β-內(nèi)酰胺酶血培養(yǎng)瓶對含抗菌素模擬兒童菌血癥標(biāo)本的檢測效能

陳 楠，沈永明，張 瑩，李國旭，閆曉丹，劉 洋

（1.天津醫(yī)科大學(xué)兒童臨床學(xué)院/天津市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300134；2.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；3.天津醫(yī)科大學(xué)兒童臨床學(xué)院/天津市兒童醫(yī)院新生兒內(nèi)科，天津 300134）

膿毒癥（sepsis）是導(dǎo)致全球范圍內(nèi)成人和兒童死亡的主要原因之一[1]，其發(fā)病率和病死率在新生兒和兒童中最高，并且在過去幾十年沒有顯著下降[2，3]。調(diào)查顯示[4]，兒童膿毒癥在兒科重癥病房的發(fā)病率為8.2%，住院病死率達(dá)25%，細(xì)菌約占病原的55%。關(guān)于膿毒癥處理的指南，幾乎都強(qiáng)調(diào)了在使用抗菌素之前采集血液進(jìn)行血液培養(yǎng)的重要性[5]，但超過40%的住院患者采血培養(yǎng)前應(yīng)用了抗菌素[6]，約20%患者在入院時(shí)已經(jīng)使用口服抗菌素[7]，兒科診療水平的差異及抗菌素的不合理應(yīng)用，使得上述現(xiàn)象在兒科尤為突出。目前，常采用含有樹脂或活性炭的培養(yǎng)瓶清除血標(biāo)本中的抗菌素殘留提高血培養(yǎng)的檢出陽性率，縮短陽性報(bào)菌時(shí)間（TTP），但是也存在如干擾檢驗(yàn)結(jié)果、增加基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)運(yùn)行負(fù)擔(dān)等不足。由于兒童抗菌素選擇以β-內(nèi)酰胺類抗菌素為主，本研究通過對比三種不同血培養(yǎng)瓶對含抗菌素模擬菌血癥標(biāo)本的檢測能力，驗(yàn)證添加β-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)瓶用于兒童菌血癥檢測的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 參考既往研究[8-10]，選用有代表性的臨床常見病原菌種，獲得標(biāo)準(zhǔn)菌株。革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌ATCC 29213（天津市臨床檢驗(yàn)中心）；革蘭氏陰性菌：大腸埃希菌ATCC 25922（天津市臨床檢驗(yàn)中心）。全血為健康人群的志愿獻(xiàn)血，獻(xiàn)血前2 周未應(yīng)用抗菌素。

1.2 儀器與試劑 美國BD 公司BACTECTM 9240 全自動(dòng)血液培養(yǎng)系統(tǒng)及其配套需氧微生物培養(yǎng)瓶[BD BACTECTM Peds PlusTM/F Culture Vials（BD-F瓶）]，標(biāo)準(zhǔn)需氧微生物培養(yǎng)瓶[BD BACTECTMTM FX（BD-S 瓶）]；法國梅里埃公司BACT/ALERT 3D全自動(dòng)細(xì)菌及分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測系統(tǒng)，及其配套需氧和兼性厭氧微生物培養(yǎng)瓶[BACT/ALERT?PF（BTC 瓶）]，標(biāo)準(zhǔn)需氧微生物培養(yǎng)瓶[BacT/ALERT SA（BT-S 瓶）]。本研究使用的每種培養(yǎng)瓶均為同一批次、且在有效期內(nèi)。參考既往報(bào)道選擇臨床常用抗菌素[11，12]：注射用青霉素鈉（哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號(hào)：18020608-1，80 萬U/支）；注射用頭孢呋辛鈉（75萬U/6ml/支，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，批號(hào)：J180201）。β-內(nèi)酰胺酶：青霉素酶（600 萬U/2 ml/支，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)130441-201907）；頭孢菌素酶（200 萬U/支，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：J02M9F54980）。

1.3 方法 試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)建立[6，13-15]，培養(yǎng)瓶分為BD-S 瓶、BD-F 瓶、BD-SE 瓶和BT-S 瓶、BT-C 瓶、BT-SE 瓶兩類，按照所選菌株和抗菌素，兩類培養(yǎng)瓶分別分成金黃色葡萄球菌-青霉素鈉和大腸埃希菌-頭孢呋辛鈉，其中BD-SE 瓶和BT-SE 瓶為對照標(biāo)本分別加入10 μl 上述濃度的青霉素酶或頭孢菌素酶，以達(dá)到試劑說明要求。每組重復(fù)10 份。實(shí)驗(yàn)前，將菌株用血瓊脂平板37 ℃隔夜傳代2 次，用肉湯稀釋法測定其最小抑菌濃度（MIC）。將傳代后的實(shí)驗(yàn)菌株（金黃色葡萄球菌及大腸埃希菌）配制成1.5×104CFU/ml 濃度備用，并用同一菌株的同一稀釋菌液完成全部實(shí)驗(yàn)。按照藥劑說明書，分別制備抗菌素制劑，青霉素鈉1000 mg/L、頭孢呋辛鈉2500 mg/L備用；β-內(nèi)酰胺酶制劑，青霉素酶7500 mg/L、頭孢菌素酶5000 mg/L 備用。在培養(yǎng)瓶中加入1 ml 無菌新鮮血液，再加入10 μl 上述濃度菌懸液，使血中菌濃度達(dá)到1.5×102CFU/ml；在含抗菌素組的培養(yǎng)瓶中分別加入10 μl 和20 μl 上述濃度抗菌素，使抗菌素濃度分別達(dá)到藥品說明書中的血藥中點(diǎn)（C1/2）和血藥峰濃度（Cmax）。將模擬標(biāo)本培養(yǎng)瓶制備完成后，同時(shí)放入各自血液培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)，檢測時(shí)間為120 h。培養(yǎng)瓶記錄陽性報(bào)警時(shí)間，并涂片進(jìn)行革蘭氏染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本次研究所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 23.0 軟件完成。計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用（）表示，組內(nèi)比較行配對t檢驗(yàn)，采用析因設(shè)計(jì)的方差分析評(píng)價(jià)因素的主效應(yīng)及交互作用，進(jìn)一步的多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌-青霉素鈉組與大腸埃希菌-頭孢呋辛鈉組陽性檢出率比較 不同抗菌素血藥濃度的陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；隨著抗菌素血藥濃度的增加，不同培養(yǎng)瓶中陽性檢出率逐漸降低；按照抗菌素血藥濃度進(jìn)行分層，不同培養(yǎng)瓶的陽性檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。所有培養(yǎng)瓶對于不含抗菌素標(biāo)本的檢出陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩種抗菌素在血藥峰濃度時(shí)，BD-F 瓶、BD-SE 瓶的檢出陽性率均高于BD-S 瓶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而BDF 瓶與BD-SE 瓶比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在血藥中點(diǎn)濃度時(shí)，BD-F 瓶、BD-SE 瓶與BD-S 瓶檢出陽性率比較，BD-F 瓶與BD-SE 瓶檢出陽性率比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。頭孢呋辛鈉在血藥峰濃度時(shí)，BT-C 瓶、BT-SE 瓶的檢出陽性率優(yōu)于BT-S 瓶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而BT-C 瓶與BT-SE 瓶比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；青霉素鈉在血藥峰濃度時(shí)，BT-C 瓶、BTSE 瓶的檢出陽性率與BT-S 瓶比較，BT-C 瓶與BT-SE 瓶比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩種抗菌素為血藥中點(diǎn)濃度時(shí)，BD-F 瓶、BD-SE 瓶的檢出陽性率與BD-S 瓶比較，BD-F 瓶與BD-SE 瓶比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1、表2。

2.2 金黃色葡萄球菌-青霉素鈉組與大腸埃希菌-頭孢呋辛鈉組陽性檢出時(shí)間比較 析因設(shè)計(jì)的方差分析顯示，兩組不同培養(yǎng)瓶、不同抗菌素血藥濃度的TTP 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對不含有抗菌素的標(biāo)本，不同培養(yǎng)瓶的TTP 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩種抗菌素在血藥峰濃度和中點(diǎn)濃度時(shí)，BD-F 瓶、BD-SE 瓶的TTP 均優(yōu)于BD-S瓶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)青霉素鈉在血藥峰濃度時(shí)，BD-SE 瓶的TTP 優(yōu)于BD-F 瓶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)青霉素鈉在血藥中點(diǎn)濃度時(shí)，BD-SE 瓶與BD-F 瓶的TT 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；當(dāng)頭孢呋辛鈉在血藥峰濃度和中點(diǎn)濃度時(shí)，BD-F 瓶與BD-SE 瓶的TTP 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩種抗菌素在血藥峰濃度和中點(diǎn)濃度時(shí)，BT-C 瓶、BT-SE 瓶的TTP 均優(yōu)于BTS 瓶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)青霉素鈉在血藥峰濃度和中點(diǎn)濃度時(shí)，BT-C 瓶的TTP 均優(yōu)于BT-SE 瓶，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；當(dāng)頭孢呋辛鈉在血藥峰濃度和中點(diǎn)濃度時(shí)，BT-C 瓶與BT-SE瓶的TTP 比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3和表4。

表1 不同細(xì)菌在BD-S、BD-F 與BD-SE 的陽性檢出結(jié)果

表2 不同細(xì)菌在BT-S、BT-C 與BT-SE 的陽性檢出結(jié)果

表3 不同細(xì)菌在BD-S、BD-F 與BD-SE 的陽性檢出時(shí)間

表4 不同細(xì)菌在BT-S、BT-C 與BT-SE 的陽性檢出時(shí)間

3 討論

2017 年，世衛(wèi)組織已將膿毒癥列為未來十年衛(wèi)生保健的重點(diǎn)之一[1]。我國5 歲以下兒童的主要死因中，膿毒癥的死亡率不降反升，有效降低膿毒癥的病死率也成為我國政府高度重視的工作。血液培養(yǎng)對感染性疾病的診斷、治療和預(yù)后有重要的臨床意義。但是，我國兒科診療水平差異較大，兒童膿毒癥病原檢出率約為23.5%～82.8%[9]，且存在不同程度的不合理應(yīng)用抗菌素，在獲得血培養(yǎng)標(biāo)本之前應(yīng)用抗菌素，會(huì)降低標(biāo)本中細(xì)菌的載量，抑制細(xì)菌的生長，最終影響血培養(yǎng)陽性檢出率和TTP。

既往研究[13]已經(jīng)證實(shí)了在培養(yǎng)瓶中添加樹脂、活性炭或聚美珠等抗菌素結(jié)合劑或吸附劑，可以有效中和血培養(yǎng)標(biāo)本的抗菌素殘留，提高培養(yǎng)陽性率，縮短TTP。然而，該方法也存在一些局限性，如活性炭的存在可能是應(yīng)用革蘭氏染色、直接質(zhì)譜分析、分子方法和直接抗菌素敏感測試的主要限制因素。中低收入國家廣泛應(yīng)用該技術(shù)尚存在一定困難[5]。研究顯示[14]，美羅培南及少數(shù)頭孢菌素的峰值血藥濃度可能會(huì)超過樹脂培養(yǎng)瓶的中和能力。而由于特殊的生理特點(diǎn)和多數(shù)抗菌素的毒副作用，兒童的抗菌治療以頭孢菌素類和青霉素類為首選[11]?；诖?，本研究通過添加可以分解頭孢菌素類和青霉素類抗菌素的β-內(nèi)酰胺酶制劑的方式，實(shí)現(xiàn)提高血培養(yǎng)陽性檢出率，縮短TTP 的目的，為兒童膿毒癥患者的診治提供幫助。

目前，體外模擬實(shí)驗(yàn)評(píng)估不同培養(yǎng)瓶清除標(biāo)本中抗菌素能力的方法已經(jīng)被廣泛開展[6，13，14]。本研究分別選用具有代表性的金黃色葡萄球菌-青霉素鈉、大腸埃希菌-頭孢呋辛鈉的組合，完成體外模擬實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，抗菌素的殘留的確降低了血培養(yǎng)的陽性率，延長了TTP，并且隨著抗菌素濃度的增加，影響更加明顯。對于青霉素鈉、頭孢呋辛鈉兩種β-內(nèi)酰胺類抗菌素，添加了樹脂、活性炭及β-內(nèi)酰胺酶的三種培養(yǎng)瓶，均可通過清除血標(biāo)本中的殘留抗菌素，達(dá)到提高陽性檢出率和縮短TTP 的效果。在陽性檢出率和TTP 方面，添加了β-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)瓶幾乎達(dá)到了與添加了樹脂或活性炭的培養(yǎng)瓶相接近的效能。因此，通過添加β-內(nèi)酰胺酶清除血培養(yǎng)標(biāo)本內(nèi)殘留的β-內(nèi)酰胺類抗菌素具有一定可行性，同時(shí)也可以嘗試作為樹脂培養(yǎng)基的有益補(bǔ)充，為兒童膿毒癥患者以及中低收入國家的醫(yī)務(wù)人員解決血培養(yǎng)標(biāo)本中抗菌素殘留問題提供了新的選擇。另外，操作中需嚴(yán)格遵循無菌操作，以避免在培養(yǎng)瓶中添加β-內(nèi)酰胺酶而導(dǎo)致的標(biāo)本污染。

綜上所述，添加了β-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)瓶對于含抗菌素模擬兒童菌血癥標(biāo)本檢驗(yàn)效能優(yōu)于普通培養(yǎng)瓶，并且與含有樹脂、活性炭的培養(yǎng)瓶檢驗(yàn)效能接近。