異黃綿馬酸PB對(duì)紅色毛癬菌生物被膜黏附及甾醇代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

侯捷 唐春萍 沈志濱 陳艷芬 丁慎 張祉思 李小英 江濤

摘 要 目的：研究異黃綿馬酸PB（簡(jiǎn)稱“PB”）對(duì)紅色毛癬菌生物被膜黏附及甾醇代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響。方法：采用M38-A2法測(cè)定PB對(duì)紅色毛癬菌的最小抑菌濃度（MIC）;采用MTT法篩選紅色毛癬菌生物被膜的構(gòu)建條件和初黏附時(shí)間;采用XTT法評(píng)價(jià)不同質(zhì)量濃度PB（40、80、160 ?g/mL）對(duì)紅色毛癬菌黏附過程的影響（另設(shè)置不加此藥物的生長對(duì)照組，下同），并計(jì)算相對(duì)黏附率;采用XTT法并結(jié)合倒置顯微鏡觀察不同質(zhì)量濃度PB（20、40、80 ?g/mL）對(duì)不同初黏附時(shí)間下（3、5、9 h）紅色毛癬菌生物被膜形成的影響并計(jì)算黏附抑制率;采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)PB（320 ?g/mL）對(duì)紅色毛癬菌生物被膜中甾醇代謝相關(guān)酶基因ERG6、ERG11 mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果：PB對(duì)紅色毛癬菌的MIC為20 ?g/mL。紅色毛癬菌生物被膜在含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中且初黏附時(shí)間為6 h時(shí)的代謝活性最強(qiáng)。與生長對(duì)照組比較，紅色毛癬菌經(jīng)不同質(zhì)量濃度PB作用后，相對(duì)黏附率和生物被膜中ERG6、ERG11 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.01）;菌絲減少甚至消失，黏附抑制率（初黏附5、9 h時(shí)）顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：PB能抑制紅色毛癬菌的黏附過程，減少菌絲形成;該作用機(jī)制可能與抑制生物被膜中甾醇代謝相關(guān)酶基因ERG6、ERG11 mRNA的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 異黃綿馬酸PB;紅色毛癬菌;生物被膜;黏附;甾醇代謝

中圖分類號(hào) R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）05-0584-06

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the effect of isoflavaspidicacid PB （called PB for short） on the biofilm adhesion and the gene expression of ergosterol metabolism related enzymes in Trichophyton rubrum. METHODS： M38-A2 method was adopted to determine MIC of PB to T. rubrum. MTT assay was used to screen the biolfilm condition and initial adhesion period of T. rubrum. The effects of different concentrations of PB （40， 80， 160 ?g/mL） on the adhesion duration of T. rubrum （growth control group without PB was set up， similarly hereinafter） were evaluated and the adhesion rate was calculated by using XTT assay; the effects of different concentrations of PB （20， 40， 80 ?g/mL） on the biofilm formation of T. rubrum at different initial adhesion periods （3， 5， 9 h） were observed and the adhesion rate was calculated by using XTT assay combined with inverted microscope; qRT-PCR method was used to detect the effects of PB （320 ?g/mL） on the mRNA expression of ergosterol metabolism related enzyme gene ERG6 and ERG11 in biofilm of T. rubrum. RESULTS： MIC of PB to T. rubrum was 20 ?g/mL. The biofilm of T. rubrum in RPMI-1640 medium containing 10% FBS was the most metabolism activity at 6 h of initial adhesion. Compared with growth control group， after treated with different concentrations of PB， adhesion rate and mRNA expression of ERG6 and ERG11 in biofilm were decreased significantly （P<0.01）. Hyphae decreased or even disappeared， and the adhesion inhibition rate （at 5 and 9 h of initial adhesion） increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： PB can inhibit the adhesion of T. rubrum and reduce the hyphae; the mechanism may be associated with the inhibition of the biofilm adhesion and mRNA expression of ergosterol metabolism related enzyme gene ERG6 and ERG11.

KEYWORDS? ?Isoflavaspidic acid PB; Trichophyton rubrum; Biofilm; Adhesion; Ergosterol metabolism

近年來，淺部真菌病的發(fā)病率持續(xù)增加，對(duì)人們健康產(chǎn)生重大影響[1]。紅色毛癬菌Trichophyton rubrum是臨床最常見的皮膚癬菌，為淺部真菌病的主要病原菌，有69.5%的皮膚癬菌病是由紅色毛癬菌感染所致[2]。目前，臨床上常用的抗真菌藥包括三唑類、多烯類、棘白菌素類等[3]。抗真菌藥的大量使用不僅對(duì)人體的毒副作用較大，而且長期使用也會(huì)導(dǎo)致病原菌耐藥性的產(chǎn)生，例如紅色毛癬菌對(duì)特比奈芬耐藥[4]、白色念珠菌對(duì)氟康唑耐藥[5]，嚴(yán)重影響患者的治療效果。有研究表明，抗真菌藥物耐藥性的耐藥性產(chǎn)生與生物被膜的形成密切相關(guān)[6]。然而，關(guān)于紅色毛癬菌生物被膜耐藥的問題，目前研究報(bào)道甚少。

麥角甾醇是真菌生長必需的重要成分，其能與磷酸結(jié)合起到保護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定性的作用，對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、流動(dòng)性以及膜結(jié)合酶的活性具有重要作用[7]。一旦出現(xiàn)麥角甾醇缺失的情況，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性就會(huì)下降，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流，引起真菌細(xì)胞死亡[8]。在麥角甾醇的合成過程中，有4個(gè)重要的環(huán)節(jié)，分別是甲羥戊酸的生物合成、甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為角鯊烯、角鯊烯形成羊毛甾醇、羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為麥角甾醇[9]。其中，ERG6 是C-24位甲基轉(zhuǎn)移酶上的編碼基因，其mRNA的高表達(dá)不僅可以補(bǔ)償其他高表達(dá)基因?qū)溄晴薮紟淼呢?fù)反饋?zhàn)饔?，同時(shí)還可以進(jìn)一步提高麥角甾醇的含量[10]。14-α去甲基酶是麥角甾醇合成通路中的關(guān)鍵酶，抑制該酶活性，可阻止羊毛甾醇的去甲基化，使其終產(chǎn)物麥角甾醇缺失，從而破壞細(xì)胞的完整性，進(jìn)而抑制真菌生長[11]。

香鱗毛蕨Dryopteris fragrans（L.）Schott是鱗毛蕨科鱗毛蕨屬植物，具有抗菌、抗腫瘤、止癢、抗過敏等多種功效，在民間被廣泛用于治療多種皮膚?。ㄈ珞w癬、手足癬等），均有較好的效果[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，香鱗毛蕨中的單體化合物異黃綿馬酸PB（簡(jiǎn)稱“PB”）對(duì)紅色毛癬菌及其生物被膜成熟期均有較強(qiáng)抑制作用[13]。基于此，本研究以紅色毛癬菌為研究對(duì)象，初步分析PB對(duì)紅色毛癬菌生物被膜黏附及甾醇代謝相關(guān)酶基因（ERG6、ERG11）表達(dá)等的影響，為深入研究PB抗紅色毛癬菌生物被膜的作用及機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：PB-10型臺(tái)式數(shù)顯pH計(jì)[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]，BA310型正置顯微鏡、AE2000型倒置顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），iMark型酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad公司），DHP-9032B型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），CHA-S型恒溫振蕩器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司），Strat-agene Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）儀（美國Agilent公司），K960型PCR擴(kuò)增儀（杭州晶格科學(xué)儀器有限公司），血細(xì)胞計(jì)數(shù)板（上海市求精生化試劑儀器有限公司），Q6000UV型超微量紫外分析儀（美國Quawell Technology公司），SW-CJ-1型超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：PB（本實(shí)驗(yàn)室自制，純度>98%），特比萘芬（TBF）、甲萘醌（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為M0726A、C1517035），兩性霉素B（AMB，美國AMRESCO公司，批號(hào)A0414，純度>98%），氟康唑（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)504B041，純度>98%），MTT試劑（廣州瑞舒生物科技有限公司，批號(hào)201612），XTT鈉鹽（美國Sigma公司，批號(hào)CX28143704），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號(hào)1786045），胎牛血清（FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司，批號(hào)19110506），二甲基亞砜（DMSO，天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)2019030121），丙酮（衡陽市凱信化工有限公司有限公司，批號(hào)0601142），BestarTM qRT-PCR試劑盒、BestarTM qPCR MasterMix試劑盒（德國DBI公司，貨號(hào)分別為2220、2043），TRIzol試劑（日本TaKaRa公司，貨號(hào)9109），焦碳酸二乙酯（DEPC，上海麥克林生化科技有限公司，貨號(hào)6079），PCR引物（由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列及產(chǎn)物長度信息見表1）;其余試劑為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

1.3 菌株

本研究所用紅色毛癬菌臨床菌株YAMA-786、近平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC-22019均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所提供。

2 方法

2.1 紅色毛癬菌菌懸液的制備

取紅色毛癬菌臨床菌株YAMA-786，于超凈工作臺(tái)中接種在馬鈴薯固體培養(yǎng)基的試管斜面上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)14天后，連續(xù)傳代2次得到紅色毛癬菌實(shí)驗(yàn)菌株;然后采用接種環(huán)輕刮菌落置于研磨器中，加入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）1 mL，研磨成菌懸液，經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用RPMI-1640液體培養(yǎng)基將菌懸液濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL，備用。

2.2 PB對(duì)紅色毛癬菌藥敏性的影響考察

采用M38-A2法進(jìn)行檢測(cè)。取PB以RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，使藥物質(zhì)量濃度為640 ?g/mL，分別加入96孔板的第1列孔中（每孔200 ?L），在第2～10列孔中加入RPMI-1640培養(yǎng)基100 ?L，然后從第1列孔中吸取100 ?L PB藥液加入第2列孔中，充分混勻后吸取100 ?L加入第3列孔中，依次進(jìn)行倍比稀釋[14];第10列孔中藥液混勻后吸棄100 ?L;在第11列孔加入RPMI-1640培養(yǎng)基100 ?L作為生長對(duì)照組（即不含藥物），第12列孔加入RPMI-1640 液體培養(yǎng)基200 ?L作為空白對(duì)照。除第12列孔不加入紅色毛癬菌菌懸液外，其余各孔均加入2×104個(gè)/mL的菌懸液（使PB藥液終質(zhì)量濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160、320 ?g/mL），于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，以肉眼觀察96孔板中無菌生長的孔所對(duì)應(yīng)的藥物濃度作為PB的最小抑菌濃度（MIC）。另取陽性對(duì)照藥TBF、AMB同上述方法進(jìn)行倍比稀釋（終質(zhì)量濃度分別為0.003 9～2、0.062 5～8? ? ? μg/mL），按上述方法測(cè)定TBF、AMB的MIC。另以平滑念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC22019作為質(zhì)控菌，以氟康唑作為質(zhì)控菌藥物（終質(zhì)量濃度為0.0625～8 μg/mL），同上述方法測(cè)定氟康唑?qū)ζ交钪榫腗IC，若氟康唑的MIC為0.5～4 ?g/mL，則表明該方法可靠。以上試驗(yàn)操作均重復(fù)3次。

2.3 紅色毛癬菌生物被膜構(gòu)建條件篩選

采用MTT法篩選構(gòu)建紅色毛癬菌生物被膜的培養(yǎng)基和初黏附時(shí)間。分別以含或不含10%FBS的RPMI- 1640培養(yǎng)基將紅色毛癬菌菌懸液稀釋至1×106個(gè)/mL，按每孔100 ?L接種至96孔板中，分別在35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、3、6、12、24、96 h（即初黏附時(shí)間，每種培養(yǎng)基各時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置10個(gè)復(fù)孔），棄去上層培養(yǎng)基，用無菌PBS輕輕沖洗2次，再加入相應(yīng)培養(yǎng)基100 ?L后，繼續(xù)于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至96 h;棄去上層培養(yǎng)基，用無菌PBS輕輕沖洗2次，室溫干燥后，加入5 mg/mL MTT溶液 20 ?L，置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 h后，再加入DMSO 150 ?L，低速振蕩10 min;吸取上述菌懸液100 ?L到新孔板中，采用酶標(biāo)儀于510 nm波長處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值。OD值越高，表明紅色毛癬菌生物被膜中孢子代謝活性越高，即該條件越優(yōu)。

2.4PB對(duì)紅色毛癬菌黏附過程的影響考察

采用XTT法進(jìn)行檢測(cè)。以含10%FBS的RPMI- 1640培養(yǎng)基將紅色毛癬菌菌懸液調(diào)整為1×106個(gè)/mL，然后按每孔100 ?L接種至96孔板中，隨機(jī)分為PB 40、80、160 ?g/mL質(zhì)量濃度組（根據(jù)PB的2、4、8倍MIC進(jìn)行設(shè)置），并加入相應(yīng)藥液100 ?L;同時(shí)設(shè)置生長對(duì)照組（含菌懸液但不含藥物）和空白對(duì)照組（只含培養(yǎng)基），每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將96孔板于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，用無菌PBS輕輕沖洗2次;加入新鮮的含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基100 ?L，繼續(xù)于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至96 h后，棄去原培養(yǎng)基，用無菌PBS輕輕沖洗2次，于室溫條件下干燥;每孔加入100 ?L XTT-甲萘醌溶液（XTT鈉鹽用PBS配制成0.5 mg/mL的飽和溶液，甲萘醌用丙酮配制成10 mol/L的溶液，然后兩者按1 ∶ 10體積比混勻而得），避光培養(yǎng)2 h后取出，將96孔板置于微量振蕩器上振蕩10 min，使染料分布均勻;吸取上述染色后的菌懸液100 ?L于新的96孔板中，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測(cè)各孔OD值。另設(shè)置陽性對(duì)照藥TBF 0.25、0.5、1.5 ?g/mL質(zhì)量濃度組（根據(jù)TBF的2、4、8倍MIC進(jìn)行設(shè)置），按上述方法操作。然后根據(jù)公式計(jì)算紅色毛癬菌的相對(duì)黏附率：相對(duì)黏附率（%）=（OD藥物組- OD空白對(duì)照組）/（OD生長對(duì)照組-OD空白對(duì)照組）×100%。

2.5PB對(duì)不同初黏附時(shí)間下紅色毛癬菌生物被膜形成的影響

采用XTT法進(jìn)行檢測(cè)。以含10% FBS的RPMI- 1640培養(yǎng)基將紅色毛癬菌菌懸液調(diào)整為1×106 個(gè)/mL，按每孔100 ?L分別接種至3個(gè)96孔板中，置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3、5、9 h（該過程即為紅色毛癬菌的初黏附過程），然后用PBS輕輕沖洗2次，再將含菌孔板隨機(jī)分為PB 20、40、80 ?g/mL質(zhì)量濃度組（根據(jù)PB的1、2、4倍MIC進(jìn)行設(shè)置），并加入相應(yīng)藥液;同時(shí)設(shè)置生長對(duì)照組（含菌懸液但不含藥液）和空白對(duì)照組（只含培養(yǎng)基），每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至96 h，取出，于倒置顯微鏡下觀察PB對(duì)不同初黏附時(shí)間下紅色毛癬菌生物被膜黏附作用的影響，并拍照記錄。然后棄去培養(yǎng)基，以無菌PBS輕輕沖洗2次，于室溫條件下干燥后，每孔加入XTT-甲萘醌溶液100 ?L，避光培養(yǎng)2 h后取出，將96孔板置于微量振蕩器上振蕩10 min，使染料分布均勻;吸取上述染色后的菌懸液100 ?L到新的96孔板中，用酶標(biāo)儀于490 nm波長處檢測(cè)各孔OD值，并計(jì)算不同初黏附時(shí)間下對(duì)紅色毛癬菌的黏附抑制率：黏附抑制率（%）=

2.6PB對(duì)紅色毛癬菌生物被膜中ERG6、ERG11 mRNA表達(dá)的影響

根據(jù)“2.2”項(xiàng)下篩選的條件，以含10%FBS的RPMI - 1640培養(yǎng)基將紅色毛癬菌菌懸液稀釋成1×106個(gè)/mL，按每孔2 mL接種至6孔板中，置于 35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，吸棄上層培養(yǎng)基，用無菌PBS輕輕沖洗3次，然后加入2 mL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至96 h;棄去上層培養(yǎng)基后，分別加入含PB和陽性對(duì)照藥TBF、AMB的培養(yǎng)基（終質(zhì)量濃度均分別為320、2、8 ?g/mL，每種藥物設(shè)置3個(gè)復(fù)孔）2 mL，置于 35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用4 ℃的PBS清洗2次，以1 000 r/min離心10 min，棄上清，即得不同藥物作用后的紅色毛癬菌生物被膜樣品，于液氮中保存，備測(cè)。

取上述待測(cè)紅色毛癬菌生物被膜樣品100 mg，加入TRIzol試劑1 mL研磨，然后加入氯仿0.2 mL，振蕩后于4 ℃條件下放置3 min，再以12 000 r/min離心15 min，取上清液至EP管中，加入等體積異丙醇混勻;棄上清，加入DEPC處理過的75%乙醇溶液洗滌沉淀后，于4 ℃條件下以8 000 r/min離心5 min，棄去上清，沉淀于室溫下晾干后，加入30 ?L DEPC處理過的ddH2O溶解RNA;取RNA溶液1.5 ?L于超微量紫外分析儀中測(cè)定濃度后，置于-80 ℃冰箱中保存，備用。以上述總RNA 4 μg為模板，按照BestarTM qPCR RT試劑盒說明書方法將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（共20 ?L）為：Bestar? SybrGreen qPCR masterMix 10μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性20 s，58℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。進(jìn)行融解曲線分析：94℃變性30 s，65 ℃退火30 s，94 ℃延伸30 s。上述試驗(yàn)均重復(fù)操作3次。以β-tubulin為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 PB對(duì)紅色毛癬菌藥敏性的影響

PB、TBF和AMB對(duì)紅色毛癬菌的MIC分別為20、0.125、0.5 ?g/mL;氟康唑?qū)|(zhì)控菌株近平滑念珠菌ATCC-22019的MIC為2 ?g/mL，符合質(zhì)控要求，測(cè)試結(jié)果可信。

3.2 紅色毛癬菌生物被膜構(gòu)建條件的篩選結(jié)果

在相同初黏附時(shí)間（3、6、12 h）下，與不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基比較，含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中紅色毛癬菌生物被膜的OD值均顯著升高（P<0.01），表明紅色毛癬菌在含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中的代謝活性增強(qiáng)，生物被膜的形成量明顯增加。在含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，與6 h的初黏附時(shí)間比較，其他初黏附時(shí)間（12、24、48 h）下紅色毛癬菌生物被膜的OD值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），表明紅色毛癬菌在含10%FBS培養(yǎng)基中初黏附6 h時(shí)的生物被膜代謝活性最強(qiáng)，詳見表3。

3.3 PB對(duì)紅色毛癬菌黏附過程的影響

藥物作用6 h后，與生長對(duì)照組比較，PB和TBF各質(zhì)量濃度組紅色毛癬菌的相對(duì)黏附率均顯著降低（P<0.01），詳見表3。

3.4 PB對(duì)不同初黏附時(shí)間下紅色毛癬菌生物被膜形成的影響

不同初黏附時(shí)間下，生長對(duì)照組均有大量紅色毛癬菌菌絲聚集成團(tuán)，生物被膜結(jié)構(gòu)致密。當(dāng)初黏附3 h時(shí)，與生長對(duì)照組比較，PB 20、40 ?g/mL質(zhì)量濃度組菌絲數(shù)量相對(duì)減少，PB 80 ?g/mL質(zhì)量濃度組菌絲數(shù)量明顯減少、長度明顯縮短;當(dāng)初黏附5、9 h時(shí)，PB 20、40 ?g/mL質(zhì)量濃度組菌絲數(shù)量明顯減少，PB 80 ?g/mL質(zhì)量濃度組未發(fā)現(xiàn)明顯菌絲，詳見圖1。與生長對(duì)照組比較，初黏附3 h后，PB 20、40、80 ?g/mL質(zhì)量濃度組紅色毛癬菌生物被膜的黏附抑制率均顯著升高（P<0.05）;初黏附5、9 h后，PB 20、40、80 ?g/mL質(zhì)量濃度組紅色毛癬菌生物被膜的黏附抑制率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），詳見表4。

3.5 PB對(duì)紅色毛癬菌生物被膜中ERG6、ERG11 mRNA表達(dá)的影響

與生長對(duì)照組比較，TBF組紅色毛癬菌生物被膜中ERG6、ERG11 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）;AMB組、PB組紅色毛癬菌生物被膜中ERG6、ERG11 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

4 討論

目前國內(nèi)外對(duì)紅色毛癬菌生物被膜的研究甚少，對(duì)真菌生物被膜的研究主要集中在白色念珠菌生物被膜，尚未形成對(duì)紅色毛癬菌生物被膜的系統(tǒng)性探究[15]。真菌生物被膜的形成過程中受到很多因素的影響，包括不同的培養(yǎng)基成分及黏附時(shí)間，即使在相同材質(zhì)的黏附表面，在外界環(huán)境營養(yǎng)成分不一致的情況下生物被膜產(chǎn)生的程度也不盡相同[16-18]。例如Nikawa等[19]和 Frade等[20]的研究表明，在培養(yǎng)基中添加血清，可有效增加白色念珠菌生物被膜中孢子的代謝活性?；诖?，本研究也探討了在培養(yǎng)基中加入與不加FBS對(duì)紅色毛癬菌生物被膜形成的影響。結(jié)果表明，在含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，且初黏附時(shí)間為6 h時(shí)，紅色毛癬菌生物被膜的形成量最優(yōu)。

真菌生物被膜的形成分為黏附期、形成期、成熟期[21]。Lin等[22]的研究表明，PB對(duì)紅色毛癬菌生物被膜形成期和成熟期有明顯抑制作用。由于真菌的黏附是形成生物被膜的第一步，若真菌不能牢固定植于宿主器官或組織表面，則容易被血液及其他體液沖刷而不能引起感染，就會(huì)影響生物被膜的形成[23]。本研究采用XTT法研究PB對(duì)紅色毛癬菌黏附過程的影響，結(jié)果表明，PB能顯著降低紅色毛癬菌的相對(duì)黏附率，抑制其黏附過程，從而降低其生物膜的生成量。

紅色毛癬菌初黏附時(shí)間的長短對(duì)其生物被膜形成的能力有至關(guān)重要的影響[24]。本研究通過XTT法檢測(cè)黏附不同時(shí)間后PB對(duì)紅色毛癬菌生物被膜形成的影響。結(jié)果顯示，在同樣藥物濃度下，黏附時(shí)間越長，藥物對(duì)其黏附抑制率較高，表明PB對(duì)紅色毛癬菌生物被膜形成的抑制作用與其初黏附的時(shí)間長短有關(guān)。Henry等[25]的研究表明，AMB可能通過與真菌細(xì)胞膜甾醇成分直接結(jié)合，使結(jié)合后的麥角甾醇合成通路的下游結(jié)合型甾醇含量增加，可直接誘導(dǎo)ERG mRNA表達(dá)水平的降低。本研究結(jié)果表明，與生長對(duì)照組比較，PB（320? ? ?g/mL）可顯著降低紅色毛癬菌生物被膜中ERG6、ERG11 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。這提示PB可能是通過與真菌細(xì)胞膜甾醇成分直接結(jié)合成復(fù)合物，降低甾醇成分分解，抑制麥角甾醇合成通路中相關(guān)靶酶基因的表達(dá)，進(jìn)而降低麥角甾醇的合成，破壞紅色毛癬菌生物被膜的平衡性，使胞內(nèi)物質(zhì)外流，從而起到抑菌及殺菌的作用。與生長對(duì)照組比較，在2 ?g/mL TBF的作用下，紅色毛癬菌生物被膜中ERG6、ERG11 mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高，提示其對(duì)麥角甾醇合成通路中ERG6、ERG11基因表達(dá)的影響與PB和AMB不同，這可能與Cardoza等[26]發(fā)現(xiàn)的ERG基因的表達(dá)與菌株耐藥有關(guān)。

綜上所述，PB能抑制紅色毛癬菌的黏附過程，減少菌絲的形成;該作用機(jī)制可能與抑制生物被膜中甾醇代謝相關(guān)基因ERG6、ERG11 mRNA的表達(dá)有關(guān)。但PB抑制紅色毛癬菌生物被膜的明確作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2020-09-08 修回日期：2020-12-31）

（編輯：唐曉蓮）