青光眼發(fā)病機制相關分子途徑研究進展△

劉宇航 毛小雪 牛媖 劉思源 任婉娜

青光眼是以視野缺損、視力下降、神經(jīng)節(jié)細胞不可逆性凋亡為主要特征的神經(jīng)退行性疾病。作為全球第一大不可逆致盲眼病，估計 2040 年全球患者數(shù)將達 1．118 億[1]。由于其進展隱匿，損失的視力往往不可恢復，被稱為“視力的小偷”。目前關于青光眼的發(fā)病機制有多種說法，如：表觀遺傳調控、細胞凋亡機制、氧化應激損傷、β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性作用等，但尚無一個確切的分子通路可以完全解釋青光眼的發(fā)病機制。在治療上，目前臨床上主要以藥物、手術或聯(lián)合多種方式降低眼壓，輔以營養(yǎng)神經(jīng)等，手段較為單一，部分患者療效不顯著。本綜述列舉近年青光眼發(fā)病機制相關分子途徑，期待針對這些途徑通路的阻斷劑能成為未來青光眼靶向治療藥物研發(fā)的新方向。

1 表觀遺傳調控與青光眼

表觀遺傳學的概念由Waddington于1942年提出，是指在DNA核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達產(chǎn)生了可遺傳的改變[2]。表觀遺傳學主要機制包括DNA甲基化、組蛋白修飾以及微小RNA (micro-RNA，miRNA)。表觀遺傳學理論認為青光眼是一種遺傳和環(huán)境綜合作用的復雜疾病，環(huán)境因素可以通過表觀遺傳調控的方式作用于基因組DNA，調節(jié)基因的表達，產(chǎn)生長期的表型改變，并最終導致疾病的發(fā)生[3]。

1.1 DNA甲基化和青光眼DNA 甲基化指在 DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT) 的催化下，S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM) 的甲基被轉移至DNA序列上的過程，DNA 甲基化是一種穩(wěn)定的基因沉默機制，可以通過改變 DNA 結構，排斥轉錄激活因子，阻遏轉錄[4-5]。對于哺乳動物，DNA 甲基化主要發(fā)生于胞嘧啶 C-磷酸 p-鳥嘌呤G(CpG)二核苷酸的胞嘧啶殘基，生成產(chǎn)物為 5-甲基胞嘧啶(5-mC)[6]。Burdon等[7]進行的一項病例對照研究發(fā)現(xiàn)，CDKN2B 啟動子區(qū)域的一個 CpG 位點的甲基化水平與正常眼壓性青光眼(normal tension glaucoma，NTG) 明顯相關。DNA 甲基化水平異常導致眼組織異常纖維化主要與轉化生長因子 β(TGF-β) 信號通路異常相關。TGF-β 信號通路異常激活可導致細胞外基質過度堆積，改變細胞骨架結構和細胞間距，使小梁網(wǎng)和篩板纖維化，影響房水外流，同時也可導致篩板區(qū)域僵硬，使得視神經(jīng)更容易在高眼壓的作用下受到損傷[8]。使用DNA 甲基化抑制劑5-氮雜胞苷處理青光眼患者小梁網(wǎng)可使小梁網(wǎng)纖維化水平降低[9]。提示DNA甲基化可能與青光眼小梁網(wǎng)損傷機制相關。

1.2 組蛋白乙酰化和青光眼組蛋白的乙?；亲钪匾慕M蛋白修飾機制之一，乙?；梢韵嚢彼釟埢恼姾桑蓴_組蛋白和DNA 之間的相互作用，使染色質穩(wěn)定性降低，有利于激活轉錄； 而組蛋白去乙?；瘎t增加染色質穩(wěn)定性，抑制轉錄[10-11]。使用組蛋白去乙?；种苿?TDP-A)處理灌注離體培養(yǎng)的牛眼后，TGF-β2 表達水平升高，細胞骨架蛋白、細胞外基質增加，眼壓增高。因此，組蛋白高乙?；赡芘c青光眼小梁網(wǎng)損傷機制相關[12]。

1.3 miRNA和青光眼miRNAs 是含有18～20個核苷酸的短鏈非編碼RNA，miRNA與目的基因信使 RNA(mRNA)的 3’非翻譯區(qū)(3’UTR) 結合后，介導mRNA降解或轉錄后水平的基因沉默，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物發(fā)育、器官形成、病毒防御、表觀調控以及代謝等方面均發(fā)揮重要作用[13-14]。據(jù)估計,miRNA占人類基因組的 1%～5%,高達 60%的蛋白質編碼基因在轉錄后水平受到 miRNA的調控[15-16]。Ghanbari等[17]進行的一項全基因組 miRNA相關基因位點變異的研究顯示，原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma，POAG) 與對照存在 411 個 miRNA位點變異，另外有 47 個 miRNA結合位點的變異與POAG表型顯著相關，其中2個變異位點分別影響了miR-138-3p 和 miR-323b-5p 對 CDKN2B的調節(jié)作用[17]。

2 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡與青光眼

青光眼患者中，導致細胞損傷的因素，如高眼壓、血流動力學障礙、氧化應激損傷和炎癥反應、興奮性谷氨酸毒性作用、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等均可作為凋亡調控相關信號導致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell，RGC)凋亡。細胞凋亡是細胞受到致死因素后的程序性死亡，主要通過死亡受體途徑、線粒體途徑、內質網(wǎng)途徑發(fā)生。但參與RGC凋亡的具體分子信號途徑目前尚未明確，探索分子途徑上下游信號及其作用尤為重要[18]。

2.1 死亡受體途徑包括凋亡相關因子(factor associated suicide，F(xiàn)as)和腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)。

2.1.1 Fas受體通路Fas(CD95)是TNF /NGF受體家族的膜蛋白，相應的 Fas 配體(Fas ligand，F(xiàn)asL)屬于胞外TNF超家族成員，在免疫豁免位置如眼上表達。FasL結合凋亡細胞上表達的受體 Fas三聚化并活化，通過Fas相關死亡結構域蛋白(Fas associated death domain，F(xiàn)ADD)募集銜接蛋白。銜接蛋白可通過死亡結構域與caspase-8前體(pro-caspase 8)形成由FasL-Fas-FADD-procaspase-8串聯(lián)構成的死亡誘導信號復合物(death-inducing signal complex，DISC)。在DISC內，高濃度的procaspase-8可以自我剪接和活化，然后釋放到細胞質并啟動caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。

2.1.2 TNFR通路TNF 結合TNFR之后發(fā)生三聚體化，然后招募1個銜接蛋白腫瘤壞死因子受體 Ⅰ 型相關死亡結構域蛋白(tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain protein，TRADD)。TRADD 可以再招募其他3個銜接分子：FADD(即Fas/FasL 通路中的 FADD 分子)、腫瘤壞死因子受體相關因子 2(tumor necrosis factor receptor-associated factor-2，TRAF-2)和受體相互作用蛋白(receptor interactive protein，RIP)。如果 TRADD 和 RIP/TRAF-2 相互結合，下游激活 NF-κB 通路或者 JNK/AP-1 通路；如果TRADD 和 FADD 相互結合，那么下游可以招募和活化caspases，并激活凋亡通路。

2.2 線粒體途徑線粒體被認為是處于凋亡調控的中心位置，死亡信號激活含BH3結構域的Bcl-2 家族成員，例如 Bax發(fā)生寡聚化并插入線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，跨膜電位丟失，釋放細胞色素C(Cyt C)和其他蛋白。Cyt C 與凋亡蛋白酶活化因子 (apoptotic protease activating factor，Apaf-1)形成多聚復合體，通過Apaf-1 氨基端的 caspase 募集結構域 (caspase recruitment domain，CARD)，募集細胞質中的caspase-9 前體，并使其自我剪切活化，然后啟動caspase級聯(lián)反應，激活下游的caspase-3和caspase-7，完成其相應底物的剪切，引起細胞凋亡。

2.3 內質網(wǎng)途徑凋亡的內質網(wǎng)通路和線粒體通路或死亡受體介導的凋亡通路有很大的不同。當內質網(wǎng)內鈣離子平衡被破壞或者細胞質的caspase-7 轉移到內質網(wǎng)表面，都會誘導caspase-12 在內質網(wǎng)膜上的表達，激活后的caspase-12 可進一步剪切caspase-3，引發(fā)細胞凋亡。

3 氧化應激損傷與青光眼

氧化應激是一種生理適應機制，反映了活性氧的產(chǎn)生和抗氧化防御之間的不平衡。大多數(shù)生物，從細菌到人類，利用氧化應激來應對環(huán)境挑戰(zhàn)。與人類常見的由下丘腦、垂體和腎上腺調節(jié)的應激不同，其是由所謂的氧化還原系統(tǒng)控制的，氧化還原系統(tǒng)通過調節(jié)細胞信號、防御和解毒作用，在細胞穩(wěn)態(tài)和生存中發(fā)揮關鍵作用。氧化應激是一種新興的健康危險因素，它與早期衰老和常見疾病，尤其是青光眼有關，沒有任何臨床表現(xiàn)?？寡趸易灏ǔ趸锲缁?、過氧化氫酶、過氧化物酶和硫氧還蛋白等；外源性化合物如維生素和類維生素的抗氧化化合物，如多酚類、寡聚體等，二者都具有清除自由基、修復或自適應功能，這些物質均勻地分布在生物體內部[19-20]。

人眼房水流出通道更容易受到氧化損傷，其中房水流出通道包括2個屏障：小梁網(wǎng)細胞屏障和Schlemm管內皮細胞屏障，氧化損傷主要通過影響內皮細胞來達成青光眼不良事件。目前尚不清楚氧化損傷是由于抗氧化防御減少還是由于線粒體的主要損傷[21]。在青光眼進程中，小梁網(wǎng)相當于一個高度老化的組織：氧化DNA損傷與自噬激活之間存在顯著的關系，這是一種溶酶體降解途徑，對小梁網(wǎng)細胞的存活和穩(wěn)態(tài)至關重要。慢性氧化暴露導致溶酶體堿化和溶酶體酶的蛋白水解激活不足，從而降低自噬通量。 這可能是小梁網(wǎng)進展性年齡相關細胞功能衰竭的因素之一，也許有助于解釋POAG的發(fā)病機制[22-23]。因此，具有抑制氧化應激功能的某些物質，可能成為未來青光眼治療的新方式，如：凋亡信號調節(jié)激酶1、致胞質分裂因子3、丙戊酸、亞精胺、坎地沙坦、核因子紅系2相關因子2等[24]。氧化應激的增加和衰老相關，并且在神經(jīng)退行性疾病和神經(jīng)炎癥的發(fā)病機制中起重要作用。隨著全球預期壽命的急劇增加，迫切需要治療或管理與年齡相關的慢性神經(jīng)退行性疾病，如青光眼、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)和帕金森病[25-26]。

4 β淀粉樣蛋白與青光眼

眼是腦的延伸，眼在胚胎發(fā)育過程中由前腦神經(jīng)褶到視泡、視杯再到分化形成完整的結構，是腦部外延的一個特殊感光器官。AD是世界性癡呆的主要原因，是一種以慢性隱匿性認知相關功能障礙為表現(xiàn)，以神經(jīng)原纖維纏結、神經(jīng)元死亡為特征的神經(jīng)退行性疾病。青光眼與AD同為神經(jīng)退行性病變，流行病學研究表明，與一般健康人群相比，更多的AD患者可能患有青光眼，RGC損傷是這2種疾病的特征，同時在視網(wǎng)膜和眼房水中檢測到β淀粉樣蛋白和tau蛋白沉積，這2種蛋白被認為是AD的病原體。目前對于β淀粉樣蛋白在青光眼中的神經(jīng)毒理作用的研究還有很多缺失的環(huán)節(jié)尚不明確，但對于未來青光眼的治療提供了新的方向和可能。

4.1 AD和青光眼的相關流行病調查AD是世界范圍內引起老年人癡呆的主要病因，其主要危險因素是年齡。青光眼是以視野缺損、視力下降、RGC不可逆性凋亡為主要特征的神經(jīng)退行性疾病，二者均為神經(jīng)退行性疾病[27]。近年來，越來越多的學者聚焦于AD和青光眼之間的聯(lián)系。Bayer等[28]研究發(fā)現(xiàn)，在112例德國AD患者中有29例發(fā)現(xiàn)視野缺陷和杯盤比>0.8，青光眼患病率為25.9%，而對照組為5.2%，西方國家青光眼調查中發(fā)現(xiàn)的青光眼患病率為2.6%～4.7%，AD患者有更大的概率患上青光眼。Yochim等[29]評估了41例青光眼患者[年齡為(70.0±9.2)歲，其中70%為女性]的認知狀態(tài)。在對年齡進行控制后進行癡呆問卷調查，其中44.0%的患者表現(xiàn)出輕度的認知障礙，而12.2%的患者表現(xiàn)出輕至中度的認知障礙。近年來，Lin等[30]研究也表明，AD和POAG存在關聯(lián)，其在隨訪8 a的回顧性研究中將1351例年齡>65歲的中國臺灣AD患者青光眼的患病率與5329名非癡呆對照組進行了比較，發(fā)現(xiàn)POAG組和非POAG組AD的發(fā)生率和置信區(qū)間分別為每周每1000人中2.85 (95%CI 2.19～3.70)和1.98 (95%CI 1.68～2.31)，POAG可作為AD的顯著預測因子，二者有明顯關聯(lián)。然而，關于AD和青光眼的聯(lián)系也有相反的結論，Bach等[31]對丹麥69例NTG患者進行了平均時長12.7 a的隨訪，發(fā)現(xiàn)他們中沒有患者出現(xiàn)AD，并認為AD和NTG二者沒有關聯(lián)。

4.2 AD和青光眼相關的病理表現(xiàn)AD是一種起病隱匿、慢性進展的神經(jīng)退行性病變，其腦組織病理表現(xiàn)為：皮質和海馬區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡、β淀粉樣斑塊、神經(jīng)纖維纏結和視網(wǎng)膜空泡變性[32-34]。這一系列病理變化最終會導致腦萎縮和認知功能進行性下降。目前為止，尚無有效標記方法可以有效檢測AD，而由于AD的視網(wǎng)膜表現(xiàn)及眼和腦在某些程度上有一定的相似之處，非侵入性的視網(wǎng)膜成像技術或許能成為檢測軸突健康狀態(tài)的有效手段。光學相干斷層掃描(OCT)目前被廣泛應用于黃斑和視盤病變的檢測，可以分別分析視網(wǎng)膜的各個層厚度。Ascaso等[35]在一項橫斷面研究中選取了41名健康對照者，18例AD患者以及21例輕度認知功能障礙(mild-cognitive-impairment，MCI)患者，所有患者均行OCT測量視盤及黃斑區(qū)周圍視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(thickness of peripheral retinal fiber layer，RNFL)厚度，發(fā)現(xiàn)AD患者的RNFL明顯小于MCI患者，而MCI患者的RNFL明顯小于健康對照。RNFL厚度變薄被認為是神經(jīng)節(jié)細胞凋亡的繼發(fā)性改變，而這正是青光眼表現(xiàn)的終點[36]。視神經(jīng)軸突的變性及RGC細胞數(shù)量的減少導致青光眼特征性視盤的形成。而RGC的損傷是通過細胞凋亡、氧化應激、線粒體功能障礙、興奮性毒性和胰島素抵抗等多種途徑聯(lián)合作用而發(fā)生的[37-39]。β淀粉樣蛋白作為一種已知的神經(jīng)毒性肽，AD的病因之一，可能參與了青光眼RGC的凋亡過程。

4.3 β淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性作用β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)是由和β和γ分泌酶分泌的一類跨膜糖蛋白，可產(chǎn)生具有細胞毒性的β淀粉樣蛋白(beta-amyloid,Aβ)。其中APP的功能尚不完全清楚，除了產(chǎn)生具有細胞毒性的Aβ之外，由α分泌酶分泌的可溶性APP(sAPPa)具有一定的神經(jīng)保護作用[40]。Aβ的存在形式分為可溶性的單體、寡聚體和不溶性的纖維狀斑塊，Aβ單體相互聚集形成Aβ寡聚體，Aβ寡聚體進一步聚集形成Aβ斑。從組織學角度看，AD的兩個主要特征是Aβ斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(neurofibrillary tangles，NFTs)，后者主要由高磷酸化的tau蛋白組成，這是一種微管相關蛋白(MAP)，對維持神經(jīng)極性和結構至關重要[41]。已有研究表明，Aβ的積累可導致微管tau蛋白的解體，并促進其過度磷酸化[42-43]。tau蛋白的過度磷酸化及其隨后的低聚作用導致細胞內NFTs的形成，最終，細胞毒性NFTs與寡聚物Aβ協(xié)同作用，導致突觸功能障礙和軸突缺失[44-45]。Aβ寡聚物發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的細胞機制是多方面的，包括突觸毒性和線粒體功能障礙，可能與氧化應激和代謝障礙有關。突觸毒性作為Aβ的一個突出特性，通過Aβ體外處理大腦或者海馬區(qū)神經(jīng)元的部分相關研究表明，Aβ低聚物可通過減少突觸處的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酮酸(AMPA)和N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體數(shù)量來減少谷氨酸能突觸傳遞[46-49]。根據(jù)突觸類型、神經(jīng)元類型和大腦區(qū)域的不同，Aβ可能對突觸活動產(chǎn)生不同的影響，導致神經(jīng)元網(wǎng)絡的不平衡和不穩(wěn)定[50]。在細胞水平，Aβ介導的改變包括向興奮性增強的轉變，表現(xiàn)為神經(jīng)元膜的靜息電位降低[51]。在大腦中，可溶性Aβ肽在線粒體內的積累可抑制不同呼吸酶的活性，導致ATP產(chǎn)生減少，增加活性氧自由基的產(chǎn)生，并損害線粒體膜的通透性[52-55]。線粒體功能障礙是各種神經(jīng)退行性疾病的共同特征，細胞內Aβ與軸索病和凋亡啟動相關[56-57]。而在神經(jīng)元中，線粒體功能障礙也與興奮性毒性的易感性增加有關(如興奮性氨基酸，如谷氨酸對神經(jīng)元的過度刺激導致細胞死亡)[58]。不溶性Aβ聚集物也可直接通過釋放可溶性寡聚物[59]，或通過自適應細胞反應，如神經(jīng)膠質和內皮細胞的激活來間接導致細胞毒性，這2種方式分別可導致神經(jīng)炎癥[60]和與Aβ相關的血管病變[61]。當然，目前對于Aβ神經(jīng)毒性的研究更多的是針對腦神經(jīng)元，而AD患者死后的視網(wǎng)膜中可檢測出Aβ沉積，且青光眼患者的房水和玻璃體中均有檢測出Aβ，因此通過視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層的影像學檢查可以對AD患者進行很好的早期監(jiān)測，而針對Aβ神經(jīng)毒性作用的藥物有可能成為未來青光眼治療方面的研究方向，Aβ對視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維的具體作用機制尚不明確，有待于進一步研究[62-63]。

4.4 Aβ與青光眼青光眼是一組以視神經(jīng)退行性病變?yōu)樘卣鞯募膊?，伴有RGC的丟失。青光眼被認為會通過RGC死亡引起視野收縮和視力下降。雖然眼壓升高是青光眼的一個已知危險因素，但20%～90%的患者是NTG[64-66]。無論是近年來流行病學的相關研究，還是Aβ在神經(jīng)退行性疾病中的作用機制研究，無一不表明Aβ也參與了RCG的死亡。已經(jīng)證實青光眼小鼠中確有視盤Aβ的沉積和APP活動的增加[67]。Tsuruma等[68]使用Aβ的神經(jīng)毒性片段Aβ25-35處理原代培養(yǎng)小鼠皮層神經(jīng)元及RGC-5細胞，發(fā)現(xiàn)細胞以濃度依賴和時間依賴的方式死亡，而淀粉樣前體蛋白敲除抑制AP25-35誘導的細胞死亡，β和γ分泌酶抑制劑也可以減少細胞死亡。Mohd Lazaldin等[69]發(fā)現(xiàn)，玻璃體內注射Aβ1-40對大鼠視網(wǎng)膜及視神經(jīng)的損害呈濃度依賴和時間依賴，Aβ1-40誘導的損傷與視網(wǎng)膜氧化應激增加和視網(wǎng)膜腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子水平降低有關。Lin等[70]發(fā)現(xiàn)，向小鼠玻璃體內注射Aβ1-42可通過激活補體系統(tǒng)誘導小鼠視網(wǎng)膜炎癥反應和功能障礙。目前世界上關于Aβ對視網(wǎng)膜細胞損傷的研究較之對腦神經(jīng)元損傷尚且不足，二者損傷機制是否會有不同有待進一步研究證實。當前僅有研究證據(jù)肯定了Aβ在實驗動物體內以時間依賴和劑量依賴的方式誘導RGC凋亡。與此同時，針對Aβ途徑的靶向治療為青光眼的治療提供了一種新的思路，有希望替代傳統(tǒng)的青光眼控制眼壓治療：(1)β或γ分泌酶抑制劑減少Aβ生成；(2)Aβ抗體減少Aβ在視網(wǎng)膜的沉積；(3)抑制Aβ的聚集和神經(jīng)毒理作用。Li等[71]發(fā)現(xiàn)，在慢性青光眼大鼠模型中Aβ1-42和Aβ25-35在3 d時誘發(fā)的RGC凋亡達到巔峰，且在低濃度時Aβ1-42毒性更大。在預防RGC凋亡療效方面，Li等[71]發(fā)現(xiàn)，3種針對Aβ不同途徑的藥物均有效果，其中Aβ抗體(Aβantibody,Aβab)療效優(yōu)于β分泌酶抑制劑(βsecretase inhibitor,βSI)和剛果紅(congo red,CR)，且在眼壓開始升高的早期階段給藥優(yōu)于眼壓升高后2周給藥，聯(lián)合用藥優(yōu)于單藥應用。Aβab可以清除Aβ并減少其聚集，βSI是一種膜錨定天冬氨酸蛋白酶，負責類淀粉途徑中APP裂解的起始步驟，可抑制Aβ的產(chǎn)生，CR則通過干擾蛋白質的錯誤折疊和阻止離子通道的形成來阻止Aβ的聚集和神經(jīng)毒性。近年相關文獻研究證明，AD和青光眼同為神經(jīng)退行性病變，二者可能存在某種特殊的聯(lián)系[27-31]，而Aβ被證實在其中具有至關重要的作用。目前關于Aβ對于眼部的神經(jīng)毒理作用尚不明確，且研究較Aβ對于腦部神經(jīng)毒理作用的研究更少，但無可否認，青光眼RGC凋亡有Aβ的參與，且動物實驗中針對Aβ不同途徑的阻斷藥物的確可減少青光眼大鼠RGC凋亡，針對Aβ途徑的藥物有可能成為未來青光眼治療新的研究方向之一。