Hp感染性胃癌患者外周血單核細(xì)胞TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的變化及其臨床意義

王 洋，鄒新梅，潘琴梅，鐘麗萍

王洋，鄒新梅，潘琴梅，湖州市第三人民醫(yī)院呼吸消化科 浙江省湖州市313000

鐘麗萍，湖州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 浙江省湖州市 313000

0 引言

胃癌是目前臨床當(dāng)中較常見、發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤疾病，在我國各類惡性腫瘤中發(fā)病率居首位[1].既往臨床試驗證實[2]，誘發(fā)胃癌起病的因素較多，其中幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染與其發(fā)生及進(jìn)展密切相關(guān).H.pylori可介導(dǎo)CagA基因及對上皮細(xì)胞保護(hù)層具穿透能力的HtrA的蛋白酶等毒性因子表達(dá)和參與激活胃黏膜組織免疫及炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步通過逃避腫瘤免疫以及促使生成新血管等途徑對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、浸潤、生長及血管生成等產(chǎn)生驅(qū)動作用.然而，整個過程當(dāng)中所涉及的相關(guān)免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子沒有完全明確，因此對于H.pylori感染性胃癌患者發(fā)病機制的深入研究對病情診斷、治療以及預(yù)防均具有重大意義[3].近些年研究發(fā)現(xiàn)[4，5]，TLR4作為固有免疫系統(tǒng)識別病原相關(guān)分子模式的主要受體之一，與H.pylori識別和癌前病變密切相關(guān)，且其信號通路上的其它重要分子NF-κB和MyD88也同樣被認(rèn)為參與了癌前病變的發(fā)生.然而，現(xiàn)階段臨床對TLR4/MyD88/NF-κB信號通路分子變化的研究多集中于免疫及炎癥機制中所發(fā)揮的作用[6，7]，而關(guān)TLR-4、NF-κB和MyD88分子的這種變化是否與胃癌患者H.pylori感染之間存在相關(guān)性尚不明確，為此，本研究通過探討TLR-4、NF-κB和MyD88分子在H.pylori感染性胃癌患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)，以期為臨床預(yù)防和針對性治療提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 選取2017-10/2020-10于我醫(yī)院收治的80例胃癌患者作為研究組，納入標(biāo)準(zhǔn):(1)均在術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為胃癌[8]; (2)半年內(nèi)未用免疫調(diào)節(jié)劑進(jìn)行治療者; (3)入組前4 wk未進(jìn)行抗H.pylori治療; (4)血液標(biāo)本取材前未行放療、化療及生物治療; (5)患者及家屬均自愿參加并簽署知情同意書.排除標(biāo)準(zhǔn):(1)入院前1 mo曾服用過對指標(biāo)檢測結(jié)果可能產(chǎn)生影響的藥物; (2)正在參與其他醫(yī)學(xué)研究者; (3)臨床資料不全，如病理分型不明、臨床數(shù)據(jù)缺失過多等; (4)合并其他惡性腫瘤性疾病; (5)合并相關(guān)病毒、細(xì)菌和真菌感染者.研究組患者中，男性45例，女性35例; 年齡在30-75歲，平均年齡為(49.95±7.87)歲.另外選擇同期來我院進(jìn)行體檢且體檢結(jié)果合格的50例健康者作為對照組，其中男性27例，女性23例; 年齡在31-74歲，平均年齡為(49.87±7.65)歲.上述對象均未發(fā)生病例脫落，兩組研究對象基線資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性.

1.2 方法

1.2.1 TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子檢測:患者于入院時、健康體檢者入組時次日6:00時空腹抽取外周靜脈血2 mL，外周血加入紅細(xì)胞裂解液200 μL，3000 r/min、4 ℃條件進(jìn)行離心，去除細(xì)胞核和少數(shù)未破碎的細(xì)胞產(chǎn)生的沉淀，隨后取上清高速離心獲得細(xì)胞膜沉淀和含有細(xì)胞漿蛋白的上清，然后通過優(yōu)化的膜蛋白抽提試劑(Abbkine Scientific Co.，Ltd.，貨號:KTP3005)從沉淀中抽提獲取膜蛋白.采用Partec流式細(xì)胞術(shù)測定患者外周血單核細(xì)胞中TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白的表達(dá)情況，檢測儀器為德國Partec公司生產(chǎn)的CyFlow?Cube8流式細(xì)胞儀.主要試劑為藻紅蛋白標(biāo)記的TLR-4單克隆抗體(上?？道噬锟萍加邢薰?，貨號:kl753Bo21)、別藻青蛋白標(biāo)記的NF-κB單克隆抗體(上海澤葉生物科技有限公司，貨號:ZYR824Ra01)、MyD88多克隆抗體(美國Cedarlane公司，貨號:CLAS05-056)及其相應(yīng)的同型對照抗體.所有操作均根據(jù)試劑說明書進(jìn)行.

1.2.2H.pylori抗體的定性檢測:采用C-14呼氣試驗和改良Giemsa染色判定所納入胃癌者H.pylori感染的情況，改良Giemsa染色:取適量石蠟切片，厚度4 μm，10%的福爾馬林進(jìn)行固定，常規(guī)脫水及石蠟包埋處理置入2%的Giemsa染色劑中進(jìn)行染色，在油鏡下(×1000)觀察，胃小凹及腺腔有“S”形分布的紅色顆粒則為H.pylori陽性.C-14呼氣試驗:餐后3 h以上或者空腹進(jìn)行檢查，患者服用檢測膠囊之后，收集100 mL呼出氣體，采用C-14紅外線能譜儀(德國費雪分析儀器公司產(chǎn)品)進(jìn)行判定，若其DOB值大于2.5則為H.pylori陽性.若C-14呼氣試驗和改良Giemsa染色兩種方法中任一實驗結(jié)果顯示為陽性的判定為H.pylori感染陽性，兩種方法均為陰性的則判定為陰性.

統(tǒng)計學(xué)處理利用SPSS 20.0軟件分析，計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗符合正態(tài)性分布，以mean±SD表示.進(jìn)行兩兩比較時采用Dunnet-t檢驗，組間各指標(biāo)比較采用單因素方差分析.計數(shù)資料采用率(%)表示，應(yīng)用χ2檢驗分析.胃癌患者H.pylori感染與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)之間的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析.

2 結(jié)果

2.1 兩組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子比較與對照組相比較，研究組TLR-4、NF-κB、MyD88表達(dá)均明顯偏高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).見表1.

2.2 不同病理特征胃癌患者TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子 胃癌患者不同臨床分期、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不同浸潤深度的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); 而不同性別、年齡的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05).見表2.

2.3 胃癌H.pylori感染患者TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子比較 與H.pylori感染陰性相比較，H.pylori感染陽性TLR-4、NF-κB、MyD88表達(dá)均明顯偏高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).見表3.

表1 兩組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子比較(mean±SD，%)

表2 兩組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子比較(mean±SD，%)

2.4 胃癌患者H.pylori感染與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)之間的相關(guān)性 Pearson檢驗發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染與TLR-4、NF-κB、MyD88表達(dá)之間有正相關(guān)(r=0.726、0.684、0.631，P＜0.01).

3 討論

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)認(rèn)為H.pylori是導(dǎo)致胃癌發(fā)生發(fā)展的I類致癌因素，H.pylori感染后可引起胃黏膜的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生增殖及凋亡異常，促進(jìn)腸化和萎縮，進(jìn)而加快“正常胃黏膜-慢性萎縮性胃炎-不典型增生-胃癌”這一癌病進(jìn)程[9].既往亦有大量臨床研究證實[10-12]，胃癌患者血清及組織中H.pylori感染率均高于正常人群，且其機體內(nèi)相關(guān)免疫、炎癥因子表達(dá)處于異常狀態(tài).因此，探究與H.pylori感染性胃癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的標(biāo)志物對于大規(guī)模篩查胃癌、早期診斷并及時治療均具有重要意義[13].

目前疾病監(jiān)測手段的不斷更新，更多的血清生物標(biāo)記物應(yīng)運而生，關(guān)于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路與結(jié)直腸癌[14]、乳腺癌[15]和肝癌[16]等多種惡性腫瘤的關(guān)系研究已有一些報道，大多專家學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)這些惡性腫瘤患者外周血單核細(xì)胞中的TLR-4、MyD88、NF-κB水平均顯著升高的現(xiàn)象，同時還發(fā)現(xiàn)這種升高與炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素和血管內(nèi)皮生長因子等呈現(xiàn)正相關(guān)，亦與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[17].有研究發(fā)現(xiàn)[18]，TLR4和MyD88在大腸癌組織中的含量相較于其癌旁組織中的含量明顯偏高，且與患者的臨床病理特征密切相關(guān).張子杰等[19]研究顯示，肝細(xì)胞癌組織中TLR4通路功能明顯增強，且其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移.此類臨床報告都直接指明TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[20].然而，現(xiàn)階段臨床關(guān)注的焦點最集中在發(fā)病率較高的結(jié)直腸癌、乳腺癌，對于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在H.pylori感染性胃癌中所扮演角色卻鮮有報道.本研究結(jié)果顯示，研究組TLR-4、NF-κB、MyD88表達(dá)明顯高于對照組，且H.pylori感染陽性者TLR-4、NF-κB、MyD88表達(dá)亦高于H.pylori感染陰性，同時胃癌患者不同臨床分期、是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不同浸潤深度的TLR-4、NF-κB、MyD88表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這就提示了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活不僅可能與胃癌H.pylori感染的發(fā)生有關(guān)，且與H.pylori感染性胃癌患者的臨床病理進(jìn)程密切相關(guān).另外，進(jìn)一步行一元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，H.pylori感染與TLR-4、NF-κB、MyD88表達(dá)之間有正相關(guān)(r=0.726、0.684、0.631，P＜0.01)，提示TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)水平能夠客觀反映胃癌患者的H.pylori感染情況，并且可考慮用于評價胃癌的嚴(yán)重程度.

表3 兩組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子比較(mean±SD，%)

4 結(jié)論

綜上所述，胃癌患者外周血單核細(xì)胞中的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)水平均顯著升高，且不同病理特征及參數(shù)分組下的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)水平存在顯著差異，推測H.pylori感染可能通過誘發(fā)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路異常表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展.然而，本研究也有一定的局限性，如:(1)未能完全控制藥物使用等混雜因素對結(jié)果的干擾; (2)納入病例來源單一，且缺少預(yù)后方面的分析;(3)醫(yī)院條件有限使得樣本量不夠充足; 這些都可能是結(jié)果的潛在影響因素，因此，我們下一步的工作方向是進(jìn)一步設(shè)置高質(zhì)量的前瞻性實驗，以期對本文實驗結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的論證與支持.但即便有這些不足之處，本文數(shù)據(jù)亦對臨床探討H.pylori感染性胃癌發(fā)病機制和指導(dǎo)臨床工作具有重要意義.

文章亮點

實驗背景

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染和胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān).H.pylori可能通過兩個方面引起細(xì)胞癌變:一方面H.pylori本身產(chǎn)生的細(xì)胞毒素具有致突、致癌作用，直接作用于感染部位后引起細(xì)胞惡變;另一方面幽門螺旋桿菌感染導(dǎo)致的一個活躍的炎癥微環(huán)境.TLR4/MyD88/NF-κB信號通路異常參與調(diào)控機體內(nèi)多種炎性反應(yīng)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、調(diào)亡等存在密切關(guān)系，提示TLR4/MyD88/NF-κB信號通路可能在胃癌發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用.

實驗動機

H.pylori感染可加重胃黏膜的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腸化和萎縮，進(jìn)而加快癌變，同樣，近年來的研究報告也發(fā)現(xiàn)，TLR4通過激活MyD88依賴性途徑促進(jìn)上皮修復(fù)，而TLR4介導(dǎo)的修復(fù)作用也可能導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，但TLR4/MyD88/NF-κB信號通路是否與胃癌患者H.pylori感染之間也存在相關(guān)性，臨床相關(guān)研究較少，值得進(jìn)一步研究.

實驗?zāi)繕?biāo)

探討TLR-4、NF-κB和MyD88分子在H.pylori感染性胃癌患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)，證實其是否可客觀反映胃癌患者的H.pylori感染情況，或者可考慮用于評價胃癌的嚴(yán)重程度.

實驗方法

選取符合入選標(biāo)準(zhǔn)的80例胃癌患者作為研究組，另外選擇同期來我院進(jìn)行體檢且體檢結(jié)果合格的50例健康者作為對照組.比較兩組受試者、不同病理特征胃癌患者以及胃癌H.pylori感染患者外周血單核細(xì)胞中TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白表達(dá)水平，并分析胃癌患者TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白水平與H.pylori感染的相關(guān)性.

實驗結(jié)果

胃癌患者外周血單核細(xì)胞中的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)水平均顯著升高，且不同病理特征及參數(shù)分組下的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關(guān)分子表達(dá)水平存在顯著差異.

實驗結(jié)論

H.pylori感染可能通過誘發(fā)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路異常表達(dá)參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展，監(jiān)測其水平變化對于大規(guī)模篩查胃癌、早期診斷并及時治療均具有重要意義.

展望前景

我們下一步的工作方向可能分為幾個方面:(1)在整個研究環(huán)節(jié)精細(xì)控制藥物使用等混雜因素對結(jié)果的干擾; (2)對所納入對象進(jìn)行有效隨訪，探究TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在胃癌H.pylori感染患者預(yù)后判斷中的應(yīng)用價值; (3)擴(kuò)大樣本容量并進(jìn)行多中心取樣，進(jìn)一步設(shè)置高質(zhì)量的前瞻性實驗，以期對本文實驗結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的論證與支持.