h。

    2.4 血清HIF-1α、MMP1及MMP3含量檢測(cè)

    取大鼠血清,嚴(yán)格參照 HIF-1α/MMP1/MMP3 ELISA試劑盒說(shuō)明,檢測(cè)血清中HIF-1α、MMP1及MMP3的含量。

    2.5 組織切片的制作與觀察

    取大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜,常規(guī)石蠟包埋,5 μm切片。采用HE染色觀察其形態(tài)學(xué)變化;采用免疫組化染色檢測(cè)HIF-1α、MMP1及MMP3陽(yáng)性表達(dá)。

    2.6 RT-PCR法檢測(cè)脾臟MicroRNA22表達(dá)

    剪取100 mg脾臟,加1 mL Trizol用勻漿器研磨成漿,轉(zhuǎn)至無(wú)RNase的1.5 mL EP管中,裂解10 min。加入200 μL氯仿,劇烈顛倒混勻數(shù)次,室溫靜置5 min。4 ℃,12 000 rpm,離心15 min,可見(jiàn)分成上(RNA)、中(蛋白)、下(DNA)三相。轉(zhuǎn)移上層水相(約400 μL)于另一干凈1.5 mL EP管中,加入400 μL異丙醇,混勻后室溫靜置10 min。4 ℃,12 000 rpm,離心10 min,管底可見(jiàn)白色的RNA沉淀。棄上清,加入無(wú)RNase的75%乙醇1 mL,渦旋混勻后,4 ℃,10 000 rpm,離心5 min,重復(fù)1次。棄上清,空氣中干燥RNA沉淀5~10 min,將沉淀溶于20 μL DEPC水中。取溶解后的RNA 2 μL用微量分光光度計(jì)測(cè)定OD260、OD280以及OD260/OD280值,計(jì)算RNA的純度和濃度。依據(jù)OD260/OD280比值,估測(cè)RNA質(zhì)量,比值在1.8~2.0符合實(shí)驗(yàn)要求。依據(jù)吸光光度值,按公式[總RNA濃度(μg/μL)=OD260×40×10-3]計(jì)算樣品RNA的濃度。將總RNA放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。各取已知純度與濃度的RNA溶液5 μg,加入Oligo (dT) 18 (10 μmol/L)、dNTP (2.5 mmol/L)、5×Hiscript Buffer、Hiscript Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor,用ddH2O (Rnase free)配平至20 μL。加樣后以反應(yīng)條件:25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 5 min、4 ℃ 10 min行RNA逆轉(zhuǎn)錄,將生成的cDNA做6倍稀釋作為模板,在各基因中加入相應(yīng)目的基因上下游引物及SYBR熒光染料,設(shè)置反應(yīng)條件:50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min;95 ℃ 30 sec、60 ℃ 30 sec、40 cycles。繪制溶解曲線(xiàn),最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。引物序列見(jiàn)表1。

    表1 引物序列

    2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    3 結(jié)果

    3.1 大鼠足爪病變觀察

    造模后大鼠健康狀態(tài)逐漸惡化,消瘦,脫毛,足爪腫、畸形、溶骨、新骨增生,在造模第20天上述癥狀表現(xiàn)最突出。藥物干預(yù)后,足爪炎癥反應(yīng)減輕,尤其是甘草酸桂皮酸合用組、雷公藤多苷組減輕較明顯,溶骨現(xiàn)象基本消退,桂皮酸組癥狀減輕不明顯,關(guān)節(jié)畸形、溶骨仍然嚴(yán)重,并且可見(jiàn)明顯成骨現(xiàn)象,見(jiàn)圖1、圖2。綜上,類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型建立成功,甘草酸和桂皮酸能抗炎消腫,且甘草酸桂皮酸合用組作用較為明顯。

    3.2 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)學(xué)的影響

    與正常組比較,模型組滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損,炎性細(xì)胞表達(dá)明顯增加,血管翳增生。與模型組比較,各給藥組滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少及血管翳增生被抑制,甘草酸桂皮酸合用組改善作用最強(qiáng),見(jiàn)圖3。綜上,甘草酸、桂皮酸可緩解炎癥反應(yīng)與血管翳增生,甘草酸桂皮酸合用組作用明顯。

    3.3 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠血清 HIF-1α、MMP1及MMP3含量的影響

    與正常組比較,模型組大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3含量均明顯升高。與模型組比較,各給藥組HIF-1α、MMP1及MMP3含量均明顯低于模型組。綜上,甘草酸、桂皮酸能顯著降低大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3含量,見(jiàn)表 2。

    3.4 大黃素對(duì)RA大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)的影響

    與正常組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)顯著升高。與模型組比較,各給藥組HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)均明顯降低。上述3種蛋白表達(dá)均表現(xiàn)為甘草酸桂皮酸合用組下降最多,桂皮酸組下降最少,見(jiàn)表3及圖4、圖5、圖6。綜上,甘草酸、桂皮酸能顯著抑制大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá),甘草酸桂皮酸合用組時(shí)下調(diào)作用最強(qiáng)。

    注:A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組。

    注:A.正常對(duì)照;B.模型對(duì)照;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組。

    注:A.正常對(duì)照;B.模型對(duì)照;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組。

    表2 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠血清中HIF-1α與MMP1/3表達(dá)的影響

    注:A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組?;そM織免疫組化染色中棕黃色顆粒部分表示陽(yáng)性表達(dá)。

    注:A.正常對(duì)照組;B.模型對(duì)照組;C.甘草酸組;D.桂皮酸組;E.甘草酸桂皮酸合用組;F.雷公藤多苷組。

    3.5 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠脾臟MicroRNA22表達(dá)的影響

    與正常組比較,模型組大鼠脾臟中MicroRNA22基因表達(dá)明顯降低。與模型組比較,各給藥組MicroRNA22基因表達(dá)均明顯升高,甘草酸組和甘草酸桂皮酸合用組MicroRNA22基因表達(dá)比正常組還顯著上升。綜上,各給藥組各劑量均能顯著上調(diào)RA大鼠脾臟中MicroRNA22表達(dá),見(jiàn)表 4。

    表4 甘草酸、桂皮酸對(duì)RA大鼠脾臟中MicroRNA22表達(dá)的影響

    4 討論

    MicroRNA是廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的一類(lèi)內(nèi)源性、非編碼的單鏈小分子 RNA[11]。MicroRNA通過(guò)引起靶mRNA降解、翻譯抑制、脫腺苷酸化,調(diào)控多個(gè)上游基因表達(dá)及下游蛋白翻譯,是細(xì)胞基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(Cellular gene regulatory network)中的重要組成部分,約90%的蛋白編碼基因受MicroRNA的調(diào)控[12-13]。其中MicroRNA-22是由22個(gè)核苷酸組成的非編碼蛋白R(shí)NA,在細(xì)胞發(fā)育、造血過(guò)程、器官形成、細(xì)胞增殖、凋亡及腫瘤發(fā)生等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[14]。HIF-1α是體內(nèi)細(xì)胞應(yīng)答缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵因子[15]。研究[16]表明,HIF-1α在RA患者的受累關(guān)節(jié)中過(guò)度表達(dá)是RA的重要靶點(diǎn),本課題組前期實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn),RA大鼠中HIF-1α的表達(dá)是增強(qiáng)的。在RA發(fā)病過(guò)程中,大量關(guān)節(jié)軟骨的破壞是關(guān)鍵性的臨床癥狀。而這種破壞是由滑膜中,高活性的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)所介導(dǎo)。MMPs具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用,其中,MMP-1負(fù)責(zé)降解細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分Ⅰ型膠原蛋白,而MMP-3的作用則更廣泛,其與關(guān)節(jié)的炎癥及損壞密切相關(guān)[17]。有研究[18]表明,在缺氧條件下MMP-3的表達(dá)完全受HIF-1α調(diào)控,而 MMP-1表達(dá)也部分受其調(diào)控。RA中滑膜襯里層增生、滑膜細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及無(wú)功能血管形成,造成受累關(guān)節(jié)滑膜缺氧。此時(shí),MicroRNA22通過(guò)減少表達(dá)來(lái)激活靶基因:翻譯HIF-1α的mRNA,使HIF-1α分泌增多。MMP-3 /MMP-1表達(dá)量受HIF-1α調(diào)控上升,促進(jìn)軟骨降解及骨破壞,最終導(dǎo)致RA病情發(fā)展[18,19-21]。

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,造模后大鼠逐漸出現(xiàn)倦怠、跛行、腹瀉、脫毛、厭食、消瘦等亞健康體征。雙后足爪逐漸出現(xiàn)軟組織紅腫、關(guān)節(jié)畸形、骨基質(zhì)破壞及后期新骨增生等現(xiàn)象,于造模第20天上述癥狀表現(xiàn)最嚴(yán)重。用甘草酸、桂皮酸干預(yù),大鼠體質(zhì)量下降幅度變小,腹瀉緩解,其中,甘草酸桂皮酸合用組效果比甘草酸組、桂皮酸組更佳。與模型組比較,甘草酸桂皮酸合用組大鼠足爪軟組織紅腫、關(guān)節(jié)畸形及溶骨現(xiàn)象基本消退。甘草酸組大鼠足爪軟組織紅腫、關(guān)節(jié)畸形明顯好轉(zhuǎn),但溶骨與成骨現(xiàn)象仍然明顯。桂皮酸組關(guān)節(jié)畸形、溶骨及成骨現(xiàn)象嚴(yán)重?;そM織HE染色結(jié)果顯示,正常組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織形態(tài)正常,結(jié)構(gòu)清晰。而模型組滑膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷,炎性細(xì)胞表達(dá)顯著上升,血管翳增生。連續(xù)灌胃甘草酸、桂皮酸20 d后,滑膜組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,血管翳增生被抑制,甘草酸桂皮酸合用組大鼠病變減輕較明顯。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型建立成功,甘草酸、桂皮酸具有抗炎消腫、抑制新生血管形成、保護(hù)骨與軟骨的作用,甘草酸、桂皮酸協(xié)同作用,對(duì)RA的治療效果更佳。滑膜組織免疫組化染色檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織中HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)均顯著增加;與模型組比較,各給藥組HIF-1α、MMP1及MMP3蛋白表達(dá)均明顯下調(diào)。大鼠血清檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠血清中HIF-1α、MMP1及MMP3水平均明顯增加;與模型組比較,各給藥組HIF-1α、MMP1及MMP3表達(dá)均明顯降低。而脾臟RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠脾臟中MicroRNA22基因表達(dá)水平明顯降低;甘草酸、桂皮酸干預(yù)20 d天后,與模型組比較,MicroRNA22基因表達(dá)水平均明顯上升,甘草酸組、甘草酸桂皮酸合用組還高于正常組水平。

    由此,可推測(cè)甘草酸、桂皮酸對(duì)RA的作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制MicroRNA22,調(diào)控HIF-1α-MMP1/3信號(hào)通路中相關(guān)分子生成,從而控制炎性發(fā)展,降低骨與軟骨組織損傷,減少新生血管生成。

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