補(bǔ)腎活血中藥方血清對(duì)離體狀態(tài)下血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障模型的保護(hù)作用△

袁晨 張梅 謝學(xué)軍

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)能導(dǎo)致糖尿病性黃斑水腫，進(jìn)一步會(huì)引起患者視力喪失，是目前常見(jiàn)的眼底血管性疾病和主要的致盲原因[1]。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療DR取得了較大進(jìn)展。在長(zhǎng)期的臨床觀察中人們發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血中藥方(由干地黃、丹參、人參、葛根配伍而成)能有效改善DR患者眼底病變，提高視力。血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(iBRB)是DR等視網(wǎng)膜血管性疾病發(fā)生的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，iBRB受損是臨床上和實(shí)驗(yàn)中DR共有的病理特征。秦學(xué)維[2]通過(guò)在體模型研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎活血中藥方具有保護(hù)早期糖尿病大鼠iBRB，減輕視網(wǎng)膜水腫的作用。本研究探討離體狀態(tài)下補(bǔ)腎活血中藥方血清對(duì)體外iBRB模型的保護(hù)作用，為臨床更好地應(yīng)用補(bǔ)腎活血中藥方防治DR等視網(wǎng)膜血管性疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料取出生7 d SD大鼠50只，雌雄不限，均由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)為清潔級(jí)，用于取材及細(xì)胞原代培養(yǎng)。青霉素-鏈霉素溶液、免疫熒光一抗稀釋液、免疫熒光二抗稀釋液、DAPI、抗熒光淬滅劑、多聚賴(lài)氨酸溶液、乙醇(北京碧云天生物技術(shù)有限公司)，DMEM、胎牛血清、I型膠原酶、胰蛋白酶、PBS(美國(guó)Gibco公司)，小鼠IgG免疫磁珠、大鼠抗小鼠CD31(美國(guó)eBioscience公司)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、連二亞硫酸鈉(美國(guó)Sigma公司)，一抗Anti Occludin(兔來(lái)源)、一抗Anti ZO-1(兔來(lái)源)、二抗AntiAlexa Fluro 647(抗兔)、二抗Anti FITC(抗兔)(美國(guó)Abcam公司)，0.22 μm混合纖維素濾膜、0.4 μm Transwell小室、Millicell ERS細(xì)胞電阻儀(美國(guó)Millipore公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)，光學(xué)顯微鏡、照相系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)，補(bǔ)腎活血中藥方浸膏由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制劑室提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)將出生7 d的SD大鼠脫頸處死，無(wú)菌條件下取出眼球，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡15 min，用含有100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的PBS沖洗3次后，放于DMEM液中，在顯微鏡下，收集視網(wǎng)膜。用PBS洗滌后切成小塊，加入1 g·L-1的I型膠原酶，37 ℃消化30 min，過(guò)濾，1000 r·min-1離心5 min，加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞。加入CD31抗體包被的免疫磁珠，4 ℃孵育30 min。繼續(xù)1000 r·min-1離心5 min后，將細(xì)胞重懸于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM中，轉(zhuǎn)移至試管并放置在磁體中2 min。去除上清液，將試管移出分選架，按照上述方式再次重懸、分離細(xì)胞，收集沉淀。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM洗滌結(jié)合磁珠的細(xì)胞4次，將細(xì)胞接種于0.1 g·L-1的L-多聚賴(lài)氨酸溶液包被的培養(yǎng)板中，加入視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RMEC)培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素及100 mg·L-1內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑的DMEM培養(yǎng)液)，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞融合80%時(shí)，用PBS洗滌，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶消化2 min，用RMEC培養(yǎng)液終止消化，1000 r·min-1離心10 min，收集細(xì)胞。將細(xì)胞以1×106個(gè)·mL-1的密度接種于培養(yǎng)瓶，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)傳代[3-4]。

1.2.2 大鼠視網(wǎng)膜Müller膠質(zhì)細(xì)胞分離及傳代培養(yǎng)將出生7 d的SD大鼠脫頸處死，無(wú)菌條件下取出眼球，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡15 min，用含有100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的PBS沖洗3次后，放于DMEM液中，置于含體積分?jǐn)?shù)5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱過(guò)夜。用PBS洗滌后，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶37 ℃下消化1 h后，吸出消化液，加入含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，終止消化。在顯微鏡下，收集視網(wǎng)膜組織。然后將視網(wǎng)膜組織反復(fù)吹打形成乳糜狀，接種于培養(yǎng)瓶中，加入Müller細(xì)胞培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72 h后換液。傳代方法及培養(yǎng)環(huán)境同RMEC[5]。

1.2.3 體外iBRB模型的制備取第三代大鼠RMEC，換液加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。取第二代大鼠視網(wǎng)膜Müller膠質(zhì)細(xì)胞(RMGC)，換液加入RMEC培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。用10 g·L-1明膠提前包被微孔膜，用2.5 g·L-1胰蛋白酶分別消化兩種細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。先將Transwell小室倒置，將RMGC以10×103個(gè)·mL-1的密度接種在小室外底面。置于培養(yǎng)箱中，等大部分RMGC貼壁后，翻轉(zhuǎn)小室置于12孔板的孔中，將RMEC以20×103個(gè)·mL-1的密度接種在小室內(nèi)底面，分別補(bǔ)充上下室培養(yǎng)液[4]。用細(xì)胞電阻儀測(cè)量模型的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(TEER)，當(dāng)TEER≥90 Ω·cm2時(shí)，模型構(gòu)建成功。

1.2.4 補(bǔ)腎活血中藥方血清的制備另取20只體質(zhì)量120～150 g的SD大鼠隨機(jī)分成兩組，分別為中藥含藥血清組、空白對(duì)照組，每組10只大鼠。中藥含藥血清組每天給予大鼠補(bǔ)腎活血中藥方浸膏，給藥劑量為11.67 g·kg-1·d-1，每天灌胃1次，連續(xù)7 d?？瞻讓?duì)照組每天給予等體積的生理鹽水。在末次給藥1 h后，采大鼠腹主動(dòng)脈血，將采集的血液于4 ℃靜置24 h，3000 r·min-1離心10 min后分離血清；將分離的血清置于56 ℃水中30 min滅活，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌、分裝為5 mL，分別標(biāo)記為中藥含藥血清和空白血清，-20 ℃保存?zhèn)溆肹6-7]。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組及處理本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分8組。選取構(gòu)建成功的體外iBRB細(xì)胞共培養(yǎng)模型，按不同培養(yǎng)條件進(jìn)行分組，其中正常對(duì)照組用含體積分?jǐn)?shù)20%空白血清的DMEM液培養(yǎng)；中藥干預(yù)正常組用含體積分?jǐn)?shù)20%中藥含藥血清的DMEM液培養(yǎng)；低AGEs組用含體積分?jǐn)?shù)20%空白血清的DMEM液及終濃度50 mg·L-1AGEs培養(yǎng)；中藥干預(yù)低AGEs組用含體積分?jǐn)?shù)20%中藥含藥血清的DMEM液及終濃度50 mg·L-1AGEs培養(yǎng)；高AGEs組用含體積分?jǐn)?shù)20%空白血清的DMEM液及終濃度100 mg·L-1AGEs培養(yǎng)；中藥干預(yù)高AGEs組用含體積分?jǐn)?shù)20%中藥含藥血清的DMEM液及終濃度100 mg·L-1AGEs培養(yǎng)；缺氧組用含體積分?jǐn)?shù)20%空白血清的DMEM液及終濃度1.0 mmol·L-1連二亞硫酸鈉培養(yǎng)；中藥干預(yù)缺氧組用含體積分?jǐn)?shù)20%中藥含藥血清的DMEM液及終濃度1.0 mmol·L-1連二亞硫酸鈉培養(yǎng)。在各組培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.6 細(xì)胞電阻儀檢測(cè)各組RMEC層的TEER每次測(cè)量前先將Transwell上、下室中的培養(yǎng)液更換為新鮮培養(yǎng)液，然后用電阻儀進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)備有兩個(gè)電極，測(cè)量時(shí)將一個(gè)電極放上室，另一個(gè)放下室。首先用一個(gè)放有Transwell的無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)的空白孔進(jìn)行空白電阻值(R0)測(cè)定。然后測(cè)量各實(shí)驗(yàn)組電阻值，測(cè)量時(shí)每孔在3個(gè)不同點(diǎn)檢測(cè)電阻值，計(jì)算平均值(Rt)。根據(jù)公式：TEER=(Rt-R0)×S計(jì)算TEER，S為小室的有效膜表面積。

1.2.7 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)各組Occludin、ZO-1蛋白在RMEC層的表達(dá)用PBS漂洗制備好的細(xì)胞爬片，40 g·L-1多聚甲醛室溫固定爬片，PBS浸洗3次，每次3 min。在爬片上滴加體積分?jǐn)?shù)6%山羊血清，室溫封閉30 min。用吸水紙吸掉封閉液，每張爬片上滴加一抗Occludin(稀釋比1100)放入濕盒，4 ℃孵育過(guò)夜，復(fù)溫30 min后用PBS浸洗3次，每次3 min，滴加熒光二抗647(稀釋比1800)，放濕盒中37 ℃孵育1 h。用PBS清洗爬片3次，每次3 min，繼續(xù)滴加一抗ZO-1(稀釋比1200)，放濕盒中37 ℃孵育1 h；再用PBS清洗爬片3次，每次3 min，滴加熒光二抗FITC(稀釋比1800)，放濕盒中37 ℃孵育1 h。用PBS清洗爬片3次，每次3 min，滴加DAPI避光孵育15 min。最后用PBS清洗爬片4次，每次5 min，用抗熒光淬滅劑封片，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組RMEC層TEER檢測(cè)結(jié)果在AGEs或缺氧條件下，低AGEs組、高AGEs組及缺氧組RMEC層TEER在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后均低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，中藥干預(yù)正常組與正常對(duì)照組RMEC層TEER相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，在細(xì)胞培養(yǎng)48 h后中藥干預(yù)正常組RMEC層TEER高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在細(xì)胞培養(yǎng)72 h后中藥干預(yù)正常組RMEC層TEER低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥干預(yù)低AGEs組、中藥干預(yù)高AGEs組、中藥干預(yù)缺氧組RMEC層的TEER在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后均高于同一時(shí)段相對(duì)應(yīng)的非中藥干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后各組RMEC層TEER檢測(cè)結(jié)果

2.2 各組Occludin、ZO-1蛋白在RMEC層的表達(dá)情況免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果顯示：低AGEs組、高AGEs組及缺氧組Occludin、ZO-1蛋白在RMEC層的陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后均弱于正常對(duì)照組。在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后中藥干預(yù)正常組、中藥干預(yù)低AGEs組、中藥干預(yù)高AGEs組、中藥干預(yù)缺氧組Occludin、ZO-1蛋白在RMEC層的陽(yáng)性表達(dá)均強(qiáng)于同一時(shí)段相對(duì)應(yīng)的非中藥干預(yù)組(見(jiàn)圖1)。

圖1 免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后各組Occludin、ZO-1蛋白在RMEC層的表達(dá)變化(×400)

3 討論

DR是多種因素共同作用的結(jié)果，其中AGEs是機(jī)體在長(zhǎng)期慢性高血糖狀態(tài)下產(chǎn)生的一種終末產(chǎn)物，AGEs的形成與堆積是DR微血管病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。此外，缺氧在DR發(fā)生中也具有重要的作用，是DR的主要發(fā)病機(jī)制之一[9-12]。

iBRB是DR等視網(wǎng)膜血管性疾病的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，它對(duì)于調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜微環(huán)境的平衡，維持視網(wǎng)膜的正常代謝以及結(jié)構(gòu)和功能的完整性起到了至關(guān)重要的作用[13-14]。iBRB是由相鄰的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接形成[15]。目前iBRB模型的體外研究，大部分采用RMEC單獨(dú)培養(yǎng)的模型。研究表明，Müller細(xì)胞能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞形成屏障，在視網(wǎng)膜血管屏障的形成中起著重要作用[16]。RMGC在RMEC由非屏障細(xì)胞向屏障細(xì)胞轉(zhuǎn)變的誘導(dǎo)和維持中扮演著積極的角色。為了更好地模擬iBRB，本實(shí)驗(yàn)將RMGC和RMEC共培養(yǎng)構(gòu)建了體外iBRB細(xì)胞模型。研究顯示，在這種三維培養(yǎng)模型中，RMGC可以誘導(dǎo)RMEC相互間形成緊密連接，并有緊密連接蛋白表達(dá)和高TEER等特征[4]。本實(shí)驗(yàn)中構(gòu)造低AGEs、高AGEs及缺氧等條件，旨在觀察處于不同病理狀態(tài)下的體外iBRB模型通透性的變化，并以補(bǔ)腎活血中藥方血清進(jìn)行干預(yù)，探討補(bǔ)腎活血中藥方血清對(duì)不同病理?xiàng)l件下體外iBRB的保護(hù)作用，為臨床更好地應(yīng)用補(bǔ)腎活血中藥方防治DR等視網(wǎng)膜血管性疾病提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

iBRB的完整性和通透性可通過(guò)TEER和細(xì)胞旁通透性來(lái)進(jìn)行評(píng)估[17]。其中TEER是內(nèi)皮組織屏障完整性的良好指標(biāo)，是評(píng)估緊密連接的離子運(yùn)輸和屏障通透性的有效工具[18]。iBRB的破壞是DR早期的特征性病理學(xué)改變，會(huì)導(dǎo)致屏障通透性升高，加重了屏障的滲漏。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，低AGEs組、高AGEs組及缺氧組RMEC層的TEER均低于正常對(duì)照組(均為P<0.05)，說(shuō)明低AGEs、高AGEs及缺氧條件都可以導(dǎo)致體外iBRB功能受損，此時(shí)屏障通透性增加，滲漏加重，導(dǎo)致TEER下降。已有研究證實(shí)TEER與內(nèi)皮細(xì)胞通透率成反比[19-20]，本研究結(jié)果與這一觀點(diǎn)相一致。

中藥干預(yù)低AGEs組、中藥干預(yù)高AGEs組、中藥干預(yù)缺氧組RMEC層TEER在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后均高于同一時(shí)段相對(duì)應(yīng)的非中藥干預(yù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。這說(shuō)明補(bǔ)腎活血中藥方血清能減輕iBRB屏障的損傷，降低模型通透性增加的程度，抑制了屏障滲漏進(jìn)一步加重過(guò)程，從而升高了TEER。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：在細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，中藥干預(yù)正常組與正常對(duì)照組的TEER相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在細(xì)胞培養(yǎng)48 h后中藥干預(yù)正常組的TEER高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在細(xì)胞培養(yǎng)72 h后中藥干預(yù)正常組的TEER低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。據(jù)此我們推測(cè)，補(bǔ)腎活血中藥方血清不僅對(duì)病理?xiàng)l件下的細(xì)胞有保護(hù)作用，也對(duì)正常細(xì)胞也有一定的影響，但這種影響有一定的時(shí)效性，在細(xì)胞培養(yǎng)48 h時(shí)影響最大。

內(nèi)皮細(xì)胞間廣泛的緊密連接既是iBRB的重要組成部分，也是細(xì)胞旁路徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[21]。其中，Occludin和ZO-1蛋白是非常關(guān)鍵的兩種緊密連接蛋白，對(duì)緊密連接結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定起著重要作用[22-24]。緊密連接蛋白表達(dá)量的變化、在細(xì)胞內(nèi)的位置分布變化和(或)結(jié)構(gòu)功能的異常均能破壞緊密連接的完整性，引起細(xì)胞間連接開(kāi)放，導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增高[25]。本研究結(jié)果顯示：低AGEs組、高AGEs組及缺氧組Occludin、ZO-1蛋白在RMEC層的陽(yáng)性表達(dá)在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后均弱于正常對(duì)照組，說(shuō)明低AGEs、高AGEs及缺氧均會(huì)造成體外iBRB細(xì)胞間的緊密連接受損，細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白表達(dá)減弱，這是導(dǎo)致病理?xiàng)l件下iBRB細(xì)胞模型通透性增加的一個(gè)重要原因。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，中藥干預(yù)正常組、中藥干預(yù)低AGEs組、中藥干預(yù)高AGEs組、中藥干預(yù)缺氧組Occludin、ZO-1蛋白在RMEC層的陽(yáng)性表達(dá)均強(qiáng)于同一時(shí)段相對(duì)應(yīng)的非中藥干預(yù)組，說(shuō)明補(bǔ)腎活血中藥方血清通過(guò)提高Occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)，來(lái)修復(fù)AGEs及缺氧條件下體外iBRB模型緊密連接的損傷。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)體外iBRB模型的TEER及緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AGEs及缺氧等不同病理狀態(tài)均可使體外iBRB細(xì)胞模型的TEER降低，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1表達(dá)下降(提示模型通透性的增加)；而補(bǔ)腎活血中藥方血清能有效提高Occludin和ZO-1蛋白的表達(dá)，抑制iBRB模型通透性增加，減輕iBRB屏障滲漏。這可能是補(bǔ)腎活血中藥方在AGEs及缺氧條件下降低iBRB模型通透性的一個(gè)重要干預(yù)途徑。