磁珠法和柱式法提取核酸在新城疫熒光定量檢測中的比較

王軍，何長生，王維，王倩，周迎春

（安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心合肥 230091）

新城疫（newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）強毒株引起的、以感染禽類為主的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病[1]，具有很高的發(fā)病率和死亡率，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，曾在世界范圍內(nèi)引起三次大的流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，嚴(yán)重影響了養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，該病與高致病性禽流感并列為世界公認的最重要的2 個禽類疫病[2,3]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將新城疫列為A 類疫病，我國將其列入一類動物疫病[4]。

目前檢測新城疫病毒的常用方法為熒光定量RT-PCR，該方法比常規(guī)的檢測方法用時少、周期短、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強、操作簡便[5]，且不易引起污染，還可用于病毒的定量分析。在檢測過程中，提取核酸是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因為提取后的核酸質(zhì)量及其完整性會直接影響到后續(xù)試驗結(jié)果[6]。本研究選用實驗室常用的磁珠法和柱式法提取病毒核酸進行熒光定量RT-PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)兩種提取方法在靈敏度及重復(fù)性等方面存在差異?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與設(shè)備King Fisher Flex 96 通道全自動核酸提取儀，微量移液器，MIKRO 200R 高速冷凍離心機，BIO-RAD CFX Connect 熒光定量PCR 儀。

1.1.2 檢測試劑新城疫病毒熒光RT-PCR 試劑盒，購自深圳澳東檢驗檢測科技有限公司，批號：66080；病毒核酸（RNA）抽提試劑盒（離心柱式），購自深圳澳東檢驗檢測科技有限公司，批號：69015；病毒核酸提取試劑（磁珠法），購自廣州和實生物技術(shù)有限公司，批號：CZD00412。

1.1.3 樣品2020 年主要禽病流行病學(xué)調(diào)查及監(jiān)測中，篩查出的新城疫陽性樣品（雞咽泄拭子和環(huán)境拭子），共22 份。

1.2 方法

1.2.1 磁珠法將拭子樣品混勻，靜置3～5min，取200μL上清，由King Fisher Flex 96 通道全自動核酸提取儀提取核酸，最后獲得100μLRNA 溶液。

1.2.2 柱式法將拭子樣品混勻，靜置3～5min，取100μL上清到1.5mL潔凈離心管中，加入200μL裂解液、3μLCa rrie r RNA，渦旋混勻20s，室溫靜置5min，然后加入150μL無水乙醇，顛倒混勻，短暫低速離心除去管蓋上的液體，小心將混合液體轉(zhuǎn)移至純化柱管內(nèi)，12,000rp m 離心1min，倒棄廢液收集管內(nèi)液體。打開管蓋，加入450μL洗液1，12,000rp m 離心1min，倒棄廢液收集管內(nèi)液體；打開管蓋，加入500μL洗液2，12,000rp m 離心1min，倒棄廢液收集管內(nèi)液體；再加入500μL無水乙醇，12,000rp m 離心1min，倒棄廢液收集管內(nèi)液體，再于12,000rp m 離心3min，丟棄廢液收集管。將純化柱取出放進1.5mL潔凈的離心管中，打開管蓋，室溫干燥3min 后，向膜片中央小心加入50μL 洗脫液，室溫放置1min，12,000rp m 離心1min，最后獲得50μLRNA 溶液。

1.2.3 熒光RT-PCR 法PCR 各個組分所需要的量，按（n+1）公式計算，然后分別吸取混入同一滅菌1.5mL進口離心管中，渦旋振蕩、瞬時離心后，分裝至PCR 反應(yīng)管中。向PCR 反應(yīng)管中加入5μL核酸，標(biāo)明位置后放入BIO-RAD CFX Connect熒光定量PCR儀，按試劑盒說明書編程運行。

2 結(jié)果

根據(jù)試劑盒說明書，磁珠法吸取200μL樣品，加100μLElutionbuffer，最后獲得100μLRNA 溶液；柱式法吸取100μL樣品，加50μLElutionbuffer，最后獲得50μLRNA 溶液。兩種提取方法樣品用量與獲得核酸體積比例相當(dāng)。以每種提取方法3 次平行提取病毒RNA 為模板，每次用同種熒光RT-PCR 試劑進行擴增。結(jié)果顯示，磁珠法提取核酸的熒光RT-PCR 結(jié)果成功率較高，3 次檢測，陽性率均為100%。結(jié)果見表1。

從每種提取方法的3 次平行熒光RT-PCR 檢測中，各選取一張擴增效果較好的曲線圖（見圖1、圖2），其中磁珠法提取核酸熒光RT-PCR 陽性樣品的Ct 值范圍為13.46～29.81（陽性對照Ct 值：19.70）；柱式法提取核酸熒光RT-PCR 陽性樣品的Ct 值范圍為17.09～31.23（陽性對照Ct 值：20.11）。

3 討論

3.1 磁珠法提取核酸的檢測靈敏度較高

表1 兩種提取方法檢測新城疫熒光RT-PC R陽性率的比較

圖1 磁珠法提取核酸熒光RT-PCR 擴增曲線

圖2 柱式法提取核酸熒光RT-PCR 擴增曲線

根據(jù)表1，對于22 份新城疫陽性待檢樣品，磁珠法提取核酸的熒光RT-PCR 檢測結(jié)果全部為陽性，檢出率達100%，而柱式法提取核酸的熒光RT-PCR 檢測結(jié)果較好的一次，檢出率僅達86.36%（19/22）；由圖1 和圖2 可知，磁珠法提取核酸的熒光RT-PCR 擴增曲線較好，反映出所提取核酸的濃度及純度較高。這表明磁珠法提取核酸的檢測靈敏度較高。對于檢測一些病毒含量較低的樣品而言，選擇磁珠法提取核酸，可以避免因核酸提取效率低導(dǎo)致熒光RT-PCR 結(jié)果假陰性的出現(xiàn)，能夠減少新城疫疫情診斷的失誤。

3.2 磁珠法提取核酸的檢測重復(fù)性較好

由表1 可知，3 次平行檢測，磁珠法提取核酸的熒光RT-PCR檢出率均為100%，檢測結(jié)果一致。這表明磁珠法提取核酸的檢測重復(fù)性較好。究其原因，應(yīng)該與磁珠法提取原理及用機器代替人工進行全自動操作有關(guān)。在提取過程中磁珠的大表面積與目標(biāo)核酸特異性地識別和高效結(jié)合，使其具有優(yōu)越的洗脫效率，可有效提高提取核酸的濃度及純度。

3.3 加強磁珠法在新城疫病毒核酸提取中的應(yīng)用

做好新城疫監(jiān)測工作，可為新城疫疫情預(yù)警預(yù)報提供有效技術(shù)支撐，是現(xiàn)階段降低新城疫流行的重要手段。通過本研究發(fā)現(xiàn)，磁珠法提取核酸在新城疫的熒光定量檢測中優(yōu)于柱式法。在當(dāng)前普遍采用熒光RT-PCR 檢測方法的背景下，選擇提取效率較高的核酸提取方法，可有效保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此建議各獸醫(yī)實驗室加強磁珠法在新城疫病毒核酸提取中的應(yīng)用。