miR-381 在胰腺癌患者組織及外周血的表達(dá)及臨床價(jià)值

張文娟，邊 偉，王炳超，董 魁，楊雅娟，喬冠恩

（1.邯鄲市第一醫(yī)院消化科，河北 邯鄲 056002；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普外一科，河北 石家莊 050000；3.邯鄲市第一醫(yī)院普外二科，河北 邯鄲 056002）

胰腺癌（pancreatic cancer）在世界范圍分布廣泛，是歐洲癌癥死亡的主要原因之一[1]，為我國(guó)常見的惡性腫瘤及主要的腫瘤死亡原因[2]。目前針對(duì)胰腺癌治療手段包括手術(shù)、化療、放療、靶向及免疫治療等，但總體治療效果較差，患者5 年生存率小于7%[3]。因此，積極尋找新的腫瘤標(biāo)記物有助于早期診斷及治療，但到目前為止，胰腺癌確切的病因及分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚未完全闡明。微小RNA (miRNAs)是非編碼小RNA，參與了人類大多數(shù)癌癥的分子調(diào)節(jié)過(guò)程[4，5]。目前所知，很多miRNAs 與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展有明顯聯(lián)系[6，7]，但有關(guān)miR-381 在胰腺癌中的具體功能研究，目前報(bào)道尚少。本研究采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR（RT-qPCR）方法檢測(cè)胰腺癌患者組織、血清和健康者血清中的miR-381 水平，并結(jié)合臨床病理資料，探討其臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年7 月～2018 年8 月邯鄲市第一醫(yī)院及河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院確診的50 例胰腺癌患者的癌組織及外周血清，其中男27 例，女23 例，年齡45～78 歲，平均年齡59.4 歲。所有診斷均經(jīng)過(guò)手術(shù)及病理證實(shí)，胰腺癌的TNM 分期采用第7 版美國(guó)聯(lián)合腫瘤委員會(huì)的病理分期標(biāo)準(zhǔn)[8]，抽取外周血前未行放療、化療、生物治療等干預(yù)措施，無(wú)其它腫瘤病史。另外選取患者的癌旁正常組織及同期50 例健康體檢者（男26 例，女24 例，年齡44～76歲，平均58.2 歲）血清樣本作為對(duì)照組，健康體檢者與胰腺癌患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol 試劑購(gòu)于北京天根生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司，PCR試劑盒購(gòu)于徳國(guó)Roche 公司，通過(guò)Primer PremierV6.1 軟件設(shè)計(jì)引物序列，引物由南京金斯瑞公司合成。紫外分光光度儀為美國(guó)Beckman Coulter 公司生產(chǎn)，熒光定量PCR 儀7500HT 為美國(guó)ABI 公司產(chǎn)品，電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本釆集與處理 血清標(biāo)本采集：抽取胰腺癌患者和健康體檢者空腹靜脈血3 ml，靜置30 min 后4 ℃，3500 r/min，離心10 min，取上淸液放入新的EP 管中，置-80 ℃冰箱保存。組織標(biāo)本采集：于術(shù)后取胰腺癌患者癌組織及癌旁正常組織各約1 g，放入含有RNA 保護(hù)液的EP 管中，置-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 總RNA 的提取 血清RNA 的提?。喝⊙?00 μl，加入400 μl Trizol 裂解液中，混勻后加80 μl氯仿，充分震蕩后放置3 min，4 ℃，12,000 r/min 離心15 min，收集上層水溶液，加680 μl 異丙醇并充分混勻，在室溫環(huán)境下放置30 min，4 ℃、12,000 r/min 離心15 min，收集沉淀，向帶沉淀的EP 管中加入500 μl，75% 4 ℃預(yù)冷的乙醇洗滌，4 ℃、5000 r/min 離心5 min，去除上清液，保留沉淀，室溫放置3 min 晾干，最后加30 μl RNase-Free ddH2O，充分溶解RNA。總RNA 經(jīng)NanoDrop ND-2000 分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，并電泳檢測(cè)RNA 完整性，質(zhì)量合格后用DEPC 水溶解保存在-80 ℃，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。組織RNA 的提取：將保存在-80 ℃冰箱中的組織樣本取出稱重，放入有液氮的研缽中進(jìn)行研磨，按100 mg組織樣本加1 ml Trizol 的比例添加Trizol 試劑，勻漿處理放置5 min，入新的EP 管中12,000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液600 μl 移入新的EP 管中，后續(xù)加氯仿、異丙醇及檢測(cè)等步驟同血清RNA 的提取。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取2 μl RNA 加入到新的EP 管中，用DEPC 水加至11 μl，65 ℃恒溫放置5 min，冰浴5 min瞬時(shí)離心。將收集到的液體加入5×Reaction buffer 4.0 μl、dNTPs 2.0 μl、Rnase Inhibitor 1.0 μl、RT 酶1.0 μl，離心后42 ℃孵育1 h，70 ℃反10 min 后取出立即冰浴冷卻，合成cDNA，于-20 ℃保存。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng) 按照Roche 公司的Fast Start Universal SYBR Green Master（Rox）熒光定量PCR 試劑盒來(lái)擴(kuò)增目的基因，所有反應(yīng)設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，采用20 μl 的反應(yīng)體系，依次添加2×SYBR Green Mix 10 μl、cDNA 2.0 μl、正向引物及反向引物各1.0 μl、雙蒸水6.0 μl。miR-381 正向引物序列為5'-TAATCTGACTATACAAGGGCAAGC-3'，反向引物序列為5'-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3'；U6 正向引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物序列為 5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。通過(guò)1 個(gè)循環(huán)（95 ℃，3 min）的預(yù)變性，40 個(gè)循環(huán)的變性（94 ℃，12 s）、退火及延伸（62 ℃，25 s），最后進(jìn)行熔解曲線分析（62 ℃～95 ℃，0.5 ℃/cycles，5 s/次）。根據(jù)各個(gè)孔熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)作為Ct 值，以U6 為內(nèi)參，用2-△△Ct體現(xiàn)樣本的相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=基本循環(huán)數(shù)-內(nèi)參循環(huán)數(shù)，ΔΔCt=待測(cè)樣本ΔCt-對(duì)照樣本ΔCt。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（）表示，比較采用t檢驗(yàn)，miR-381 表達(dá)量與患者臨床病理特征相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析，ROC 曲線分析miR-381 對(duì)胰腺癌的診斷價(jià)值，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織、血清和健康者血清miR-381 表達(dá)情況 胰腺癌組織及血清miR-381 表達(dá)量分別為（0.72±0.26）、（0.79±0.34），均低于對(duì)照組癌旁正常組織及健康者血清中miR-381 的表達(dá)量（1.56±0.23）、（1.74±0.45），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 胰腺癌患者miR-381 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 不同腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者miR-381 的表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；不同性別、年齡的胰腺癌患者miR-381 的表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 胰腺癌患者miR-381 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

表1 胰腺癌患者miR-381 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（）

表1 （續(xù)）

2.3 組織、血清中miR-381 診斷胰腺癌的價(jià)值 組織miR-381 診斷胰腺癌的敏感性、特異性為84.51%及80.34%，胰腺癌血清miR-381 診斷胰腺癌的敏感性、特異性為82.31%及81.26%，見表2、圖1。

表2 組織、血清miR-381 診斷胰腺癌的價(jià)值

圖1 組織、血清中miR-381 診斷胰腺癌的價(jià)值

3 討論

miRNAs 是由20 個(gè)左右核苷酸構(gòu)成的短鏈非編碼RNA，一般在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關(guān)基因表達(dá)，可在腫瘤中發(fā)揮抑癌或促癌基因的功能[9]。在人類中約50%的miRNAs 所在的基因組區(qū)域與癌癥存在密切的聯(lián)系，癌組織中異常表達(dá)的miRNAs 對(duì)腫瘤的早期診斷、組織分型、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等有著極其重要的價(jià)值[10]。作為潛在的腫瘤分子標(biāo)志物，miRNAs 可在血液、尿液等中釋放和維持穩(wěn)定[11，12]，因此，對(duì)腫瘤體液循環(huán)中miRNAs 的研究是當(dāng)前的熱點(diǎn)[13，14]。

miR-381 位于人類染色體14q32.31 位點(diǎn)，屬于miR-154 基因家族[15]，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、增殖等重要的功能。Zhang M 等[16]研究顯示，胃癌組織中miR-381 的表達(dá)明顯下調(diào)，miR-381 的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，miR-381 的上調(diào)通過(guò)SOX4 介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Yang X 等[17]的研究顯示，miR-381 在口腔鱗癌組織和細(xì)胞系中均顯著低表達(dá)，miR-381 的過(guò)度表達(dá)可抑制口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Xue Y 等[18]驗(yàn)證了miR-381 在乳腺癌組織及細(xì)胞系中均呈低表達(dá)，同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)miR-381的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)[19]。關(guān)于miR-381 在胰腺癌的表達(dá)情況，目前有少量報(bào)道。蔣林濤等[20]檢測(cè)了人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系及胰腺癌細(xì)胞系中miR-381 的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-381 在胰腺癌細(xì)胞系中呈低表達(dá)，miR-381 過(guò)表達(dá)可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Qiao G 等[21]研究了miR-381 在胰腺癌中的表達(dá)及其功能作用，發(fā)現(xiàn)miR-381 在胰腺癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR-381 的過(guò)表達(dá)可顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡，沉默miR-381 的表達(dá)具有相反的效果。動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)顯示，miR-381 可抑制異種移植腫瘤生長(zhǎng)，miR-381 在胰腺癌中具有抑癌作用。但對(duì)miR-381在血液中表達(dá)的情況目前尚未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁正常組織、健康者血清相比，胰腺癌組織、血清的miR-381 表達(dá)均降低，提示miR-381 的低表達(dá)可能與胰腺癌的發(fā)病有關(guān)。

外周血miRNAs 作為腫瘤標(biāo)志物的研究已取得了一定的成效[22，23]。本研究中，miR-381 在胰腺癌組織及血清中均呈低表達(dá)，且miR-381 的表達(dá)與腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示miR-381 的低表達(dá)可能促進(jìn)胰腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此miR-381 在胰腺癌的發(fā)展過(guò)程中可能起抑癌基因的作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，不論在組織還是外周血中，miR-381的表達(dá)均與患者年齡、性別無(wú)關(guān)，提示miR-381 的表達(dá)不受個(gè)體因素影響，其有可能成為臨床診治胰腺癌的潛在標(biāo)志物。對(duì)組織、血清miR-381 診斷胰腺癌的ROC 曲線分析顯示，組織和血清中miR-381對(duì)胰腺癌的診斷敏感性、特異性均在80%以上，提示組織、血清中的miR-381 對(duì)胰腺癌的診斷有較高價(jià)值，特別是血清樣本中的miR-381，由于取樣便捷，更有可能成為潛在的腫瘤標(biāo)志物。

綜上所述，胰腺癌組織、血清中的miR-381 呈低表達(dá)，其表達(dá)量反映了胰腺癌的進(jìn)展情況，可作為為胰腺癌潛在的腫瘤分子標(biāo)志物及預(yù)后判斷指標(biāo)，對(duì)胰腺癌的臨床診治具有一定的價(jià)值。