Hp感染性胃癌患者外周血單核細胞TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的變化及其臨床意義

王 洋，鄒新梅，潘琴梅，鐘麗萍

王洋，鄒新梅，潘琴梅，湖州市第三人民醫(yī)院呼吸消化科 浙江省湖州市313000

鐘麗萍，湖州市中心醫(yī)院腫瘤內科 浙江省湖州市 313000

0 引言

胃癌是目前臨床當中較常見、發(fā)病率較高的一種惡性腫瘤疾病，在我國各類惡性腫瘤中發(fā)病率居首位[1].既往臨床試驗證實[2]，誘發(fā)胃癌起病的因素較多，其中幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染與其發(fā)生及進展密切相關.H.pylori可介導CagA基因及對上皮細胞保護層具穿透能力的HtrA的蛋白酶等毒性因子表達和參與激活胃黏膜組織免疫及炎癥反應，進一步通過逃避腫瘤免疫以及促使生成新血管等途徑對腫瘤細胞的轉移、浸潤、生長及血管生成等產生驅動作用.然而，整個過程當中所涉及的相關免疫細胞及細胞因子沒有完全明確，因此對于H.pylori感染性胃癌患者發(fā)病機制的深入研究對病情診斷、治療以及預防均具有重大意義[3].近些年研究發(fā)現[4，5]，TLR4作為固有免疫系統(tǒng)識別病原相關分子模式的主要受體之一，與H.pylori識別和癌前病變密切相關，且其信號通路上的其它重要分子NF-κB和MyD88也同樣被認為參與了癌前病變的發(fā)生.然而，現階段臨床對TLR4/MyD88/NF-κB信號通路分子變化的研究多集中于免疫及炎癥機制中所發(fā)揮的作用[6，7]，而關TLR-4、NF-κB和MyD88分子的這種變化是否與胃癌患者H.pylori感染之間存在相關性尚不明確，為此，本研究通過探討TLR-4、NF-κB和MyD88分子在H.pylori感染性胃癌患者外周血單核細胞中的表達，以期為臨床預防和針對性治療提供理論依據.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2017-10/2020-10于我醫(yī)院收治的80例胃癌患者作為研究組，納入標準:(1)均在術后經病理檢查確診為胃癌[8]; (2)半年內未用免疫調節(jié)劑進行治療者; (3)入組前4 wk未進行抗H.pylori治療; (4)血液標本取材前未行放療、化療及生物治療; (5)患者及家屬均自愿參加并簽署知情同意書.排除標準:(1)入院前1 mo曾服用過對指標檢測結果可能產生影響的藥物; (2)正在參與其他醫(yī)學研究者; (3)臨床資料不全，如病理分型不明、臨床數據缺失過多等; (4)合并其他惡性腫瘤性疾病; (5)合并相關病毒、細菌和真菌感染者.研究組患者中，男性45例，女性35例; 年齡在30-75歲，平均年齡為(49.95±7.87)歲.另外選擇同期來我院進行體檢且體檢結果合格的50例健康者作為對照組，其中男性27例，女性23例; 年齡在31-74歲，平均年齡為(49.87±7.65)歲.上述對象均未發(fā)生病例脫落，兩組研究對象基線資料差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性.

1.2 方法

1.2.1 TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子檢測:患者于入院時、健康體檢者入組時次日6:00時空腹抽取外周靜脈血2 mL，外周血加入紅細胞裂解液200 μL，3000 r/min、4 ℃條件進行離心，去除細胞核和少數未破碎的細胞產生的沉淀，隨后取上清高速離心獲得細胞膜沉淀和含有細胞漿蛋白的上清，然后通過優(yōu)化的膜蛋白抽提試劑(Abbkine Scientific Co.，Ltd.，貨號:KTP3005)從沉淀中抽提獲取膜蛋白.采用Partec流式細胞術測定患者外周血單核細胞中TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白的表達情況，檢測儀器為德國Partec公司生產的CyFlow?Cube8流式細胞儀.主要試劑為藻紅蛋白標記的TLR-4單克隆抗體(上?？道噬锟萍加邢薰荆浱?kl753Bo21)、別藻青蛋白標記的NF-κB單克隆抗體(上海澤葉生物科技有限公司，貨號:ZYR824Ra01)、MyD88多克隆抗體(美國Cedarlane公司，貨號:CLAS05-056)及其相應的同型對照抗體.所有操作均根據試劑說明書進行.

1.2.2H.pylori抗體的定性檢測:采用C-14呼氣試驗和改良Giemsa染色判定所納入胃癌者H.pylori感染的情況，改良Giemsa染色:取適量石蠟切片，厚度4 μm，10%的福爾馬林進行固定，常規(guī)脫水及石蠟包埋處理置入2%的Giemsa染色劑中進行染色，在油鏡下(×1000)觀察，胃小凹及腺腔有“S”形分布的紅色顆粒則為H.pylori陽性.C-14呼氣試驗:餐后3 h以上或者空腹進行檢查，患者服用檢測膠囊之后，收集100 mL呼出氣體，采用C-14紅外線能譜儀(德國費雪分析儀器公司產品)進行判定，若其DOB值大于2.5則為H.pylori陽性.若C-14呼氣試驗和改良Giemsa染色兩種方法中任一實驗結果顯示為陽性的判定為H.pylori感染陽性，兩種方法均為陰性的則判定為陰性.

統(tǒng)計學處理利用SPSS 20.0軟件分析，計量資料經正態(tài)性檢驗符合正態(tài)性分布，以mean±SD表示.進行兩兩比較時采用Dunnet-t檢驗，組間各指標比較采用單因素方差分析.計數資料采用率(%)表示，應用χ2檢驗分析.胃癌患者H.pylori感染與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達之間的相關性采用Pearson相關性分析.

2 結果

2.1 兩組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子比較與對照組相比較，研究組TLR-4、NF-κB、MyD88表達均明顯偏高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).見表1.

2.2 不同病理特征胃癌患者TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子 胃癌患者不同臨床分期、是否出現淋巴結轉移和不同浸潤深度的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); 而不同性別、年齡的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05).見表2.

2.3 胃癌H.pylori感染患者TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子比較 與H.pylori感染陰性相比較，H.pylori感染陽性TLR-4、NF-κB、MyD88表達均明顯偏高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05).見表3.

表1 兩組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子比較(mean±SD，%)

表2 兩組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子比較(mean±SD，%)

2.4 胃癌患者H.pylori感染與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達之間的相關性 Pearson檢驗發(fā)現，H.pylori感染與TLR-4、NF-κB、MyD88表達之間有正相關(r=0.726、0.684、0.631，P＜0.01).

3 討論

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構認為H.pylori是導致胃癌發(fā)生發(fā)展的I類致癌因素，H.pylori感染后可引起胃黏膜的炎癥反應，導致細胞發(fā)生增殖及凋亡異常，促進腸化和萎縮，進而加快“正常胃黏膜-慢性萎縮性胃炎-不典型增生-胃癌”這一癌病進程[9].既往亦有大量臨床研究證實[10-12]，胃癌患者血清及組織中H.pylori感染率均高于正常人群，且其機體內相關免疫、炎癥因子表達處于異常狀態(tài).因此，探究與H.pylori感染性胃癌發(fā)生、發(fā)展有關的標志物對于大規(guī)模篩查胃癌、早期診斷并及時治療均具有重要意義[13].

目前疾病監(jiān)測手段的不斷更新，更多的血清生物標記物應運而生，關于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路與結直腸癌[14]、乳腺癌[15]和肝癌[16]等多種惡性腫瘤的關系研究已有一些報道，大多專家學者研究發(fā)現這些惡性腫瘤患者外周血單核細胞中的TLR-4、MyD88、NF-κB水平均顯著升高的現象，同時還發(fā)現這種升高與炎性介質白細胞介素和血管內皮生長因子等呈現正相關，亦與疾病的嚴重程度密切相關[17].有研究發(fā)現[18]，TLR4和MyD88在大腸癌組織中的含量相較于其癌旁組織中的含量明顯偏高，且與患者的臨床病理特征密切相關.張子杰等[19]研究顯示，肝細胞癌組織中TLR4通路功能明顯增強，且其高表達可促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移.此類臨床報告都直接指明TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[20].然而，現階段臨床關注的焦點最集中在發(fā)病率較高的結直腸癌、乳腺癌，對于TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在H.pylori感染性胃癌中所扮演角色卻鮮有報道.本研究結果顯示，研究組TLR-4、NF-κB、MyD88表達明顯高于對照組，且H.pylori感染陽性者TLR-4、NF-κB、MyD88表達亦高于H.pylori感染陰性，同時胃癌患者不同臨床分期、是否出現淋巴結轉移和不同浸潤深度的TLR-4、NF-κB、MyD88表達比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，這就提示了TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活不僅可能與胃癌H.pylori感染的發(fā)生有關，且與H.pylori感染性胃癌患者的臨床病理進程密切相關.另外，進一步行一元線性回歸分析發(fā)現，H.pylori感染與TLR-4、NF-κB、MyD88表達之間有正相關(r=0.726、0.684、0.631，P＜0.01)，提示TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達水平能夠客觀反映胃癌患者的H.pylori感染情況，并且可考慮用于評價胃癌的嚴重程度.

表3 兩組TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子比較(mean±SD，%)

4 結論

綜上所述，胃癌患者外周血單核細胞中的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達水平均顯著升高，且不同病理特征及參數分組下的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達水平存在顯著差異，推測H.pylori感染可能通過誘發(fā)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路異常表達參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展.然而，本研究也有一定的局限性，如:(1)未能完全控制藥物使用等混雜因素對結果的干擾; (2)納入病例來源單一，且缺少預后方面的分析;(3)醫(yī)院條件有限使得樣本量不夠充足; 這些都可能是結果的潛在影響因素，因此，我們下一步的工作方向是進一步設置高質量的前瞻性實驗，以期對本文實驗結果進行進一步的論證與支持.但即便有這些不足之處，本文數據亦對臨床探討H.pylori感染性胃癌發(fā)病機制和指導臨床工作具有重要意義.

文章亮點

實驗背景

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染和胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關.H.pylori可能通過兩個方面引起細胞癌變:一方面H.pylori本身產生的細胞毒素具有致突、致癌作用，直接作用于感染部位后引起細胞惡變;另一方面幽門螺旋桿菌感染導致的一個活躍的炎癥微環(huán)境.TLR4/MyD88/NF-κB信號通路異常參與調控機體內多種炎性反應，與腫瘤細胞的增殖、調亡等存在密切關系，提示TLR4/MyD88/NF-κB信號通路可能在胃癌發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用.

實驗動機

H.pylori感染可加重胃黏膜的炎癥反應，促進腸化和萎縮，進而加快癌變，同樣，近年來的研究報告也發(fā)現，TLR4通過激活MyD88依賴性途徑促進上皮修復，而TLR4介導的修復作用也可能導致腫瘤進展，但TLR4/MyD88/NF-κB信號通路是否與胃癌患者H.pylori感染之間也存在相關性，臨床相關研究較少，值得進一步研究.

實驗目標

探討TLR-4、NF-κB和MyD88分子在H.pylori感染性胃癌患者外周血單核細胞中的表達，證實其是否可客觀反映胃癌患者的H.pylori感染情況，或者可考慮用于評價胃癌的嚴重程度.

實驗方法

選取符合入選標準的80例胃癌患者作為研究組，另外選擇同期來我院進行體檢且體檢結果合格的50例健康者作為對照組.比較兩組受試者、不同病理特征胃癌患者以及胃癌H.pylori感染患者外周血單核細胞中TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白表達水平，并分析胃癌患者TLR-4、NF-κB和MyD88蛋白水平與H.pylori感染的相關性.

實驗結果

胃癌患者外周血單核細胞中的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達水平均顯著升高，且不同病理特征及參數分組下的TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關分子表達水平存在顯著差異.

實驗結論

H.pylori感染可能通過誘發(fā)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路異常表達參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展，監(jiān)測其水平變化對于大規(guī)模篩查胃癌、早期診斷并及時治療均具有重要意義.

展望前景

我們下一步的工作方向可能分為幾個方面:(1)在整個研究環(huán)節(jié)精細控制藥物使用等混雜因素對結果的干擾; (2)對所納入對象進行有效隨訪，探究TLR4/MyD88/NF-κB信號通路在胃癌H.pylori感染患者預后判斷中的應用價值; (3)擴大樣本容量并進行多中心取樣，進一步設置高質量的前瞻性實驗，以期對本文實驗結果進行進一步的論證與支持.