細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3在宮頸癌中表達(dá)及臨床意義

鄭 樂(lè)

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院(遼寧省腫瘤醫(yī)院) 婦科，遼寧 沈陽(yáng) 110042

宮頸癌位于女性多發(fā)惡性腫瘤第二位[1]，且預(yù)后差，主要與其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。尋找宮頸癌早期診斷、預(yù)測(cè)病情嚴(yán)重程度的標(biāo)志物及宮頸癌的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白激酶抑制劑(cyclin-dependent kinase inhibitors，CKIs)，通過(guò)與CDKs或CDK-cyclin復(fù)合物相互結(jié)合，從而抑制CDKs活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期正常有序地進(jìn)行[2-3]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子3(cyclin-dependent kinase inhibitor 3，CDKN3)屬于CKIs中的一類，是細(xì)胞周期調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要一環(huán)[4]。CNKN3在正常的細(xì)胞周期中主要作為CDK2的抑制因子，在G1～S期與CDK2穩(wěn)定結(jié)合，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[5]。CDKN3在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、腎癌、食管癌等，其表達(dá)水平常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[6-10]。本研究旨在探討CDKN3在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集自2015年1月至2016年1月于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院婦科行手術(shù)治療且經(jīng)病理檢查確診患者的60例宮頸癌組織、30例宮頸原位癌組織、30例正常宮頸組織。60例宮頸癌組織中，患者中位年齡48歲；臨床分期Ⅰ～Ⅱa期32例，Ⅱb～Ⅳ期28例。20例宮頸癌和配對(duì)癌旁宮頸組織標(biāo)本取自于手術(shù)切除30 min內(nèi)組織標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 濃縮型兔抗人CDKN3多克隆抗體(北京博奧森)；SP試劑盒及DAB顯色劑(北京中杉金橋)；SDS—PAGE凝膠配制試劑盒(南京凱基生物)。

1.3 研究方法 (1)免疫組織化學(xué)法。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行(工作濃度為1∶200)。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以CDKN3陽(yáng)性染色切片作為陽(yáng)性對(duì)照。(2)蛋白免疫印跡法。對(duì)20例早期宮頸癌及配對(duì)癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)。提取組織中核蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗，緩沖液稀釋(1∶1 000)，孵育聚偏氟乙烯膜，4℃過(guò)夜，緩沖液洗3次，每次10 min，將二抗用緩沖液稀釋(1∶2 000)，室溫振蕩孵育1 h，緩沖液洗3次，每次10 min，用ECL發(fā)光法試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以例(百分率)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果 免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示，CDKN3陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，在宮頸癌組織、宮頸原位癌組織、正常宮頸組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為81.67%(49/60)、60.00%(18/30)、20.00%(6/30)。宮頸癌組織中CDKN3的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于宮頸原位癌組織及正常宮頸組織；宮頸原位癌組織CDKN3的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常宮頸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果(a.CDKN3在宮頸癌組織中的表達(dá)；b.CDKN3在宮頸原位癌組織中的表達(dá)；c.CDKN3在正常宮頸組織中的表達(dá)；SP×400)

2.2蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果 蛋白免疫印跡法結(jié)果顯示，CDKN3蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果

2.3 CDKN3在宮頸癌中的表達(dá)與宮頸癌臨床病理因素之間的關(guān)系 CDKN3在宮頸癌中的表達(dá)與臨床分期相關(guān)(P<0.05)，與年齡、病理類型無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CDKN3在宮頸癌中的表達(dá)與宮頸癌臨床病理因素之間的關(guān)系/例(百分率/%)

3 討論

細(xì)胞周期調(diào)控異常在腫瘤細(xì)胞增殖中起重要作用，與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。CDKN3選擇性與CDK2結(jié)合，降低CDK2使抑癌基因視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(Rb蛋白)磷酸化的能力[11]，去磷酸化的Rb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F1結(jié)合，抑制產(chǎn)生細(xì)胞周期相由G1/S的轉(zhuǎn)變所需的蛋白，從而抑制G1相至S相的轉(zhuǎn)變[12-14]，可以表現(xiàn)抑癌基因的作用。同時(shí)，CDKN3也是一種Mdm2結(jié)合蛋白，可以與Mdm2和p53形成復(fù)合體，降低p21的敏感度，減少p53靶基因產(chǎn)物的生成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)展[15]。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中CDKN3呈高表達(dá)，正常宮頸組織中CDKN3呈低表達(dá)；正常宮頸組織及宮頸原位癌組織中CDKN3的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能由于此基因是在宮頸腫瘤組織中早期出現(xiàn)的上調(diào)基因；CDKN3與宮頸癌的臨床分期相關(guān)，提示CDKN3可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到了重要作用。Lai等[9]對(duì)58例腎細(xì)胞癌手術(shù)切除組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)法分析發(fā)現(xiàn)，CDKN3蛋白高表達(dá)并存在胞漿表達(dá)，臨床病理分析表明，其與較高的組織學(xué)分級(jí)有關(guān)。Xing等[16]在肝癌細(xì)胞系和臨床樣本中檢測(cè)到CDKN3高表達(dá)，進(jìn)一步分析肝癌病例的臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，CDKN3高表達(dá)與腫瘤分期晚和分化程度差相關(guān)。Niculescu等[17]在缺乏膽堿的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系IMR-32中檢測(cè)到CDKN3表達(dá)增加，CDKN3高表達(dá)的分子機(jī)制可能與CDKN3基因啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化有關(guān)。Yu等[18]通過(guò)對(duì)11例卵巢漿液性腺癌和9例卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌組織進(jìn)行基因甲基化篩查發(fā)現(xiàn)，CDKN3基因甲基化與對(duì)照組的正常輸卵管和子宮內(nèi)膜組織比較明顯降低。

綜上所述，CDKN3與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，考慮可將其作為診斷宮頸癌及判斷預(yù)后的有效生物指標(biāo)，但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。