原卟啉Ⅸ在HBV 相關(guān)肝硬化中的臨床意義

成若晨，張 瓔，何騰飛，郭 蕊

（西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021）

我國的肝硬化（liver cirrhosis）主要病因為乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起，感染率為77%[1]。其病理過程為慢性炎癥、脂肪樣變性、肝細(xì)胞減少、彌漫性纖維化及肝內(nèi)外血管增殖，逐漸發(fā)展為肝硬化。阻斷肝硬化關(guān)鍵在于早期的預(yù)警、干預(yù)及評估，目前血清肝纖維化及肝硬化的影像檢測主要集中在肝纖維化及肝硬化階段，雖然肝臟病理活檢可以反映慢性炎癥、脂肪樣變性的早期階段，但因其為有創(chuàng)操作，在臨床應(yīng)用受到一定的限制。慢性肝病存在卟啉代謝異常[2]，主要機(jī)制為HBV 感染損傷肝細(xì)胞線粒體并出現(xiàn)卟啉代謝異常。卟啉與HBV相關(guān)慢性肝病進(jìn)展的關(guān)系及其能否用于肝損害的早期預(yù)警及病情評估，目前的研究報道較少。為此，本文擬研究原卟啉Ⅸ（Protoporphyrin Ⅸ，PPⅨ）在HBV 相關(guān)肝硬化中的表達(dá)情況及其臨床意義。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年10 月～2019 年10 月就診于西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的51 例HBV 相關(guān)肝硬化患者作為肝硬化組，所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019 年版）》[1]有關(guān)肝硬化的診斷標(biāo)準(zhǔn)。另外選取同期健康者40 例作為對照組。肝硬化組中男性34 例，女性17 例，年齡30～83 歲，平均年齡（50.74±13.08）歲；對照組男性24 例，女性16例，年齡23～86 歲，平均年齡（48.65±15.98）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本實驗得到我院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有研究對象均同意參與本研究并簽署知情同意書。

1.2 方法 采用高效液相色譜法（HPLC）檢測血樣原卟啉Ⅸ濃度。首先用N，N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液配制不同濃度原卟啉Ⅸ標(biāo)準(zhǔn)品100、70、30、10、7、3、1 ng/dl，繪制橫坐標(biāo)原卟啉濃度（ng/dl）與縱坐標(biāo)峰面積（U×S）的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.2464X+0.3086，R2=0.9998，見圖1。樣本處理：解凍取血清樣品300 μl加700 μl 甲醇定容至1 ml，震蕩、冷凍高速離心離心，取上清液，高效液相色譜儀測定，每份樣品進(jìn)樣3 次取均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算被檢測者血樣原卟啉Ⅸ濃度，高效液相色譜儀檢測原卟啉Ⅸ標(biāo)準(zhǔn)品、血樣的出峰圖像，見圖2。

1.2.1 常規(guī)檢測及檢查 常規(guī)實驗室檢測均在本院檢驗科完成，包括HBV-DNA 定量、AFP、血常規(guī)、肝功、凝血功能等血清學(xué)指標(biāo)。

1.2.2 血清PPⅨ檢測 兩組研究對象禁食、禁水12 h后，清晨空腹采集5 ml 外周靜脈血避光離心，取上清液分裝于1.5 ml 棕色避光EP 管中-80 ℃凍存。血清PPⅨ檢測采用高效液相色譜法（HPLC），在西安醫(yī)學(xué)院藥物分析測試中心完成。主要儀器試劑：安捷倫1260 高效液相色譜儀、配套二元泵、熒光檢測器以及數(shù)據(jù)處理軟件工作站（Agilent，美國）色譜柱（美國Agilent 5 TC-C18），色譜柱（250×4.6 mm，5 μm）。原卟啉Ⅸ標(biāo)準(zhǔn)品（購自上海源葉生物公司），色譜條件：柱溫30 ℃，流動相：A 純凈水（含5%冰乙酸），B甲醇：乙腈：DMF=45:45:10，以B:A=95:5 等度洗脫，流速1 ml/min，激發(fā)波長400 nm，發(fā)射波長630 nm，增益16。

圖1 原卟啉檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 高效液相色譜儀檢測不同標(biāo)本中原卟啉Ⅸ出峰圖像

1.3 觀察指標(biāo) 比較肝硬化組Child-Pugh A、B、C 各級患者及對照組血清原卟啉Ⅸ水平，分析不同肝功能分級患者血清原卟啉Ⅸ的差異，評估血清原卟啉Ⅸ對于乙肝肝硬化肝功能損害及抗HBV 療效的評估作用。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計軟件包括SPSS Statistic 22.0和GraphPad prism 8.0。HBV-DNA 取LOG 值進(jìn)行轉(zhuǎn)換。使用Shapiro-Wilk 檢驗方法進(jìn)行正態(tài)檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料采用（）標(biāo)準(zhǔn)，對比行t檢驗；不符合正太分布的計量資料采用[M（P25，P75）]表示，兩樣本獨立對比行Mann-WhitneyU檢驗，配對樣本比較行Wilcoxon 檢驗；相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析法；采用GraphPad prism 作圖工具進(jìn)行統(tǒng)計繪圖。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清原卟啉Ⅸ水平比較 治療前，肝硬化組患者血清PPⅨ為[66.51（49.26，90.52）]ng/dl、健康對照組為[15.43（10.87，20.16）]ng/dl，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-7.400，P＜0.05）。

表1 肝硬化組Child-Pugh A、B、C 各級患者及對照組血清PPⅨ水平比較[M（P25，P75），ng/dl]

2.2 肝硬化組Child-Pugh A、B、C 各級患者及對照組血清PPⅨ水平比較 肝硬化組Child-Pugh A、B、C各級患者PPⅨ水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；肝硬化組Child-Pugh A 級患者PPⅨ水平高于B、C 級，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Child-Pugh B、C 級患者PPⅨ水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1、圖3。

2.3 血清PPⅨ與肝纖維化評分、實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析 肝硬化患者血清PPⅨ水平與Child-Pugh評分、APRI 評分、FIB-4 評分、TBIL、AST、ALT、ALB、PLT、PT 均具有相關(guān)性（P＜0.05），與HBVDNA、ALP、GGT 無相關(guān)性（P＞0.05），見表2。

圖3 肝硬化組Child-Pugh A、B、C 各級患者及對照組血清PPⅨ水平比較

表2 血清PPⅨ與肝纖維化評分、實驗室指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 血清PPⅨ和肝功能指標(biāo)評估肝硬化Child-Pugh評分的效能 Child-Pugh＞7 分時，PPⅨ評估Child-Pugh 評分的曲線下面積（AUC）為0.853，臨界值62.05 ng/dl，靈敏度86.20%，特異度75.00%，95%CI：0.781～0.952；TBIL 的AUC 為0.869，臨界值29.99 ng/dl，靈敏度75.90%，特異度91.10%，95%CI：0.775～0.962；AST 的AUC 為0.800，臨界值39.85 ng/dl，靈敏度75.90%，特異度21.80%，95%CI：0.710～0.891；ALT 的AUC 為0.675，臨界值40.9 U/L，靈敏度65.50%，特異度 31.50%，95%CI：0.567～0.783。PPⅨ評估肝硬化Child-Pugh 評分的靈敏度高于TBIL，特異度低于TBIL，見圖4。

圖4 血清PPⅨ與肝功能指標(biāo)評估Child-Pugh 評分的效能

2.5 血清原卟啉Ⅸ對抗HBV 療效的評估作用 肝硬化組治療前、治療12、24 周后，患者血清PPⅨ、TBIL水平依次降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），HBVDNA、AST、ALT、ALB、PT 水平與治療前比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），治療前后PLT、ALP、GGT 水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3、圖5。

表3 血清原卟啉Ⅸ對抗HBV 療效的評估作用[M（P25，P75）]

圖5 血清原卟啉Ⅸ對抗HBV 療效的評估作用

3 討論

PPⅨ是卟啉化合物中最重要的一種，作為血紅素合成的前體，其廣泛存在于各細(xì)胞中。肝細(xì)胞是卟啉合成代謝的主要場所，在線粒體和胞漿內(nèi)進(jìn)行，參與細(xì)胞色素P450 的合成，當(dāng)肝細(xì)胞功能障礙時可能影響血紅素和卟啉的代謝。氨基γ 酮戊酸合成酶（aminolevulinic acid synthase，ALAS）是血紅素和PPⅨ合成過程中主要的限速酶，某些藥物可以激活肝細(xì)胞內(nèi)ALAS 表達(dá)，使PPⅨ在肝膽中內(nèi)積聚造成損傷[3]。當(dāng)各種內(nèi)源性或外源性因素導(dǎo)致肝細(xì)胞破壞，干擾血紅素的合成和PPⅨ的體內(nèi)平衡，使血紅素對ALAS 抑制作用降低[4]，大量的PPⅨ具有肝毒性，會導(dǎo)致肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞等一系列組織損害[5]。一旦肝損傷發(fā)生，肝臟對PPⅨ的清除作用進(jìn)一步減弱，血漿和紅細(xì)胞中PPⅨ水平可逐漸升高[3]。

本研究發(fā)現(xiàn)，肝硬化組PPⅨ水平高于對照組，且肝硬化組Child-Pugh A、B、C 各級患者PPⅨ水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示肝硬化時PPⅨ升高且與肝功能損害一致。這可能與PPⅨ在線粒體和胞漿代謝，而HBV 感染引起肝細(xì)胞線粒體的破壞以及肝硬化本身相關(guān)肝細(xì)胞破壞假小葉形成導(dǎo)致血紅素合成障礙及前體PPⅨ積累有關(guān)。PPⅨ是一種內(nèi)生的光敏劑，因此本實驗血清取樣及保存均避光進(jìn)行，體內(nèi)PPⅨ在適合光能和氧氣作用下，會產(chǎn)生活性氧（ROS），可通過蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)損傷導(dǎo)致細(xì)胞毒性，也可攻擊線粒體和細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[2]，因此肝硬化也可出現(xiàn)卟啉代謝異常。另外，研究發(fā)現(xiàn)肝硬化組Child-Pugh A級患者PPⅨ水平高于B、C 級，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而Child-Pugh B、C 級患者PPⅨ水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這可能與病情加重后肝細(xì)胞內(nèi)原卟啉Ⅸ積累有關(guān)，也可能與納入研究的Child-Pugh C 級患者數(shù)量較少有關(guān)。既往有研究發(fā)現(xiàn)肝病患者原卟啉峰高于對照組，與肝功能損害呈正相關(guān)，并且認(rèn)為肝病患者卟啉變化較常規(guī)肝功能檢測出現(xiàn)的更早、敏感性更高[2]。有學(xué)者對不同原因肝硬化患者的卟啉代謝進(jìn)行研究，認(rèn)為卟啉代謝紊亂是評價肝功能的負(fù)面因素，可以動態(tài)評估肝臟功能，作為肝硬化Child-Pugh 分級附加診斷及預(yù)后指標(biāo)。對病毒相關(guān)肝病患者尿便中卟啉進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)肝硬化患者尿便卟啉排泄均較高，并且這種現(xiàn)象在HCV 感染患者中更常見[6]。但這些研究并未單獨對乙肝相關(guān)疾病進(jìn)行探討，本研究發(fā)現(xiàn)，HBV 引起肝細(xì)胞損害時可影響卟啉代謝，患者血清PPⅨ升高，可能因為HBV 感染肝細(xì)胞后其X 蛋白對肝細(xì)胞線粒體損害，進(jìn)而影響血紅素的合成，使PPⅨ在體內(nèi)積累，引起肝細(xì)胞的二次損害，同時PPⅨ清除進(jìn)一步減少，損害持續(xù)加重。肝臟是卟啉代謝的場所，但機(jī)體只有15%的卟啉合成發(fā)生在肝臟中，因此盡管肝臟疾病可引起卟啉代謝異常，但其積累程度又不會引起相關(guān)臨床癥狀[7]。

本次研究顯示，當(dāng)PPⅨ濃度大于62.05 ng/dl時，可以區(qū)分Child-Pugh 評分＞7 分的患者，相比TBIL、AST、ALT 具有較高的靈敏度，但其特異度較TBIL 低。肝硬化的病理表現(xiàn)是肝細(xì)胞變性壞死、纖維組織增生結(jié)節(jié)再生，而肝細(xì)胞壞死程度與卟啉代謝相關(guān)，肝損害越重卟啉代謝異常越明顯[8]，這可能也是本次發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清原卟啉高于正常人，Child-Pugh B、C 級高于A 級的原因，說明PPⅨ與肝功能損害密切相關(guān)。

HBV 病毒可能影響肝細(xì)胞內(nèi)卟啉的代謝和血紅素的合成[5]，本次研究發(fā)現(xiàn)，治療后肝硬化患者PPⅨ及肝功能指標(biāo)均較前好轉(zhuǎn)，PPⅨ與Child-Pugh 評分、總膽紅素、白蛋白呈相關(guān)性；HBV 載量與PPⅨ呈劑量依賴性降低，PPⅨ、膽紅素呈時間依賴性降低。在HCV 合并活動性遲發(fā)性卟啉病（porphyria cutanea tarda，PCT）患者的抗HCV 治療后發(fā)現(xiàn)血清卟啉較前下降[9，10]。HBV 抗病毒治療可以降低血清中PPⅨ水平，可能與抗病毒治療減輕肝細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)，患者肝功能好轉(zhuǎn)有關(guān)；也可能與HBV 核心蛋白可引起FLVCR1 和ABCG2 蛋白表達(dá)增高、ABCB6 蛋白表達(dá)降低，使細(xì)胞出現(xiàn)卟啉代謝紊亂有關(guān)[11]。HCV 核心蛋白同樣可使FLVCR1 和ABCG2蛋白表達(dá)增高，使細(xì)胞內(nèi)PPⅨ、血紅素減少[6]，二者的機(jī)制相似，通過抗病毒治療后，HBV、HCV 載量均降低。FLVCR1 蛋白是轉(zhuǎn)運蛋白超家族成員之一，屬于輸出性蛋白，可以將PPⅨ轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外[11]，ABCG2 蛋白也可以將PPⅨ轉(zhuǎn)運至細(xì)胞外，ABCB6蛋白位于線粒體外膜，是線粒體攝取卟啉的必須蛋白，ABCB6 表達(dá)降低也可能使PPⅨ向線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)運減少。因此，HBV 相關(guān)肝硬化患者血清PPⅨ高于健康對照組可能與HBV 核心蛋白向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運卟啉蛋白表達(dá)增高、向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運卟啉蛋白表達(dá)減少有關(guān)。

本研究不足之處：研究樣本量較少、隨訪時間短，需要多中心、大樣本研究進(jìn)一步闡明Ⅸ對乙肝肝硬化患者的臨床意義。本課題僅對肝硬化患者肝功能與PPⅨ的相關(guān)性及可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，并未進(jìn)行深入研究。后期將進(jìn)一步探討卟啉病患者、藥物性肝損害、肝衰竭與PPⅨ的關(guān)系，以及肝細(xì)胞內(nèi)、膽汁內(nèi)PPⅨ水平，以更科學(xué)、全面的了解PPⅨ的作用機(jī)制。

綜上所述，肝硬化患者原卟啉Ⅸ水平高于健康人群，該指標(biāo)可作為評估乙肝肝硬化患者肝功能損害的預(yù)警因子，也可用于抗HBV 治療效果的評估。