侵襲性肺部真菌感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

郭鵬豪，廖 康，伍眾文，何宇婷，陳怡麗，劉 敏

侵襲性肺部真菌感染指不包括真菌寄生和過(guò)敏所致的支氣管肺部真菌感染,分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種類型[1]。近年來(lái)，隨著人口老齡化﹑器官移植免疫抑制劑的使用、腫瘤放化療、造血干細(xì)胞移植、超廣譜抗生素和多種抗生素聯(lián)合應(yīng)用、皮質(zhì)類固醇激素的使用以及各種導(dǎo)管介入治療等，使侵襲性肺部真菌感染的發(fā)病率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。由于肺部真菌感染臨床表現(xiàn)常無(wú)特異性，早期診斷困難，且病情易被基礎(chǔ)病掩蓋，造成誤診、漏診而延誤治療。正確、及時(shí)診斷肺部真菌感染依賴于實(shí)驗(yàn)室精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果。筆者現(xiàn)對(duì)肺部真菌感染常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，包括傳統(tǒng)方法(直接鏡檢、真菌培養(yǎng))、血清學(xué)檢測(cè)[G試驗(yàn)、曲霉菌抗原、隱球菌莢膜多糖抗原(cryptococcal polysaccharide capsule antigen,CrAg)、曲霉菌抗體]和核酸檢測(cè)等進(jìn)行介紹。

1 侵襲性肺部真菌感染的流行情況

目前我國(guó)學(xué)者報(bào)道的侵襲性肺部真菌感染的病原體分布具有一定的差異。閆曉培等[2]報(bào)道在非移植患者中最常見的病原體是隱球菌、曲霉菌和毛霉菌。屈晶晶等[3]報(bào)道在非重癥監(jiān)護(hù)室確診肺真菌病患者中的前4位病原體分別為曲霉菌、隱球菌、毛霉菌和組織胞漿菌。北京協(xié)和醫(yī)院一項(xiàng)長(zhǎng)達(dá)15年，針對(duì)187例的肺真菌病組織病理學(xué)的回顧性分析[4]結(jié)果顯示：肺曲霉病85例(45.5%)，肺隱球菌病51例(27.3%)，肺毛霉病6例(3.2%)，肺組織胞漿菌病3例(1.6%)，肺念珠菌病3例(1.6%)，肺孢子菌病2例(1.1%)，不能明確分類37例(19.8%)。筆者所在單位中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院從2019-01～2020-12臨床診斷為侵襲性肺部真菌感染的患者198例，其中以曲霉菌為主，其次為新型隱球菌、馬爾尼菲籃狀菌等，具體分布見圖1。其中馬爾尼菲籃狀菌的分離率高于國(guó)內(nèi)目前的報(bào)道，這與該菌種的流行區(qū)域有關(guān)。

圖1 2019-01～2020-12中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床診斷侵襲性肺部真菌感染患者的病原體分布圖

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

2.1直接顯微鏡檢查 直接顯微鏡檢查是一種快速、性價(jià)比高的方法。采集痰、支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、肺組織等標(biāo)本，通過(guò)顯微鏡觀察標(biāo)本中是否存在真菌孢子及菌絲，同時(shí)根據(jù)孢子及菌絲的特點(diǎn)對(duì)于菌種的種屬進(jìn)行初步判定。直接鏡檢結(jié)果也能指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室選擇最適合真菌體外生長(zhǎng)的培養(yǎng)條件。目前最常用的染色方法包括氫氧化鉀(KOH)濕片、革蘭染色、六胺銀染色、鈣熒光白染色等[5]。KOH濕片法通過(guò)對(duì)標(biāo)本中的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行消化，留下完整且更加明顯的真菌細(xì)胞壁，從而將標(biāo)本內(nèi)的真菌與其他成分進(jìn)行區(qū)分。六胺銀染色通過(guò)將銀離子沉積在胞壁上，把真菌染成黑色輪廓，背景呈淡綠色，較革蘭染色更易識(shí)別且形態(tài)更加清晰，但操作相對(duì)比較復(fù)雜。鈣熒光白染色通過(guò)熒光染料非特異地與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)結(jié)合，在熒光顯微鏡下真菌菌體呈淺藍(lán)或綠色，具有較高的敏感性。熒光抗體染色則可針對(duì)不同真菌種屬進(jìn)行特異性染色，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行消化、富集以后再進(jìn)行相應(yīng)的染色，可提高直接顯微鏡檢查的靈敏度。對(duì)于有條件的實(shí)驗(yàn)室建議開展鈣熒光白染色或者熒光抗體的染色方法，提高檢測(cè)的靈敏度。另外需要注意的是，處理患者標(biāo)本時(shí)應(yīng)采取全面的防護(hù)措施，在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行標(biāo)本的操作。臨床標(biāo)本直接涂片染色時(shí)真菌的顯微鏡下形態(tài)見圖2。

?曲霉菌絲(KOH濕片)；?曲霉菌絲(革蘭染色)；?新型隱球菌(墨汁染色)；?曲霉菌絲(鈣熒光白染色)；?毛霉菌絲(鈣熒光白染色)；?馬爾尼菲籃狀菌孢子(鈣熒光白染色)

2.2組織病理學(xué)檢查 組織病理是診斷真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)與微生物學(xué)檢查密切結(jié)合[5]。蘇木素-伊紅(HE)染色可用于篩查。如果HE染色后懷疑真菌，則可使用針對(duì)真菌特定結(jié)果的染色方法[碘酸-希夫(PAS)染色、GMS染色等]。PAS染色可使真菌染成鮮紅色，GMS染色也可用于組織病理學(xué)檢查，使真菌呈黑色。

2.3真菌培養(yǎng) 從呼吸道標(biāo)本中培養(yǎng)分離到真菌是診斷侵襲性肺部真菌感染的重要依據(jù)之一。目前已發(fā)表文獻(xiàn)[6～8]顯示真菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率為56.0%～81.0%。對(duì)分離到的真菌可以通過(guò)如形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)、質(zhì)譜儀等技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定并進(jìn)行藥敏檢測(cè)，從而為臨床抗真菌藥物的選擇提供重要的依據(jù)。當(dāng)懷疑有肺部真菌感染時(shí)，建議至少送檢3個(gè)高質(zhì)量的呼吸道標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。需要注意的是臨床標(biāo)本中真菌培養(yǎng)陽(yáng)性并不一定代表侵襲性感染，區(qū)分呼吸道定植和侵襲性感染是相當(dāng)困難的[9,10]。當(dāng)標(biāo)本真菌培養(yǎng)的結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，需要結(jié)合其他的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)估。在臨床表現(xiàn)相符的情況下，從組織或者其他呼吸道標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)菌絲，且從同一標(biāo)本中培養(yǎng)出大量的曲霉(或者從多個(gè)標(biāo)本中檢查出相同的菌種)預(yù)示侵襲性肺曲霉菌病。由于念珠菌可在口腔、呼吸道定植，有學(xué)者[11]認(rèn)為呼吸道標(biāo)本無(wú)論單次還是多次陽(yáng)性，無(wú)論菌落數(shù)多少，對(duì)診斷均無(wú)意義。國(guó)內(nèi)一些學(xué)者[12]則認(rèn)為呼吸道標(biāo)本合并真菌感染存在的危險(xiǎn)因素時(shí)，在排除細(xì)菌感染的前提下，不能忽視多次下呼吸道分離出同一種念珠菌對(duì)診斷的價(jià)值。侵襲性肺部真菌感染常見病原體的菌落形態(tài)見圖3。

?煙曲霉(沙氏平板，28 ℃培養(yǎng)3 d)；?新型隱球菌(沙氏平板，28 ℃培養(yǎng)5 d)；?馬爾尼菲籃狀菌(沙氏平板，28 ℃培養(yǎng)5 d)；?根霉菌(沙氏平板，28 ℃培養(yǎng)2 d)

2.4血清學(xué)檢測(cè)

2.4.1 1，3-β-D葡聚糖檢測(cè)(G試驗(yàn)) 1，3-β-D葡聚糖是真菌細(xì)胞壁的重要組成成分，除隱球菌屬、接合菌以外的大部分真菌都可以通過(guò)G試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，該試驗(yàn)被歐洲癌癥研究和治療組織/侵襲性真菌感染協(xié)作組和美國(guó)國(guó)立變態(tài)反應(yīng)和感染病研究院真菌病研究組(European Organization for the Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group，EORTC/MSG)共識(shí)納入為侵襲性真菌感染診斷的間接微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)之一[13]。血清G試驗(yàn)被推薦為侵襲性真菌感染的篩選試驗(yàn)，但是陽(yáng)性結(jié)果并不能明確是哪一種特定真菌的感染。該試驗(yàn)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值隨著患者群體的不同而有差異。多次結(jié)果陽(yáng)性或者檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)陽(yáng)性閾值時(shí)，陽(yáng)性結(jié)果的置信度增加[14]；重復(fù)檢測(cè)的陰性結(jié)果具有較好的陰性預(yù)測(cè)值。由于1，3-β-D-葡聚糖沒有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不同廠家的試劑盒均需要使用自己的參考范圍進(jìn)行結(jié)果評(píng)價(jià)[5]。另外，如透析用纖維素膜、免疫球蛋白、白蛋白、手術(shù)患者大量紗布暴露等可引起G試驗(yàn)出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果[15]。

2.4.2 CrAg檢測(cè) CrAg檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單有效、創(chuàng)傷小、靈敏度和特異度較高的診斷肺隱球菌病的技術(shù)，在肺隱球菌病的早期診斷、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷中起到重要作用。莢膜多糖在菌體生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中不斷分泌到胞外，可以作為隱球菌感染的診斷依據(jù)。世界衛(wèi)生組織建議當(dāng)CD4細(xì)胞<100個(gè)/μl時(shí)需監(jiān)測(cè)血清CrAg[16]，若血清CrAg陽(yáng)性時(shí)，需對(duì)抗原的滴度進(jìn)行定量檢測(cè)。抗原滴度的降低是隱球菌感染治療有效的指標(biāo)。然而，抗原滴度有可能在非艾滋病患者治療的初期下降，但在隱球菌完全清除以后一直保持較高的滴度水平[17]。CrAg檢測(cè)方法包括乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫法和免疫側(cè)向?qū)游龇?lateral flow immunochromatographic assays，LFA)。目前美國(guó)IMMY公司的LFA可通過(guò)血清、血漿、腦脊液標(biāo)本檢測(cè)新型隱球菌和格特隱球菌，其檢測(cè)靈敏度和特異度在血清標(biāo)本中分別為98%和100%[18]。與乳膠凝集法和酶聯(lián)免疫法相比，LFA的靈敏度更高，同時(shí)具有廉價(jià)、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)。白吉利地霉(Geotrichum beigelii)可導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果，而假陰性結(jié)果可能由于抗原濃度低或者高濃度(前帶效應(yīng))所引起。

2.4.3 曲霉菌抗原檢測(cè) 曲霉菌抗原的檢測(cè)成分是半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)。GM是曲霉細(xì)胞壁上主要的多糖成分，其可在菌絲生長(zhǎng)的過(guò)程中被釋放出來(lái)。該試驗(yàn)被EORTC/MSG納入免疫抑制患者中侵襲性曲霉菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。GM試驗(yàn)可采用血清、BALF、腦脊液標(biāo)本，其診斷效能與基礎(chǔ)人群、是否接受預(yù)防、診斷試劑等因素相關(guān)。血清GM在粒細(xì)胞缺乏的患者中其靈敏度顯著高于非粒細(xì)胞缺乏的患者。血清GM單個(gè)樣本陽(yáng)性(GM結(jié)果≥0.7)或者兩個(gè)樣本≥0.5被認(rèn)為有診斷價(jià)值[19]。雖然BALF GM在臨床應(yīng)用中面臨標(biāo)準(zhǔn)化的問題，但是目前的研究認(rèn)為在侵襲性肺部真菌感染的診斷中BALF GM比血清GM更敏感[20]。對(duì)于BALF GM的臨界值在不同的文獻(xiàn)中有不同的推薦，如Zou等[21]建議為1.0，而Heng等[22]建議為1.5。需要注意的是抗真菌治療可顯著降低血清GM試驗(yàn)的靈敏度[23]。部分β內(nèi)酰胺類抗生素(如哌拉西林-他唑巴坦)、新生兒腸道內(nèi)雙歧桿菌定植、攝入含有GM的食物(如谷類食物和牛奶)以及一些非曲霉菌的菌種(如馬爾尼菲籃狀菌、白地霉、無(wú)綠藻菌、組織胞漿菌)會(huì)引起GM結(jié)果的假陽(yáng)性。另外建議在治療的過(guò)程中對(duì)GM進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，評(píng)估治療的效果。若治療期間，結(jié)果升高預(yù)示預(yù)后較差。但是，結(jié)果轉(zhuǎn)陰，不能作為結(jié)束抗真菌治療的孤立指標(biāo)，應(yīng)該結(jié)合影像、臨床等綜合評(píng)估。

2.4.4 曲霉菌抗體檢測(cè) 曲霉IgG抗體是機(jī)體針對(duì)曲霉菌感染產(chǎn)生的特異性抗體。血清曲霉IgG抗體水平升高，通常提示曲霉菌感染。研究[24]顯示慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis，CPA)患者中只有26.0%曲霉培養(yǎng)陽(yáng)性，但99.0%的CPA患者存在曲霉菌特異性IgG升高。北京一項(xiàng)研究[25]指出，診斷CPA的曲霉特異性IgG(丹娜)的Cut-off值為89.3 AU/ml時(shí)，靈敏度和特異度分別為78.6%和94.4%。此外，曲霉IgG抗體檢測(cè)不僅對(duì)肺曲霉病的早期臨床診斷具有重要意義，其血清水平的變化能夠直觀地反映陽(yáng)性患者抗真菌治療的療效[26]。2016年，美國(guó)傳染病學(xué)會(huì)(Infectious Diseases Society of America，IDSA)和歐洲臨床微生物學(xué)及傳染病學(xué)會(huì)(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases，ESCMID)與歐洲呼吸學(xué)會(huì)(European Respiratory Society，ERS)合作，發(fā)布了CPA診斷指南[27,28]。這兩項(xiàng)指南均建議將曲霉IgG抗體檢測(cè)作為診斷CPA的關(guān)鍵指標(biāo)。

2.4.5 核酸檢測(cè) 應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測(cè)真菌核酸相比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有更高的敏感性。采用通用引物或特異性引物的設(shè)計(jì)既可以發(fā)現(xiàn)常見致病真菌(曲霉菌、肺孢子菌),也可以發(fā)現(xiàn)少見或罕見真菌。以real-time PCR及相關(guān)技術(shù)為代表的分子診斷,已逐步成為感染性疾病診斷的重要方法，能提供更加快速的診斷，對(duì)于提早開始抗真菌治療、改善患者預(yù)后及降低病死率有重要意義。PCR技術(shù)檢測(cè)BALF標(biāo)本用于輔助診斷侵襲性肺曲霉菌病具有很好的潛力[29，30]。以下三種情況均可作為診斷侵襲性真菌病的微生物學(xué)證據(jù)：(1)血漿、血清或全血連續(xù)2次或以上PCR檢測(cè)陽(yáng)性；(2)BALF 2次或以上重復(fù)PCR檢測(cè)陽(yáng)性；(3)至少1次血漿、血清或全血PCR檢測(cè)陽(yáng)性和1次BALF PCR陽(yáng)性。另外需要強(qiáng)調(diào)的是，實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)標(biāo)本處理、保存、DNA提取和檢測(cè)等全程標(biāo)準(zhǔn)化，并采取嚴(yán)格的防污染措施。

2.4.6 宏基因組測(cè)序(metagenomics next generation sequencing，mNGS) mNGS是一種可以直接從患者標(biāo)本中進(jìn)行泛核酸檢測(cè)的方法，允許無(wú)差別檢測(cè)所有微生物(如細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌)、抗體、毒力因子，甚至宿主生物標(biāo)志物等[31]。對(duì)于呼吸道感染患者，若3 d內(nèi)未通過(guò)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢查獲得明確的病原學(xué)依據(jù)且經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療無(wú)效，推薦留取呼吸道標(biāo)本進(jìn)行mNGS檢測(cè)[32]。肺組織mNGS對(duì)真菌感染的靈敏度為57.1%，特異度為61.5%；對(duì)真菌的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為44.4%，陰性預(yù)測(cè)值為72.7%[33]。標(biāo)本的取樣不規(guī)范，以及真菌細(xì)胞壁厚導(dǎo)致的DNA提取效率低，對(duì)mNGS在真菌檢測(cè)中的靈敏度造成影響。對(duì)于呼吸道感染，mNGS在細(xì)菌、真菌等病原體的檢測(cè)中尚不能準(zhǔn)確判斷菌群定植或感染狀態(tài)，仍需依賴臨床醫(yī)師結(jié)合患者病情進(jìn)行進(jìn)一步分析[32]。綜上，隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，以及更多的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和評(píng)估，在未來(lái)盡管mNGS不太可能完全取代傳統(tǒng)的病原體鑒定和抗生素敏感性檢測(cè)，但必將為侵襲性肺部真菌感染提供更強(qiáng)的診斷能力。侵襲性肺部真菌感染診斷中不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的特點(diǎn)見表1。

表1 侵襲性肺部真菌感染診斷中不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的特點(diǎn)

續(xù)表1

3 結(jié)語(yǔ)

精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室檢查是實(shí)現(xiàn)侵襲性肺部真菌感染精準(zhǔn)診療的前提和基礎(chǔ)。循證醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)表明準(zhǔn)確、早期的病原真菌實(shí)驗(yàn)室診斷，有利于盡早開始靶向性抗真菌治療，對(duì)改善患者預(yù)后、降低病死率有顯著作用。目前實(shí)驗(yàn)室除了傳統(tǒng)的真菌涂片及培養(yǎng)等傳統(tǒng)的方法外，血清學(xué)檢測(cè)在臨床的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，標(biāo)本中真菌的核酸檢測(cè)在臨床也逐漸開始應(yīng)用。充分了解每種實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及檢測(cè)性能，可以更好地幫助診斷侵襲性肺部真菌感染。在臨床工作中將傳統(tǒng)的檢測(cè)方法與血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高侵襲性肺部真菌感染的檢測(cè)靈敏度，更好地區(qū)分感染和定植，從而實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的診斷和治療，改善患者的預(yù)后。