茯苓水提物UPLC指紋圖譜的建立及其鎮(zhèn)靜催眠作用的譜效關(guān)系研究

王天合 李慧君 張丹丹 羅心遙 夏和元 韓思婕 潘翔 萬明 葉曉川

摘 要 目的：建立茯苓水提物的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并考察其與鎮(zhèn)靜催眠作用的譜效關(guān)系。方法：將10批不同產(chǎn)地茯苓經(jīng)水提后得水提物。采用UPLC法測定該水提物，色譜柱為Waters HSS-C18，流動相為0.1%磷酸溶液-乙腈-甲醇（梯度洗脫），流速為0.4～0.2 mL/min，檢測波長為210、242 nm，柱溫為40 ℃，進樣量為2 μL。采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）建立10批茯苓水提物的指紋圖譜并進行共有峰指認。以小鼠的入睡率、入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間為單一藥效指標(biāo)，考察戊巴比妥鈉協(xié)同作用下10批不同產(chǎn)地茯苓水提物的鎮(zhèn)靜催眠作用;將單一藥效指標(biāo)和總藥效（由單一指標(biāo)經(jīng)層次分析法計算而得）進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后，采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法分析茯苓水提物指紋圖譜中各共有峰與單一藥效及總藥效的關(guān)聯(lián)度。結(jié)果：10批茯苓水提物共有24個共有峰，指認出11個成分，分別為16-羥基松苓新酸（6號峰）、16α-hydroxytrametendic acid（7號峰）、茯苓酸B（9號峰）、去氫土莫酸（10號峰）、茯苓酸A（12號峰）、豬苓酸C（15號峰）、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸（17號峰）、去氫茯苓酸（20號峰）、茯苓酸（21號峰）、松苓新酸（22號峰）、脫氫齒孔酸（24號峰）。經(jīng)灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，24個峰與睡眠持續(xù)時間的關(guān)聯(lián)度均大于0.6（0.611 5～0.811 8），與入睡潛伏期的關(guān)聯(lián)度除14、24、2號峰外，其余均大于0.6（0.605 9～0.790 4）;與入睡率的關(guān)聯(lián)度除23、19、17、5號峰外，其余均大于0.6（0.606 4～0.721 6）;與總藥效的關(guān)聯(lián)度除2、5、19號峰外，其余均大于0.6（0.619 0～0.781 2）;與總藥效關(guān)聯(lián)度排名前10位的色譜峰分別為15號峰（豬苓酸C）、16號峰、8號峰、11號峰、12號峰（茯苓酸A）、1號峰、7號峰（16α-hydroxytrametendic acid）、3號峰、9號峰（茯苓酸B）、20號峰（去氫茯苓酸）。結(jié)論：本研究建立了茯苓水提物的UPLC指紋圖譜，指認了11個共有峰成分;豬苓酸C等10種成分與鎮(zhèn)靜催眠總藥效關(guān)聯(lián)較大，初步揭示了茯苓鎮(zhèn)靜催眠作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 茯苓;超高效液相色譜;指紋圖譜;鎮(zhèn)靜;催眠;譜效關(guān)系;灰色關(guān)聯(lián)度分析;小鼠

中圖分類號 R284.1;R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）05-0564-07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE：To establish the UPLC fingerprint of Poria cocos aqueous extract， and to investigate its relationship with sedative and hypnotic effect. METHODS： Ten batches of P. cocos from different areas were extracted with water to obtain the aqueous extract. UPLC method was adopted. The determination was performed on Waters HSS-C18 column with mobile phase consisted of 0.1% phosphoric acid solution-acetonitrile-methanol （gradient elution） at the flow rate of 0.4-0.2 mL/min. The detection wavelengths were set at 210 and 242 nm. The column temperature was 40 ℃， and sample size was 2 μL. The fingerprints of 10 batches of P. cocos aqueous extracts were established by using the Similarity Evaluation System of TCM Fingerprint （2012A version）， and the common peaks were identified. The sedative and hypnotic effects of 10 batches of P. cocos aqueous extracts from different areas under the synergistic action of pentobarbital sodium were investigated by taking the sleeping rate， sleep latency and sleep duration of mice as the single efficacy index. After data transformation of single efficacy index and total efficacy （single indexes calculated by analytic hierarchy process）， grey correlation analysis was used to analyze the correlation between the common peaks in fingerprint of P. cocos aqueous extract and the single efficacy index and total efficacy. RESULTS： There were 24 common peaks in 10 batches of aqueous extract of P. cocos， and 11 components were identified， i.e. 16α-hydroxydehydrotrametenolic acid （peak 6）， 16α-hydroxytrametendic acid （peak 7）， poricoic acid B （peak 9）， dehydrotumulosic acid （peak 10）， poricoic acid A （peak 12）， polyporenic acid C （peak 15）， 3-O-acetyl-16α-hydroxydehydrotrametenolic acid （peak 17）， dehydropachymic acid （peak 20）， pachymic acid （peak 21），dehydrotrametenolic acid （peak 22）， dehydroeburicoic acid （peak 24）. Grey correlation analysis showed， the correlation between 24 peaks and sleep duration was greater than 0.6 （0.611 5- 0.811 8）; the correlation between 24 peaks and sleep latency was greater than 0.6 （0.605 9-0.790 4）， except for peaks 14， 24 and 2; the correlation of 24 peaks between sleeping rate was greater than 0.6 （0.606 4-0.721 6）， except for peaks 23， 19， 17 and 5; the correlation of 24 peaks between total efficacy was greater than 0.6 （0.619 0-0.781 2）， except for peaks 2， 5， 19. The top 10 chromatographic peaks related to the total efficacy were peak 15 （polyporenic acid C）， peak 16， peak 8， peak 11， peak 12 （poricoic acid A）， peak 1， peak 7 （16α-hydroxytrametendicacid）， peak 3， peak 9 （poricoic acid B） and peak 20 （dehydropachymic acid）. CONCLUSIONS：UPLC fingerprint of P. cocos aqueous extract was established and 11 components were identified. Ten components such as polyporus acid C are closely related to the total efficacy of sedation and hypnosis， which preliminarily reveal the material basis of the sedative and hypnotic effect of P. cocos.

KEYWORDS? ?Poria cocos; UPLC; Fingerprint; Sedation; Hypnosis; Spectrum-effect relationship; Grey correlation analysis; Mice

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，其藥用歷史悠久，始載于《五十二病方》，也收載于歷代版本的《中國藥典》中;其味甘、淡、平，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中歸為上品，屬藥食同源中藥，久服可安魂養(yǎng)神，為九大仙品藥草之一，具有利水滲濕、健脾、寧心的功效[1]。茯苓在臨床上可單用或與其他中藥組成復(fù)方，常用于治療水腫、痰飲、脾虛、便溏泄瀉、心神不安、驚悸失眠[2]。茯苓主要含有多糖類、三萜類、蛋白質(zhì)類、甾體類等化學(xué)成分[1]，已有文獻報道茯苓的多糖部位和乙酸乙酯部位均具有良好的鎮(zhèn)靜催眠作用[3]，但上述部位的成分復(fù)雜，具體有哪些成分具有鎮(zhèn)靜催眠活性尚不清楚。

中藥譜效關(guān)系研究是將中藥化學(xué)成分譜與中藥藥效活性有機結(jié)合，采用回歸分析、相關(guān)性分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、主成分分析、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、聚類分析等多種數(shù)學(xué)分析模型，可更全面、多角度地對中藥進行評價，常用于中藥質(zhì)量評價、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、質(zhì)量標(biāo)志物篩選、中藥組方配伍、中藥有效部位篩選以及提取純化工藝優(yōu)化等方面[4-5]?；诖耍狙芯肯葘?0批不同產(chǎn)地茯苓以水煎煮制得水提物，并建立其超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜;同時，以閾上劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用下的小鼠入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間，以及閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用下的小鼠入睡率為鎮(zhèn)靜催眠指標(biāo)，并結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度法進行譜效相關(guān)性分析，以期初步揭示茯苓鎮(zhèn)靜催眠的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為完善茯苓的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：Agilent1290型系列四元泵UPLC儀（美國Agilent公司）、Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）、BT25S型十萬分之一分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、AL204型萬分之一分析天平（瑞士Metter Toledo公司）;SCIENTZ-10ND型真空冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、DZF-6050型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司）、KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、JSB6-02型電子計重秤（上海浦春計量儀器有限公司）、RE-6000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、PC3830A型三排A型秒表計時器（深圳市惠波工貿(mào)有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的10批不同產(chǎn)地茯苓藥材由本課題組前期在茯苓種植區(qū)收集，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院葉曉川教授鑒定均為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos （Schw.）Wolf的菌核（10批茯苓藥材來源信息見表1）。其它藥品與試劑有：16-羥基松苓新酸、16α-hydroxytrametenolic acid、茯苓酸B、去氫土莫酸、茯苓酸A、豬苓酸C、3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸、去氫茯苓酸、茯苓酸、脫氫齒孔酸對照品（成都普思生物科技股份有限公司，批號分別為PS010073、PS011188、PS010102、PS19092902、PS010109、PS011211、PS010088、PS010110、PS010086、PS010087），松苓新酸對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號Y08J7H8750），氯化鈉注射液（武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號1901070801，規(guī)格100 mL ∶ 0.9 g），戊巴比妥鈉（天津天力化學(xué)試劑有限公司，批號20130307），艾司唑侖片（華中藥業(yè)股份有限公司，批號20190303，規(guī)格1 mg/片），安神膠囊（長春海外制藥集團有限公司，批號20190401，規(guī)格0.25 g/粒）;甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，由遼寧省實驗動物資源中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（遼）2015-0001。小鼠飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，環(huán)境溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～60%，每日光照與黑暗時間各12 h。本文涉及的動物實驗經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為HUCMS201910010。

2 方法與結(jié)果

2.1 茯苓水提物UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 茯苓水提物的制備 10批不同產(chǎn)地茯苓藥材打粉，過三號篩后，稱取藥材粉末500 g，置于10 L圓底燒瓶中，加入10倍量（按mL/g計，下同）水浸泡過夜，加熱回流2 h，用300目濾布趁熱濾過，收集濾液;殘渣繼續(xù)加10倍量水回流提取1 h，用300目濾布趁熱濾過;合并2次濾液，于100 ℃水浴條件下濃縮為浸膏，再于真空條件下冷凍干燥，粉碎，即得茯苓水提物粉末。按茯苓生藥量計，S1～S10號茯苓水提物的得率分別為2.77%、3.11%、6.43%、4.33%、3.16%、3.77%、3.04%、3.45%、4.25%、3.64%。

2.1.2 色譜條件 色譜柱為Waters HSS-C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動相為0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）-甲醇（C），梯度洗脫（0～4 min，42%A→12%A，55%B→85%B，流速為0.4～0.2 mL/min;4～8 min，12%A→? ?0%A，85%B→97%B，流速為0.2 mL/min;8～10 min，97%B→100%B，3%C→0%C，流速為0.2～0.4 mL/min;10～15 min，100%B，流速為0.4 mL/min）;進樣量為2? ? μL;柱溫為40 ℃;檢測波長為210、242 nm[采用二極管陣列檢測器（DAD）]。

2.1.3 供試品溶液制備 取“2.1.1”項下10批不同產(chǎn)地茯苓水提物粉末各約1 g，精密稱定，分別置于50 mL錐形瓶中，加入甲醇20 mL，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）提取60 min，放冷后加甲醇補足丟失質(zhì)量;以3 500 r/min離心15 min，取上清液5 mL于試管中，置于真空干燥箱中于60 ℃揮干溶劑，再加入1 mL甲醇復(fù)溶，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 對照品溶液制備 分別精密稱取16-羥基松苓新酸1.14 mg、16α-hydroxytrametenolic acid 1.08 mg、茯苓酸B 1.32 mg、去氫土莫酸1.02 mg、茯苓酸A 1.01 mg、豬苓酸C 0.49 mg、3-O-乙酰基-16α-羥基松苓新酸1.30 mg、去氫茯苓酸1.92 mg、茯苓酸2.18 mg、松苓新酸0.48 mg、脫氫齒孔酸0.88 mg分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得單一對照品溶液。精密吸取各對照品溶液2 mL于同一25 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，以0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得混合對照品溶液。

2.1.5 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（S7號樣品水提物）適量，按“2.1.2”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄色譜圖，以20號峰（因其出峰時間適中、峰形良好，下同）為參照，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.6%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.2%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取“2.1.1”項下S7號樣品水提物粉末6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以20號峰為參照，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.4%（n=6），相對峰面積的RSD均小于3.0%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液（S7號樣品水提物），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.1.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以20號峰為參照，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.0%（n=6），相對峰面積的RSD均小于2.5%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 10批茯苓水提物樣品UPLC指紋圖譜的生成 取“2.1.1”項下S1～S10號樣品水提物粉末，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.2”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版），以S7號樣品水提物圖譜為參照（因其色譜峰峰形較明顯，峰信號強度適中），設(shè)置時間窗寬度為0.1 s，采用全譜峰匹配法[6]進行色譜峰匹配，生成10批茯苓水提物的UPLC疊加指紋圖譜，詳見圖1;采用中位數(shù)法[6]生成對照圖譜（R），詳見圖2。

2.1.9 共有峰指認 取“2.1.4”項下混合對照品溶液按“2.1.2”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，詳見圖3。由圖1和圖2可見，10批茯苓水提物共含24個共有峰;通過與圖3比對，指認其中的6號峰為16-羥基松苓新酸，7號峰為16α-hydroxytrametendic acid，9號峰為茯苓酸B，10號峰為去氫土莫酸，12號峰為茯苓酸A，15號峰為豬苓酸C，17號峰為3-O-乙?；?16α-羥基松苓新酸，20號峰為去氫茯苓酸，21號峰為茯苓酸，22號峰為松苓新酸，24號峰為脫氫齒孔酸。

2.1.10 相似度評價 將10批不同產(chǎn)地茯苓水提物的指紋圖譜導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012A版）進行相似度評價。結(jié)果，242 nm波長下10批茯苓水提物的相似度在0.304～0.988范圍內(nèi);210 nm波長下10批茯苓水提物的相似度在0.264～0.991范圍內(nèi)，詳見表2、表3。

2.2 戊巴比妥鈉協(xié)同作用下茯苓水提物的鎮(zhèn)靜催眠作用考察

茯苓藥性緩和，對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠力緩，故本研究參考文獻[7-9]方法，考察閾上劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用下茯苓水提物對小鼠的入睡潛伏期（小鼠翻正反射消失到翻正反射出現(xiàn)的時間）和睡眠持續(xù)時間（注射戊巴比妥鈉開始到小鼠翻正反射消失的時間）的影響，以及閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用下茯苓水提物對小鼠的入睡率（小鼠翻正反射消失達1 min以上即為入睡）的影響，以此來評價其鎮(zhèn)靜催眠的效果。

2.2.1 閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用下茯苓水提物的鎮(zhèn)靜催眠作用 將130只小鼠隨機分為空白組（水）、艾司唑侖組（陽性西藥對照，0.26 mg/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得）、安神膠囊組（陽性中藥對照，0.315? ? g/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得）和茯苓S1～S10水提物組[27.3 g/kg（以生藥量計），劑量根據(jù)文獻[3]而得]，每組10只。各藥物用水制成灌胃混懸液。各組小鼠每天灌胃1次，灌胃體積為20 mL/kg，連續(xù)7天。末次給藥30 min后，各組小鼠分別腹腔注射閾下劑量的戊巴比妥鈉（28.5 mg/kg，參考文獻[7-9]和預(yù)實驗結(jié)果），觀察各組小鼠入睡的數(shù)量，計算入睡率（入睡率=小鼠入睡只數(shù)/小鼠總數(shù)×100%）。采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表4。

由表4可知，與空白組比較，艾司唑侖組和茯苓S4、S5、S8水提物組小鼠入睡率顯著升高（P<0.05或P<0.01），表明云南大理、河南商城、湖北羅田產(chǎn)地的茯苓水提物促進小鼠入睡的作用較強。

2.2.2 閾上劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用下茯苓水提物的鎮(zhèn)靜催眠作用 將130只小鼠按“2.2.1”項下方法分組及給藥。末次給藥30 min后，各組小鼠分別腹腔注射閾上劑量的戊巴比妥鈉（36 mg/kg，參考文獻[7-9]和預(yù)實驗結(jié)果），記錄小鼠的入睡潛伏期及睡眠持續(xù)時間。采用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料均以x±s表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表5。

由表5可知，與空白組比較，艾司唑侖組、安神膠囊組和茯苓S1～S7、S9～S10水提物組小鼠入睡潛伏期均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;艾司唑侖組、安神膠囊組和茯苓S1～S10水提物組睡眠持續(xù)時間均顯著升高（P<0.05或P<0.01），表明大部分產(chǎn)地的茯苓水提物對小鼠的入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間均具有較好的改善作用。

2.3 譜效關(guān)系分析

2.3.1 單一藥效和總藥效的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化 參考文獻[10]方法，將“2.2”項下小鼠入睡率、入睡潛伏期、睡眠持續(xù)時間采用升高率或降低率進行藥效數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化，其中，升高率或降低率計算公式為Y′（k）=[Y0（k）-Y 0（k）]/Y 0（k），k為10批茯苓水提物的編號（k=1，2，3……10），Y0表示給藥組各單一藥效的原始數(shù)據(jù)，Y 0表示空白組各單一藥效的原始數(shù)據(jù);采用層次分析法[10]計算小鼠入睡率、入睡潛伏期和睡眠持續(xù)時間對總藥效的權(quán)重系數(shù)，并計算鎮(zhèn)靜催眠總藥效（總藥效=入睡率權(quán)重系數(shù)×入睡率升高率+入睡潛伏期權(quán)重系數(shù)×入睡潛伏期降低率+睡眠持續(xù)時間權(quán)重系數(shù)×睡眠持續(xù)時間升高率）。結(jié)果，入睡率、入睡潛伏期、睡眠持續(xù)時間的權(quán)重系數(shù)分別為0.142、0.429、0.429，鎮(zhèn)靜催眠單一藥效及總藥效的轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)詳見表6。

2.3.2 數(shù)據(jù)處理 由于茯苓水提物的UPLC指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)化后的藥效數(shù)據(jù)的量綱不一致，因此筆者參考文獻[11]方法，將轉(zhuǎn)化后的藥效數(shù)據(jù)（入睡率升高率、入睡潛伏期降低率、睡眠持續(xù)時間升高率、總藥效）與10批茯苓水提物共有峰數(shù)據(jù)采用均值法進行數(shù)據(jù)歸一化處理。將歸一化后的藥效數(shù)據(jù)作為參考序列[記為Y（k），將共有峰數(shù)據(jù)作為比較序列，記為Xi（k），計算參考序列與比較序列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)[Ai（k）][12-13]，計算公式為Ai（k）=[Δi（k）min+ρ×Δi（k）max]/[Δi（k）+ρ×Δi（k）max]，其中ρ表示分辨系數(shù)，通常取0.5;Δi（k）=|Y（k）-Xi（k）|，i表示茯苓水提物UPLC指紋圖譜中的共有峰編號（i=1，2，3……24）。

2.3.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析 基于“2.3.2”項下數(shù)據(jù)處理結(jié)果，分別計算各參考序列與比較序列之間灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)Ai（k）的平均值，即為灰色關(guān)聯(lián)度。將關(guān)聯(lián)度按大小排序后的關(guān)聯(lián)序，可直觀反映茯苓水提物UPLC指紋圖譜中各共有峰對其鎮(zhèn)靜催眠作用的貢獻大小，揭示其主要藥效物質(zhì)：當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.6時，表示該色譜峰代表的化學(xué)成分與藥效指標(biāo)有關(guān)聯(lián)性;當(dāng)關(guān)聯(lián)度大于0.8時，表示該色譜峰代表的化學(xué)成分與藥效指標(biāo)有較大關(guān)聯(lián)性[10]。結(jié)果顯示，茯苓水提物UPLC指紋圖譜中24個色譜峰與睡眠持續(xù)時間的關(guān)聯(lián)度均大于0.6（0.611 5～0.811 8）;與入睡潛伏期的關(guān)聯(lián)度，除14、24、2號峰外，其余色譜峰均大于0.6（0.605 9～0.790 4）;與入睡率的關(guān)聯(lián)度，除23、19、17、5號峰外，其余色譜峰均大于0.6（0.606 4～0.721 6）;與總藥效的關(guān)聯(lián)度，除2、5、19號峰外，其余色譜峰均大于0.6（0.619 0～0.781 2）。這說明茯苓水提物對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠作用是由多組分共同作用的結(jié)果。其中，與總藥效關(guān)聯(lián)度較大的前10位峰分別為15號峰（豬苓酸C）、16號峰、8號峰、11號峰、12號峰（茯苓酸A）、1號峰、7號峰（16α-hydroxytrametendic acid）、3號峰、9號峰（茯苓酸B）、20號峰（去氫茯苓酸），詳見表7。

3 討論

本研究基于茯苓的傳統(tǒng)用法，將茯苓進行煎煮后獲取其水提物，并建立其水提物的UPLC指紋圖譜，以期研究茯苓水提物鎮(zhèn)靜催眠作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。筆者在建立10批不同產(chǎn)地茯苓水提物的UPLC指紋圖譜時，對S7號樣品水提物（湖北英山）進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)其色譜圖中大多數(shù)色譜峰在242 nm有最大吸收，少部分色譜峰在210 nm有最大吸收，故本試驗于242、210 nm雙波長下進行掃描并建立UPLC指紋圖譜。此外，在建立UPLC條件時發(fā)現(xiàn)，茯苓水提物的9、10號峰不易分離，后采取梯度流速的方法進行改善，可達到有效分離的目的。另由于茯苓藥材的產(chǎn)地差異和各色譜峰成分的含量高低差異，使得在進行10批不同產(chǎn)地茯苓水提物的制備時，部分色譜峰成分的含量發(fā)生變化，或某些小峰成分丟失，從而造成不同產(chǎn)地茯苓水提物的UPLC指紋圖譜的相似度偏低;也正是由于這些變化造成了這10批不同產(chǎn)地茯苓水提物鎮(zhèn)靜催眠的藥效差異，因此更有利于進行后續(xù)的譜效相關(guān)分析。

茯苓藥用歷史悠久，常作為大宗中成藥原料用于臨床，其用于治療精神類疾病或?qū)幮陌采駮r劑量宜大，臨床常用劑量為60 g/d，有時用量為30～100 g/d[14-16]。本課題組在前期研究基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床寧心安神常用劑量，確定用于小鼠鎮(zhèn)靜催眠的生藥劑量為27.3 g/kg（約為臨床等效劑量的3倍）。

興奮性神經(jīng)遞質(zhì)及抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)可引起失眠、焦慮、抑郁等諸多精神及心理疾病;戊巴比妥鈉是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制劑，可通過抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸、乙酰膽堿、去甲腎上腺素的釋放，發(fā)揮中樞抑制作用[17]。因此，本研究在閾上/閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同作用下考察茯苓水提物的鎮(zhèn)靜催眠作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在戊巴比妥鈉協(xié)同作用下，茯苓水提物表現(xiàn)出一定的鎮(zhèn)靜催眠作用。

通過灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，茯苓水提物24個共有峰與小鼠睡眠持續(xù)時間的關(guān)聯(lián)度均大于0.6，其中8、16號峰的關(guān)聯(lián)度大于0.8;而只有21個共有峰與小鼠入睡潛伏期的關(guān)聯(lián)度大于0.6、20個共有峰與入睡率的關(guān)聯(lián)度大于0.6，表明茯苓水提物中有更多的成分與睡眠持續(xù)時間相關(guān)聯(lián)，且從藥效結(jié)果（表4、表5）也可以看出茯苓水提物對睡眠持續(xù)時間的影響強于對入睡潛伏期和入睡率的影響。茯苓水提物各共有峰與總藥效的關(guān)聯(lián)度，除2、5、19號峰外，其余各峰的關(guān)聯(lián)度均在0.6～0.8之間（與鎮(zhèn)靜催眠總藥效有關(guān)聯(lián)），說明茯苓水提物發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用是其各色譜峰代表物質(zhì)共同作用的結(jié)果。其中，與總藥效關(guān)聯(lián)度較大的前10位共有峰分別為15號峰（豬苓酸C）、16號峰、8號峰、11號峰、12號峰（茯苓酸A）、1號峰、7號峰（16α-hydroxytrametendic acid）、3號峰、9號峰（茯苓酸B）、20號峰（去氫茯苓酸）。

綜上所述，本研究建立了茯苓水提物的UPLC指紋圖譜，指認了11個共有峰成分;豬苓酸C，16號峰、8號峰、11號峰代表的成分，茯苓酸A，1號峰代表的成分， 16α-hydroxytrametendic acid，3號峰代表的成分，茯苓酸B，去氫茯苓酸等10種成分與鎮(zhèn)靜催眠總藥效關(guān)聯(lián)較大，茯苓水提物的鎮(zhèn)靜催眠作用是由多組分共同作用的結(jié)果。本研究初步揭示了茯苓鎮(zhèn)靜催眠作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可為茯苓質(zhì)量標(biāo)志物篩選以及茯苓飲片的質(zhì)量控制提供參考。

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（收稿日期：2020-12-10 修回日期：2020-12-30）

（編輯：唐曉蓮）