慢病毒sh-SIRT1 載體對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

李 新，田 蜜，王 程

（1.荊門(mén)市第二人民醫(yī)院甲乳外科，湖北 荊門(mén) 448000；2.荊門(mén)市公安局法醫(yī)鑒定中心，湖北 荊門(mén) 448000）

乳腺癌（breast cancer）是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響女性身心健康[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[4，5]，世界乳腺癌發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度高于世界平均增長(zhǎng)速度。近年來(lái)隨著分子靶向治療在乳腺癌中的作用越來(lái)越受到研究者重視，基因靶向治療已逐漸成為乳腺癌研究熱點(diǎn)[6，7]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）是Sirtuin 家族的第一個(gè)成員，參與腫瘤等多種疾病的發(fā)生，影響疾病的發(fā)展和耐藥性[8-10]。研究表明[11]，siRNA-SIRT1 干擾宮頸癌細(xì)胞SIRT1 的表達(dá)，可抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移能力；另有研究發(fā)現(xiàn)[12]，順鉑聯(lián)合siRNA-SIRT1 可降低宮頸癌細(xì)胞耐藥基因的表達(dá)水平，從而提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。因此，本研究通過(guò)構(gòu)建SIRT1 基因的shRNA 慢性病毒載體，觀察SIRT1 在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)變化，探討SIRT1 在乳腺癌中的作用及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年1 月～2019 年12 月荊門(mén)市第二人民醫(yī)院確診的80 例乳腺癌患者的癌組織及癌旁正常組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合乳腺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[13]；排除標(biāo)準(zhǔn)：精神病患者；患有其他腫瘤；有手術(shù)、化療、放療或抗生素治療史的患者及不配合治療者。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 乳腺癌細(xì)胞株[MDA-MB-2 31（BNCC337893）、SK-BR-3（BNCC100524）]和人正常乳腺細(xì)胞[MCF10A（BNCC100439）]均從Bena 培養(yǎng)庫(kù)中購(gòu)買(mǎi)，在37 ℃5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。乳腺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)基體系為1640 培養(yǎng)基（Hyclone 公司）+10%胎牛血清溶液（Gibco 公司）+1%青霉素/鏈霉素溶液（100X，Solarbio 公司），MCF-10A 細(xì)胞系的培養(yǎng)體系為DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone公司）+10%胎牛血清溶液（Gibco 公司）+1%青霉素/鏈霉素溶液（100X，Solarbio 公司）。隨后實(shí)驗(yàn)將在細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到80%～90%后進(jìn)行，轉(zhuǎn)染前1 d，采用無(wú)血清培養(yǎng)基代替完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染時(shí)將1×105細(xì)胞/孔的細(xì)胞接種到6 孔板上。用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒（Invitrogen，USA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染4～6 h 后，換成新鮮培完全培養(yǎng)基。在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)sh-SIRT1 后，觀察乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1.2.2 慢性病毒空載體的包裝及病毒滴度的測(cè)定 從Gen -Bank 中查找 SIRT1 基因的序列（NM 001033578.2），給人類(lèi)SIRT1 基因設(shè)計(jì)一個(gè)特殊的sh-RNA 序列，陰性對(duì)照（NC）作為對(duì)照。利用北京Berry 基因組學(xué)構(gòu)建SIRT1 基因的shRNA 慢性病毒表達(dá)載體，并采用克隆PCR 法篩選重組克隆進(jìn)行比對(duì)鑒定。將綠色熒光蛋白（GFP）與慢性病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231 和SK-BR-3 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染1 d后，改變培養(yǎng)基，培養(yǎng)2 d 后，收集慢性病毒濃縮液感染的MDA-MB-231 和SK-BR-3 細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察GFP 表達(dá)，評(píng)價(jià)病毒感染效率。另采用含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，用常規(guī)液體交換法傳代感染SIRT1-shRNA 慢性病毒的SK-BR-3 和MDA-MB-231 細(xì)胞。將細(xì)胞移植到6 孔板中，每孔2×105個(gè)細(xì)胞。第2 天，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%左右時(shí)，在細(xì)胞培養(yǎng)液（10% FBS、4 μg/ml 多胺）中感染相應(yīng)滴度的病毒溶液。

1.2.3 定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）采用Trizol 純化組織或細(xì)胞的總RNA。用總外顯子RNA 和蛋白質(zhì)分離試劑盒（貨號(hào)4478545，Invitrogen）純化外顯子總RNA。用紫外分光光度計(jì)在260～280 nm 處檢測(cè)總RNA 的濃度和純度，選擇OD260/OD280＞1.8 進(jìn)行qPCR 檢測(cè)。采用Fast-King 一步反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒（北京天根公司，產(chǎn)品目錄號(hào)FP314）和ABIPRISM 7000（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）對(duì)總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR 擴(kuò)增和熒光定量。SIRT1 和mRNA引物由上海桑根生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)體系嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)（50 μl）進(jìn)行：上下游引物1.25 μl，探針1.0 μl，RNA 模板10 μg，50×ROX 參比染料ROX 5 μl，50 μl 總反應(yīng)體系中加入無(wú)RNase dd H2O。反應(yīng)過(guò)程：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果用ABI 棱鏡7000儀器進(jìn)行分析，觀察SIRT1 在乳腺癌組織或細(xì)胞系中的基因表達(dá)水平。采用類(lèi)似的方法[14]，用qPCR 的方法檢測(cè)乳腺癌組織和癌旁組織中SIRT1 的表達(dá)，癌組織中SIRT1 的表達(dá)大于癌旁組織的平均值一倍以上視為高表達(dá)，其余認(rèn)為是低表達(dá)，內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。

1.2.4 免疫印跡 收集細(xì)胞裂解液，以1,2000 r/min離心15 min。取上清液，SDS-PAGE 電泳分離蛋白。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC 膜上，在室溫下放置1 h（用5%脫脂牛奶溶液封閉）。加入SIRT1、α-catenin、PTEN、E -cadherin、N -cadherin、β -catenin、Vimentin 和GAPDH 等抗體，放置在4 ℃下過(guò)夜。用PBST 溶液清洗NC 膜3 次，加入相應(yīng)二抗（HRP 交聯(lián)），室溫孵育1 h。最后，用PBST 溶液清洗NC 膜，并用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行可視化處理。內(nèi)參蛋白為GAPDH，待測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=待測(cè)條帶的灰度值/GAPDH 條帶的灰度值，觀察SIRT1 蛋白及ECT 相關(guān)蛋白在乳腺癌組織或細(xì)胞系中的表達(dá)水平。

1.2.5 細(xì)胞遷移和侵襲 采用胰蛋白酶酶解法制備細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于2×104細(xì)胞/孔的移行上腔（含200 μl 10%胎牛血清+1% DMEM 培養(yǎng)基），并將DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，總體積500 μl）加入下腔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，取上腔液，擦去腔壁細(xì)胞。用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞20 min。0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS 緩沖液洗滌。在200 倍顯微鏡下采集細(xì)胞遷移圖像。隨機(jī)選取5 個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)，取平均值作為細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。在上述步驟上，用8%的基質(zhì)膠鋪貼用于侵襲實(shí)驗(yàn)，每孔細(xì)胞數(shù)增加到5×104個(gè)，觀察sh-SIRT1 在乳腺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移能力。

1.2.6 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性 用胰蛋白酶酶解法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化，將細(xì)胞離心除去酶液，加入新鮮培養(yǎng)基，吹制細(xì)胞懸液。取4 個(gè)96 孔板，按每孔5×103孔/100 μl 的規(guī)格接種細(xì)胞，每組3 孔。每24 h 取一孔板，加入5 mg/ml MTT 溶液10 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，取出培養(yǎng)基，用酶標(biāo)儀在570 nm 處測(cè)定OD 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，觀察細(xì)胞活性-時(shí)間曲線，分析sh-SIRT1 在乳腺癌細(xì)胞中的增殖能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以（n）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1 在乳腺癌中的表達(dá)情況 SIRT1 在乳腺癌中呈高度表達(dá)，癌旁組織中呈低表達(dá)；與人乳腺上皮細(xì)胞（MCF-10A）相比，乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231、SK-BR-3）中SIRT1 的基因表達(dá)增加，見(jiàn)圖1。

2.2 SIRT1 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 不同年齡、吸煙行為、酗酒行為間SIRT1 表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同T 分期、N 分期、M 分期間SIRT1表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

圖1 SIRT1 在乳腺癌中的表達(dá)情況

表1 SIRT1 表達(dá)與臨床特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 構(gòu)建慢病毒載體sh-SIRT1 細(xì)胞系 在MDAMB-231 細(xì)胞系和SK-BR-3 細(xì)胞系中構(gòu)建了sh-SIRT1 的慢病毒表達(dá)體系；qPCR 和Western Blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的兩個(gè)細(xì)胞系中SIRT1 基因水平和蛋白水平表達(dá)均明顯下降，見(jiàn)圖2。

圖2 構(gòu)建sh-SIRT1 的慢病毒表達(dá)細(xì)胞系

2.4 sh-SIRT1 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響 MTT 法檢測(cè)顯示，在MDA-MB-231 細(xì)胞和SK-BR-3 細(xì)胞中sh-SIRT1 可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖（圖3）。Transwell 法檢測(cè)顯示，在MDA-MB-231細(xì)胞中sh-SIRT1 可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲（圖4）。

圖3 sh-SIRT1對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 sh-SIRT1 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.5 sh-SIRT1 對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT 過(guò)程的影響Western Blot 檢測(cè)顯示，sh-SIRT1 可抑制α-catenin、PTEN 和E-cadherin 表達(dá)下調(diào)（圖5A），促進(jìn)N-cadherin、β-catenin 和Vimentin 表達(dá)上調(diào)（圖5B）。

圖5 sh-SIRT1 對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT 的影響

3 討論

慢性病毒載體是目前最適合體內(nèi)基因轉(zhuǎn)化甚至基因治療的載體工具[15，16]。研究表明[17]，慢性病毒載體是在免疫缺陷病毒的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種基因治療載體，屬于自殺病毒。慢性病毒載體能產(chǎn)生表達(dá)shRNA 的高滴度病毒，誘導(dǎo)基因表達(dá)的穩(wěn)定功能沉默，成為沉默細(xì)胞基因，其介導(dǎo)的RNA 干擾技術(shù)對(duì)基因治療的發(fā)展具有重要意義[18，19]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SIRT1 基因在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞系SK-BR-3 和MDA-MB-231 中也呈高表達(dá)，表明SIRT1 在乳腺癌中上調(diào)。此外，通過(guò)對(duì)80 例乳腺癌患者臨床特征進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SIRT1 在T3/T4、N1和M1中高表達(dá)，而與年齡、吸煙和酗酒無(wú)相關(guān)關(guān)系，這也提示SIRT1 參與了乳腺癌的轉(zhuǎn)移進(jìn)展過(guò)程。此外，本研究成功構(gòu)建了慢病毒載體sh-SIRT1 細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)sh-SIRT1 可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，這與SIRT1在乳腺癌的發(fā)病與轉(zhuǎn)移中具有高表達(dá)相一致。SIRT1 是一個(gè)組蛋白脫乙?；讣易澹瑓⑴c不同細(xì)胞中各種蛋白質(zhì)的乙?；揎梉20]。有研究表明[21]，SIRT1 通過(guò)調(diào)節(jié)谷氨酰胺代謝，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮其促癌作用。另有研究表明，SIRT1 通過(guò)乙?；?xì)胞核中的靶蛋白改變細(xì)胞活性并影響其細(xì)胞內(nèi)功能[22]，惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與SIRT1 表達(dá)的上調(diào)密切相關(guān)，SIRT1 下調(diào)會(huì)抑制肝癌和卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[23]，與胰腺癌[24]、肝癌[25]和肺癌[26]等均密切相關(guān)。Wu SH 等[27]研究表明，shRNA 慢性病毒載體對(duì)CCR3 基因表達(dá)的抑制作用可以有效地減少肥大細(xì)胞在局部組織中的遷移、浸潤(rùn)和脫顆粒，減輕變應(yīng)性鼻炎小鼠的炎癥反應(yīng)。本研究通過(guò)建立shRNA 慢病毒載體進(jìn)一步補(bǔ)充了SIRT1 對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。同時(shí)，通過(guò)shRNA 慢病毒載體干擾SK-BR-3 和MDAMB-231 細(xì)胞中SIRT1 的表達(dá)，觀察了sh-SIRT1 對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT 過(guò)程的影響，結(jié)果表明EMT 相關(guān)蛋白α-catenin、PTEN 和E-cadherin 在乳腺癌細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)，N-cadherin、β-catenin 和Vimentin 出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)，這為SIRT1 參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移提供了依據(jù)。研究報(bào)道[28，29]，SIRT1 的mRNA 和蛋白水平降低，從而抑制EMT 并影響EMT 相關(guān)分子，包括PTEN 和E-cadherin。Qi HF 等[30]通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)了SIRT1 是miR-448 的直接靶點(diǎn)，激活SIRT1 將逆轉(zhuǎn)miR-448 模擬物誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EMT 生長(zhǎng)抑制能力，并起到破壞作用。以上結(jié)果表明，慢病毒sh-SIRT1 干擾SIRT1 表達(dá)，αcatenin、PTEN、E-cadherin 等細(xì)胞間聚集的粘附分子表達(dá)水平上調(diào)，最終抑制乳腺癌細(xì)胞EMT 的增殖。慢病毒sh-SIRT1 干擾SIRT1，會(huì)抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然而，本研究中SIRT1 慢病毒載體與乳腺癌細(xì)胞增殖的關(guān)系只是初步研究，在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中SIRT1 所涉及的信號(hào)通路可以作為SIRT1 致癌網(wǎng)絡(luò)的補(bǔ)充。

綜上所述，SIRT1 在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，慢病毒sh-SIRT1 載體可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。因此，SIRT1 基因shRNA 慢病毒載體在乳腺癌靶向治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。