基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究黃連解毒湯調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制

李弼仁 莫雨晴 黃英杰 朱泳 羅川晉

摘 要 目的：研究黃連解毒湯調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制，以期挖掘其抗炎機(jī)制。方法：通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫（TCMSP）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出黃連解毒湯的活性成分及預(yù)測靶點;通過 GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫獲取巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)靶點，利用Cytoscape 3.6.0軟件繪制黃連解毒湯活性成分-巨噬細(xì)胞極化靶點網(wǎng)絡(luò)圖;通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)并提取核心靶點;通過Cytoscape 3.6.0軟件及DAVID網(wǎng)站進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，將小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞分為空白對照組、模型組、辛伐他汀組（10 μmol/L）和黃連解毒湯含藥血清組（將黃連解毒湯以10 g/kg灌胃大鼠并取血制得），除空白對照組和模型組加入培養(yǎng)基外，其余各組均加入相應(yīng)藥液或含藥血清100 μL，培養(yǎng)2 h;然后除空白對照組外，其余各組均加入脂多糖溶液（100 μg/L）培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)炎癥。采用Western blot法檢測細(xì)胞中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的表達(dá)水平，采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法檢測細(xì)胞中M1型極化因子[白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、一氧化氮合酶（iNOS）]和M2型極化因子[IL-10、缺氧誘導(dǎo)分化因子1（Fizz1）]mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：共篩選到黃連解毒湯的50種活性成分（如刺槐黃素、漢黃芩素、槲皮素、β-谷甾醇等），其可通過失巢凋亡負(fù)調(diào)節(jié)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化等12個GO條目，以及雌激素信號通路、膀胱癌通路、AMPK信號通路等20條KEGG通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化。細(xì)胞試驗結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞中AMPK蛋白以及Fizz1、IL-10 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01），IL-1β、iNOS mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清組和辛伐他汀組細(xì)胞中AMPK蛋白以及Fizz1、IL-10 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01），IL-1β、iNOS mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：黃連解毒湯可通過多個靶點、多個通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化;其可通過AMPK信號通路上調(diào)M2型極化因子的表達(dá)、下調(diào)M1型極化因子的表達(dá)，調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，發(fā)揮抗炎作用。

關(guān)鍵詞 黃連解毒湯;巨噬細(xì)胞極化;AMPK信號通路;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);抗炎作用

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）05-0552-07

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the mechanism of Huanglian jiedu decoction （HJD） regulating macrophage polarization in order to explore its anti-inflammatory mechanism. METHODS： The active components and predicted targets of HJD were screened through TCMSP and Swiss Target Prediction database; the related targets of macrophage polarization were obtained by GeneCards and OMIM database， and the network diagram of active ingredient-macrophage polarization target of HJD was drawn by using Cytoscape 3.6.0 software;protein interaction network was constructed by String database and core targets were extracted. Gene ontology （GO） enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis were carried out by using Cytoscape 3.6.0 software and DAVID website. Combined with the results of network pharmacology analysis， RAW264.7 macrophage cells were divided into blank control group， model group， simvastatin group （10? ?μmol/L） and serum containing HJD group （obtained from the blood after the rats were given HJD at the dose of 10 g/kg）. Except the blank control group and model group were added culture medium， the other groups were added with 100 μL of relevant drug solution or serum containing drug. After 2 h of culture， except for the blank control group， LPS solution （100 μg/L） was added to the other groups for 24 h to induce inflammation. Western blot assay was used to detect the expression of AMPK. mRNA expression of M1 type polarization factor （IL-1 β， iNOS） and M2 type polarization factor （IL-10， Fizz1） were detected by RT-PCR. RESULTS： A total of 50 active components of HJD （such as acacetin， wogonin， quercetin， β-sitosterol） were screened， which could regulate macrophage polarization through 12 GO items （such as anoikis， astrocyte activation）， and 20 KEGG pathways （such as estrogen signaling pathway， bladder cancer pathway， AMPK signaling pathway）. The results of cell test showed that compared with blank control group， the expression of AMPK protein， Fizz1 and IL-10 mRNA in model group were significantly decreased （P<0.01）， while the expression of IL-1β and iNOS mRNA were significantly increased （P<0.01）; compared with model group， the expression of AMPK protein， Fizz1 and IL-10 mRNA in serum containing HJD group and simvastatin group were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， while the expression of IL-1β and iNOS mRNA were significantly decreased （P<0.01）. CONCLUSIONS： HJD can regulate macrophage polarization through multiple targets and pathways; it can up regulate the expression of M2-type polarization factors and down-regulate the expression of M1-type polarization factors through AMPK signaling pathway， regulate macrophage polarization and play an anti-inflammatory role.

KEYWORDS? ?Huanglian jiedu decoction; Macrophage polarization; AMPK signaling pathway; Network pharmacology; Anti-inflammatory effect

作為單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)晚期分化細(xì)胞，巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境中的功能特性不同，故能在體內(nèi)外各種因素誘導(dǎo)下出現(xiàn)不同表型、形態(tài)及功能分化，即巨噬細(xì)胞的極化[1]。根據(jù)其表型和分泌的細(xì)胞因子，巨噬細(xì)胞可分為經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞（M1型）及替代活化型巨噬細(xì)胞（M2型）兩大類，其中M1型巨噬細(xì)胞在疾病的發(fā)展中分泌白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、一氧化氮合酶（iNOS）等多種促炎介質(zhì)，而M2型巨噬細(xì)胞則主要分泌IL-10、缺氧誘導(dǎo)分化因子1（Fizz1）等抗炎細(xì)胞因子，兩者極化功能幾乎相互拮抗[2-4]。研究表明，巨噬細(xì)胞極化在感染、代謝、免疫及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中均發(fā)揮著重要作用[5]。

黃連解毒湯來源于《外臺秘要》，由黃連、黃芩、黃柏、梔子組成，具有清熱、解毒、瀉火的功效，且具有明顯的抗炎作用[6]。現(xiàn)有研究表明，黃連解毒湯能抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的炎癥因子IL-1β的表達(dá)，并上調(diào)IL-10的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型轉(zhuǎn)化[7-9]，但具體作用機(jī)制尚未明確?；诖?，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及相關(guān)細(xì)胞試驗，探討黃連解毒湯對巨噬細(xì)胞M1、M2型極化的影響及可能機(jī)制，以挖掘其抗炎機(jī)制，為指導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)疾病的臨床治療提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有：PIDRed 96型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（德國Biometra公司）、AX-Ⅱ型凝膠成像儀（上海恒勤儀器設(shè)備有限公司）、JS-Power300型電泳儀（上海迪奧生物科技有限公司）、DHP-9032B型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 主要藥品和試劑

本研究所用主要藥品與試劑有：黃連、黃芩、黃柏、梔子藥材（廣東省康美藥業(yè)有限公司），辛伐他汀片（荷蘭Merck Sharp & Dohme B.V.公司，批號B14221902065，規(guī)格20 mg），DMEM 高糖培養(yǎng)基、RIPA蛋白裂解液（美國Hyclone公司，批號分別為428025132、417014156），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號17060403），磷酸鹽緩沖液（PBS）、脂多糖（LPS）、RPMI 1640培養(yǎng)基、TRIzol試劑、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE）試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（美國PeproTech公司，批號分別為011779、031837、022848、021937、011645、224899、235768），山羊抗小鼠AMPK單克隆抗體、HPR山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、鼠源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號分別為26053441、23148673、23264128），實時熒光定量PCR試劑盒（美國AB-clonal公司，批號A12043），PCR引物（廣州晶欣生物科技有限公司）;其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為純凈水。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級6周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自海南省藥物安全性評價研究中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（瓊）2020-0007，動物使用許可證號為SYXK（瓊）2017-0013。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22～24 ℃，12 h晝夜光照循環(huán)。本研究的動物實驗獲得海南省中醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 細(xì)胞

本研究所用細(xì)胞為小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心提供。

2 方法

2.1 黃連解毒湯中活性成分的篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分別以“黃連”“黃芩”“黃柏”“梔子”為檢索詞，以口服生物利用度（OB）≥30%[10]、類藥性（DL）≥0.18[11]為條件對活性成分進(jìn)行篩選，并保存活性成分的2D結(jié)構(gòu)文件，再通過TCMSP平臺找出各活性成分對應(yīng)的“Smile”號，保存為“SDF”格式文件（本文選擇有對應(yīng)“Smile”號的活性成分進(jìn)行后續(xù)研究）。

2.2 黃連解毒湯中活性成分相關(guān)靶點的預(yù)測

將“2.1”項下的“SDF”格式文件上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）中，基于反向分子對接原理[12]，進(jìn)行靶點預(yù)測，獲取黃連解毒湯活性成分的預(yù)測靶點。

2.3 巨噬細(xì)胞極化相關(guān)靶點的獲取及黃連解毒湯活性成分-巨噬細(xì)胞極化靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將“Macrophage polarization”作為檢索詞，通過Gene Cards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）數(shù)據(jù)庫獲取巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)靶點;利用Microsoft Excel 2019軟件將黃連解毒湯中活性成分的預(yù)測靶點與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)靶點進(jìn)行映射，獲取黃連解毒湯作用于巨噬細(xì)胞極化的靶點;然后將黃連解毒湯的活性成分和上述靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件中，構(gòu)建黃連解毒湯活性成分-巨噬細(xì)胞極化靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 PPI網(wǎng)格構(gòu)建和核心靶點篩選

將黃連解毒湯中活性成分的預(yù)測靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），設(shè)定物種為“Homo sapiens”，獲取所有蛋白-蛋白相關(guān)作用（PPI）關(guān)系，再導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件中，生成背景網(wǎng)絡(luò)。在背景數(shù)據(jù)庫選取“2.3”項下映射得到的黃連解毒湯作用于巨噬細(xì)胞極化的靶點，并找到與其直接相連的節(jié)點，生成黃連解毒湯活性成分調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。然后通過Cytoscape 3.6.0軟件“Tools”模塊中的“Network analyzer- network analysis-analyze network”選項進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，獲取相關(guān)拓?fù)鋮?shù)，以節(jié)點連接度（Degree）的2倍中位數(shù)以及節(jié)點介度（Betweenness）和節(jié)點緊密度（Closeness）的中位數(shù)作為篩選依據(jù)[13]，提取出核心靶點。

2.5 GO富集分析與KEGG通路分析

利用Cytoscape 3.6.0軟件中的“ClueGO”插件，選擇“Biological Process（生物進(jìn)程）”，對“2.4”項下所得的核心靶點進(jìn)行基因本體（GO）富集分析，以P<0.05篩選顯著富集的GO。通過DAVID網(wǎng)站（http：//david.ncifcrf.gov/）對核心靶點進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析，以P<0.01篩選顯著富集的KEGG通路，并按照核心靶點相關(guān)的基因數(shù)進(jìn)行排序，結(jié)合文獻(xiàn)檢索的方法，篩選出黃連解毒湯活性成分調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的可能通路和該通路上的相關(guān)靶點;再結(jié)合黃連解毒湯的活性成分，構(gòu)建“黃連解毒湯活性成分-巨噬細(xì)胞極化靶點-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖，并選取基因數(shù)排名前20位的通路，使用在線繪圖OmicShare工具（http：//www.omicshare.com/tools/）繪制通路氣泡圖。

2.6 細(xì)胞試驗

基于KEGG通路分析結(jié)果，筆者選擇腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路中的AMPK蛋白進(jìn)行細(xì)胞試驗，探討黃連解毒湯是否通過作用于該通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化;同時，根據(jù)M1型巨噬細(xì)胞的極化因子有IL-1β、iNOS，M2型巨噬細(xì)胞極化因子有IL-10、Fizz1，故亦選擇上述極化相關(guān)因子進(jìn)行mRNA表達(dá)的檢測，以探討黃連解毒湯的抗炎作用機(jī)制研究。

2.6.1 黃連解毒湯的制備 取黃連9 g、黃芩6 g、黃柏6 g、梔子9 g，加水200 mL煎煮45 min，過濾，取續(xù)濾液加熱濃縮至1 g/mL（以生藥量計，下同），于4 ℃保存。藥液于大鼠灌胃前0.5 h加熱，備用。

2.6.2 黃連解毒湯含藥血清的制備 取10只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，灌胃給予黃連解毒湯（10 g/kg，根據(jù)臨床等效劑量換算而得），灌胃體積為1.5 mL，每天灌胃1次，連續(xù)1周。末次給藥2 h后，于大鼠股動脈取血，室溫靜置4 h后，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，即得黃連解毒湯含藥血清，于-80 ℃保存，備用。

2.6.3 分組、造模及給藥 將RAW264.7細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下（下同）培養(yǎng)48 h后，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀中加入PBS和RPMI 1640培養(yǎng)基適量，制成密度為1×106 個/mL的細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液按100 μL/孔接種于96孔板中，并隨機(jī)分為空白對照組、模型組、辛伐他汀組（10 μmol/L，劑量設(shè)置參考文獻(xiàn)[14-15]）和黃連解毒湯含藥血清組，除空白對照組和模型組不加藥液外（以等體積培養(yǎng)基代替），其余均加入相應(yīng)藥液或含藥血清100 μL，于37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養(yǎng)2 h;然后除空白對照組外，其余各組均加入100? ?μg/L的LPS溶液（臨用時用RPMI 1640培養(yǎng)基溶解配制），培養(yǎng)24 h以誘導(dǎo)炎癥。每組設(shè)置6個復(fù)孔。

2.6.4 細(xì)胞中AMPK蛋白表達(dá)水平的檢測 采用Wes- tern blot法進(jìn)行檢測。取“2.6.3”項下各組給藥、建模后的細(xì)胞適量，加入蛋白裂解液裂解0.5 h后，于4 ℃條件下以12 000 r/min離心10 min，取上清液，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白變性后，取50 μg行SDS- PAGE電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;加入AMPK抗體（稀釋度為1 ∶ 1 000）、GAPDH抗體（稀釋度為1 ∶ 500）孵育過夜;以PBST溶液清洗3次，加入二抗（稀釋度為1 ∶ 200），于37 ℃條件下孵育1 h;以PBST溶液清洗3次，經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色后，置于凝膠成像儀上成像。采用Image J v 1.5.1軟件分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度值比值表示AMPK蛋白的表達(dá)水平。上述試驗重復(fù)6次。

2.6.5 細(xì)胞中極化相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平檢測 采用實時熒光定量PCR法進(jìn)行檢測。取“2.6.3”項下各組給藥、建模后的細(xì)胞適量，根據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA;再以cDNA為模板，進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)（引物序列及產(chǎn)物長度見表1）。PCR反應(yīng)體系（20 μL）包括：無核酸酶水7.2 μL，上下游引物各0.4 μL，染料10 μL，cDNA模板2 μL。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，55 ℃退火10 s，40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，按2-ΔΔCt法[15]計算目的基因mRNA的表達(dá)水平。上述試驗重復(fù)6次。

2.6.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，采用LSD-t檢驗進(jìn)行組間兩兩比較;若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗進(jìn)行組間比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃連解毒湯中活性成分的篩選結(jié)果

本研究共篩選得到黃連解毒湯活性成分共50個，其活性成分的基本信息見表2。

3.2 黃連解毒湯活性成分-巨噬細(xì)胞極化靶點網(wǎng)絡(luò)篩選結(jié)果

在SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫中共篩選得具有“Smile”號的活性成分共50個;依據(jù)活性成分的2D結(jié)構(gòu)進(jìn)行靶點預(yù)測，共篩選出700個預(yù)測靶點;經(jīng)映射后，共篩選出黃連解毒湯可能調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)靶點532個。在Cytoscape 3.6.0軟件中導(dǎo)入黃連解毒湯的活性成分與巨噬細(xì)胞極化相關(guān)的靶點，構(gòu)建出黃連解毒湯活性成分-巨噬細(xì)胞極化靶點網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖1。

3.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和核心靶點篩選結(jié)果

將黃連解毒湯可能調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的532個相關(guān)靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，形成PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見圖2。經(jīng)篩選后，共得核心靶點12個，根據(jù)Degree值從小到大排序為AMPK、EGFR、PTGS2、APP、AR、MMP9、PIK3R、MCL1、ACHE、MPO、MAPT、NTRK2。

3.4 GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果

通過GO富集分析，共篩選得到GO條目12個，主要涉及失巢凋亡負(fù)調(diào)節(jié)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化等，詳見圖3。通過KEGG通路分析，共篩選得到KEGG通路20條，主要涉及雌激素信號通路、膀胱癌通路、AMPK信號通路等，詳見圖4。

3.5 細(xì)胞試驗結(jié)果

3.5.1 黃連解毒湯對細(xì)胞中AMPK蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組細(xì)胞中AMPK蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清組和辛伐他汀組細(xì)胞中AMPK蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），詳見圖5、表3。

3.5.2 黃連解毒湯對極化相關(guān)因子的mRNA表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型組細(xì)胞中IL-1β、iNOS mRNA的表達(dá)水平均顯著升高，F(xiàn)izz1、IL-10 mRNA的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;與模型組比較，黃連解毒湯含藥血清組和辛伐他汀組細(xì)胞的IL-1β、iNOS mRNA的表達(dá)水平均顯著降低，F(xiàn)izz1、IL-10 mRNA的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01），詳見表4。

4 討論

本研究共篩選得到黃連解毒湯活性成分50種（包括刺槐黃素、漢黃芩素、槲皮素、β-谷甾醇等），核心靶點12個（包括AMPK、EGFR、PTGS2等）;經(jīng)GO富集分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯調(diào)控巨噬細(xì)胞極化主要涉及失巢凋亡負(fù)調(diào)節(jié)、星形膠質(zhì)細(xì)胞活化等12個GO條目，主要涉及雌激素信號通路、膀胱癌通路、AMPK信號通路等。其中，AMPK信號通路上核心靶點AMPK是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器，可保持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡[16];AMPK的活化能促使巨噬細(xì)胞從M1型極化為M2型[17-19]。另外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素也能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化[20]，與本研究通路分析結(jié)果一致。

iNOS作為M1型巨噬細(xì)胞主要的生物標(biāo)志物，能夠生成大量一氧化氮，從而誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生[3];IL-1β可激發(fā)其它炎癥細(xì)胞因子的合成、分泌，協(xié)同導(dǎo)致組織損傷與血管內(nèi)膜增生[21];IL-10作為M2型巨噬細(xì)胞主要的生物標(biāo)志物，當(dāng)其大量分泌時，可通過參與B細(xì)胞與T細(xì)胞的反應(yīng)來調(diào)控免疫進(jìn)程[22]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，選擇AMPK信號通路中的AMPK蛋白以及巨噬細(xì)胞極化相關(guān)因子mRNA，來探討黃連解毒湯是否通過該通路調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，并研究其抗炎作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃連解毒湯可上調(diào)細(xì)胞中AMPK蛋白和Fizz1、IL-10 mRNA的表達(dá)水平，下調(diào)細(xì)胞中IL-1β、iNOS mRNA的表達(dá)水平。由此推測，黃連解毒湯可能通過AMPK通路調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，從而發(fā)揮抗炎作用。此研究結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致[23-24]。

綜上所述，本研究預(yù)測了黃連解毒湯調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的活性成分、靶點以及信號通路;經(jīng)細(xì)胞試驗初步驗證黃連解毒湯可能通過AMPK通路上調(diào)M2型極化因子的表達(dá)、下調(diào)M1型極化因子的表達(dá)，從而調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化，進(jìn)而發(fā)揮抗炎作用。后續(xù)本課題組將進(jìn)一步深入研究黃連解毒湯活性成分調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的作用機(jī)制，以期為指導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化相關(guān)疾病的臨床治療提供參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 吳秀華，鄭文潔.巨噬細(xì)胞極化[J].中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2017，11（2）：161-165.

[ 2 ] 陳方圓，袁祖貽，周娟，等.姜黃素促進(jìn) RAW264.7源性 M1型巨噬細(xì)胞向替代激活的 M2 表型極化[J].西安交通大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2015，36（2）：257-262.

[ 3 ] SCHULTZE JL，SCHMIDT SV，MOLECULAR.Features of macrophage activation[J]. Semin Immunol，2015，27（6）：416-423.

[ 4 ] 阮靜瑤，陳必成，張喜樂，等.巨噬細(xì)胞M1/M2極化的信號通路研究進(jìn)展[J].免疫學(xué)雜志，2015，31（10）：911-917.

[ 5 ] 周憲賓，姚成芳.巨噬細(xì)胞M1/M2極化分型的研究進(jìn)展[J].中國免疫學(xué)雜志，2012，28（10）：957-960.

[ 6 ] 王宸罡，齊新，王麗，等.簡述黃連解毒湯的藥理作用及臨床應(yīng)用[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2018，37（5）：433-436.

[ 7 ] 盛蒙，許滔，于紅紅，等.黃連解毒湯含藥血清激活PPARγ誘導(dǎo)RAW264.7源性泡沫細(xì)胞向M2表型極化[J].中國免疫學(xué)雜志，2020，36（3）：277-281、288.

[ 8 ] 張茹蘭，黃秀芳，陶彥谷，等.黃連解毒湯對 Aβ25-35誘導(dǎo)的 HT22 細(xì)胞 NF-κB 活化及炎癥因子水平的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2018，13（5）：167-173.

[ 9 ] 李彤，韓俊燕，王蓓蓓，等.黃連解毒湯調(diào)控單核、巨噬細(xì)胞及泡沫細(xì)胞分化的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34（9）：73-79.

[10] YU G，LUO Z，ZHOU Y，et al. Uncovering the pharmacological mechanism of Carthamus tinctorius L. on cardiovascular disease by a systems pharmacology approach[J].Biomed Pharmacother，2019. DOI：10.1016/j.biopha.2019. 109094.

[11] WANG W，LIU T，YANG L，et al. Study on the multi-targets mechanism of triphala on cardio-cerebral vascular di- seases based on network pharmacology[J]. Biomed Pharmacother，2019. DOI：10.1016/j.biopha.2019.108994.

[12] 范勝軍，李學(xué)軍.反向分子對接-藥物靶點發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的新途徑[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2012，43（5）：367-370.

[13] 詹群璋，黃英杰，林樹紅，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的玉屏風(fēng)散預(yù)防新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）活性化合物的研究[J].中草藥，2020，51（7）：1731-1740.

[14] 張選明，安冬青，張華，等.芳香新塔花總黃酮對脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子的影響及機(jī)制[J].遼寧中醫(yī)雜志，2020，47（2）：158-161、221.

[15] 孫治中，江艷君，紀(jì)樹亮，等.黃芩苷治療小鼠AS模型的作用與機(jī)制[J].中國組織工程研究，2019，23（19）：91-97.

[16] LI Y，CHEN Y. AMPK and Autophagy[J]. Adv Exp Med Biol，2019. DOI：10.1007/978-981-15-0602-4_4.

[17] WANG Y，VIOLLET B，TERKELTAUB R，et al. AMP-activated protein kinase suppresses urate crystal-induced inflammation and transduces colchicine effects in macrophages[J]. Ann Rheum Dis，2016，75（1）：286-294.

[18] DAY EA，F(xiàn)ORD RJ，STEINBERG GR. AMPK as a therapeutic target for treating metabolic diseases[J]. Trends Endocrinol Metab，2017，28（8）：545-560.

[19] MOUNIER R，THERTET M，ARNOLD L，et al. AMPKα1 regulates macrophage skewing at the time of resolution of inflammation during skeletal muscle regeneration[J]. Cell Metab，2013，18（2）：251-264.

[20] 劉黎，胡靜平，岳艷.雌激素通過調(diào)節(jié)IRF4促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2013，33（4）：285-289.

[21] 唐瀾，王麗，付度關(guān)，等.瘦素對巨噬細(xì)胞白細(xì)胞介素1β表達(dá)的影響[J].中國動脈硬化雜志，2006，14（9）：747- 749.

[22] 黃小會，趙欣，董曉惠，等. IL-10參與調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化[J].軍事醫(yī)學(xué)，2018，42（9）：673-677.

[23] ZHANG L，ZHANG J，YOU Z. Switching of the microglial activation phenotype is a possible treatment for depression disorder[J]. Front Cell Neurosci，2018. DOI：10.3389/fncel.2018.00306.

[24] SUENAGA J，HU X，PU H，et al. White matter injury and microglia/macrophage polarization are strongly linked with age-related long-term deficits in neurological function after stroke[J]. Exp Neurol，2015. DOI：10.1016/j.expneurol.2015.03.021.

（收稿日期：2020-09-16 修回日期：2020-12-27）

（編輯：唐曉蓮）