接種AMF及施氮對濱海鹽土氮礦化的影響

楊瑞珍，張煥朝，胡立煌，范之馨

(南京林業(yè)大學，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037)

鹽土是因土壤鹽化而形成的一種土壤類型，因其土體具有較高的鹽分而導致植物無法正常生長[1]。鹽土多分布于干旱、半干旱地區(qū)以及濱海地區(qū)。中國鹽漬化土壤總面積約3 600萬hm2，占全國可利用土地面積的4.88%;耕地中鹽漬化面積達到920.9萬hm2，占全國耕地面積6.62%[2]。隨著我國經濟快速發(fā)展、人口數(shù)量劇增，土地資源緊缺問題日益嚴峻。江蘇北部地區(qū)擁有大面積的濱海沖積平原，是江蘇乃至中國沿海的重要戰(zhàn)略發(fā)展區(qū)域[3]，但是這些鹽土地區(qū)，因其特殊的成土因素使得該地區(qū)土壤具有養(yǎng)分貧瘠、土壤鹽化程度嚴重等特點[4]，使土地資源未得到有效利用。對濱海鹽土地區(qū)土壤加以改良、開發(fā)和利用是改善生態(tài)環(huán)境、促進經濟發(fā)展的重要途徑[5]。

氮素是植物生長和發(fā)育所需的大量營養(yǎng)元素之一,也是植物從土壤中吸收量最大的礦質元素[6]。土壤中氮素可被植物直接吸收利用的主要形式是無機氮 (主要為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮),僅占土壤總氮的1%[7]。氮礦化是植被-土壤系統(tǒng)間養(yǎng)分循環(huán)過程中重要的一環(huán)，氮礦化速率對土壤氮的貯存量和供應能力具有顯著影響[8-10]。土壤氮循環(huán)是一個在微生物驅動下，由土壤酶介導催化的復雜過程，這一過程同時受土壤理化性質、微型動物以及根系生長發(fā)育等生物和非生物因子的綜合影響[11]。土壤中較高的鹽分會影響氮素轉化，土壤中鹽分越高，越不利于銨態(tài)氮的吸附，氮礦化作用也隨之受到抑制[12]。施氮是在鹽漬條件下維持植物正常生長、提高鹽土供氮能力的有效手段。濱海鹽土有機質和氮素含量較低，尤其是土壤有效氮含量更低，因此，需要施用氮肥滿足植物生長需要，然而，大量的氮肥通過各種途徑流失造成氮肥利用效率(30%～50%)低下，對生態(tài)環(huán)境產生負效應[13]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是一種內生菌根真菌，早在 4.5 億年前，就已經與陸生植物根系形成了共生結構，并經過長期的協(xié)同進化，建立了互利互惠的共生關系[14]。AMF具有促進植物生長、改善植物營養(yǎng)狀況、提高植物抗逆性的能力，因其具有作為生物肥料的潛力受到廣泛關注[15]。近年來，越來越多的研究表明，AMF可以從土壤中吸收氮并向植物轉運，因而在植物氮素營養(yǎng)中發(fā)揮重要作用[16-18]。但也有研究者認為AMF向植物轉運的氮遠不能滿足植物的氮需求量，因此AMF對植物氮吸收的貢獻很小，甚至沒有作用[19-20]。AMF是否通過提高對氮素的利用能力而對促進植物生長產生作用，有待于進一步研究。研究證明在鹽漬環(huán)境下許多植物可以形成菌根[21-22]。AMF侵染植物根系會造成根的結構和生理特性發(fā)生變化，產生大量的根外菌絲，有利于擴大植物根系在土壤中的吸收范圍，從而影響根系對養(yǎng)分的吸收能力[23]。在濱海鹽土中，AMF的侵染和施氮對植物氮素吸收的影響尚不明確。為此，本研究以江蘇濱海鹽土為研究對象，采用室內盆栽、培養(yǎng)試驗，設置不同施氮濃度及接種AMF處理，研究接種AMF及不同施氮水平對濱海鹽土氮礦化作用的影響，以期為合理施氮以及提高濱海鹽土供氮能力提供科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1)試驗土壤。于2019年4月采自江蘇省鹽城市大豐沿海農業(yè)科技示范園(120°49′43″E,32°59′40″ N)，土壤質地為海相沉積物發(fā)育而成的砂質壤土。采用S形取樣方法取表層土壤(10～20 cm)，充分混勻后室內風干、研磨，挑去雜根，過4 mm篩。將試驗土壤裝于布袋中，在95 ℃下蒸汽滅菌2次，每次1～2 h，2次滅菌中間間隔24 h，滅菌后的土壤放置1～2周使用。采用四分法取樣測定其基本理化性質。采用四分法取樣并測定試驗土壤的理化性質為：全氮含量(0.81±0.002)g/kg，堿解氮含量(141.92±3.40)mg/kg，有效磷含量(10.96±1.04)mg/kg，速效鉀含量(165.97±21.40)mg/kg，有機質含量(12.21±0.59)g/kg，全鹽含量(1.64±0.12)g/kg，電導率為(910.17±73.82)μS/cm，pH為8.71±0.07。

2)試驗菌劑及氮肥。供試叢枝菌根真菌為摩西斗管囊球霉(Funneliformismosseae)，菌種購自北京農林科學院“叢枝菌根真菌種質資源庫”，BGC編號:BGC XJ08A，采用玉米為宿主植物，使用經2 mm孔徑篩的混合培養(yǎng)基質(由河沙與沸石按照體積比1∶1比例混合)進行擴繁，得到包括植物根系、菌絲、孢子和培養(yǎng)基質的干燥全培養(yǎng)物作為供試菌劑。供試氮肥為尿素，購自南京姜華化玻有限公司。

3)試驗植物。采用生長較快、綠化價值較高的速生國槐(SophorajaponicaLinn.)，種子采購于江蘇亨信種業(yè)銷售公司，使用前將種子在20～30 ℃溫水中清洗3遍，后用稀釋100倍的40%甲醛溶液浸泡15 min，再用清水清洗3遍。用清水浸種24 h，浸種完后清洗1～2遍，放置于恒溫(25 ℃)培養(yǎng)箱中催芽，待種子出芽后種植。

4)試驗盆缽。采用棕色塑料花盆，盆高16 cm，上口內徑20 cm，底部內徑15 cm，用自來水清洗后再用75%酒精消毒，每盆可裝風干土3 kg。

1.2 試驗方法

1)試驗設計。采用雙因素試驗設計進行室內盆栽培養(yǎng)試驗，因素1為氮肥處理，包括3個水平：不施氮(N0)、低氮(N1)和高氮(N2)處理。因素2為接種處理，包括2個水平：接種AMF處理(+)和未接種對照(-)。共設置6個處理組合，每個組合6個重復。

2)接種。在塑料花盆中填充13 cm厚的試驗土壤，將15 g滅活(-)或未滅活(+)的AMF菌劑放置于其上，然后放置處理過的國槐種子，繼續(xù)填充處理過的供試土壤至與花盆表面平齊。將盆栽隨機放置在恒溫恒濕的人工氣候室內(溫度23 ℃，濕度80%)，實施統(tǒng)一的水肥管理，即每3 d澆純水200 mL，每7 d向盆栽施加200 mL基礎營養(yǎng)液(主要營養(yǎng)元素質量濃度為：KH2PO41 mg/L、K2SO45 mg/L、MgSO42 mg/L，其他微量元素濃度同霍格蘭營養(yǎng)液[24])。

3)施氮。待種芽破土生長4周后進行施氮處理：低氮(N1)處理為施加200 mg/kg尿素(含N 92 mg/kg)，高氮(N2)處理為施加400 mg/kg尿素(含N 184 mg/kg)，3個月后取盆栽土壤進行土壤培養(yǎng)試驗，同時測定其pH、含水率、全氮等指標(表1)。

對接種處理的盆栽進行菌根侵染率測定，檢查其是否接種成功(圖1)。

表1 3個月后盆栽土壤主要理化性質Table 1 The main physical and chemical properties of potted soil after three months

a.未被侵染的根系uninfested root system；b.被侵染的根系infested root system。圖1 國槐菌根侵染情況Fig.1 Mycorrhizal infection of S.japonica

4)土壤培養(yǎng)。將取得的盆栽鮮土用2 mm孔徑篩篩除其中根系。每個處理分別稱取相當于50 g風干土的鮮土于廣口塑料燒杯中，每個處理設置21組重復。用稱質量法調節(jié)含水量至相對含水率為60%。然后用保鮮膜封口，再扎4～5個小孔通氣，后將燒杯放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱下暗培養(yǎng)30 d。每隔2 d用稱質量法補充含水量至相對含水率為60%，于培養(yǎng)的第1、3、5、7、10、20、30 d隨機選取各處理中的3個燒杯取出土壤樣品用于硝態(tài)氮、銨態(tài)氮的測定。

1.3 分析方法

土壤含水率采用烘干法測定，土壤pH及電導率采用電位法測定(土壤和水體積比為1∶5)；土壤全氮含量采用凱式定氮法測定；銨態(tài)氮采用靛酚藍比色法測定；硝態(tài)氮采用紫外分光光度法測定；其他土壤基本理化性質按照鮑士旦[24]的方法測定。菌根侵染率按照王幼珊等[25]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

計算3次重復的平均值用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析，采用 Excel 2010、SPSS 22 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、單因素方差分析(One-way ANOVA)以及雙因素方差分析(Two-way ANOVA)，采用Sigmaplot 12.5軟件作圖。采用LSD檢驗進行多重比較分析(顯著性水平設為0.05)。土壤氮礦化速率按照如下公式進行計算：

VN=MN/T。

2 結果與分析

2.1 施氮對菌根侵染率的影響

施氮處理對國槐的菌根侵染率有顯著影響(P<0.05)。菌根侵染率隨著施氮量的增加呈現(xiàn)出先顯著升高(P<0.05)再降低的趨勢。不施氮處理(N0)的平均菌根侵染率僅為16.00%，N1濃度的平均菌根侵染率達到45.22%，而N2濃度時平均菌根侵染率為32.44% (圖2)。表明在濱海鹽土中，氮素的施用在一定范圍內促進叢枝菌根真菌與植物根系建立共生關系。但當施氮量達到一定程度時，菌根真菌的生長受到一定限制。

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P <0.05)。下同。Different lowercase letters in the figure indicate significant differences between different treatments (P <0.05).The same below.圖2 施氮對菌根侵染率的影響Fig.2 Effects of nitrogen application on mycorrhizal infection rates

2.2 接種AMF及施氮對硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量的影響

硝態(tài)氮含量隨著施氮量的增加而升高(表2)，在培養(yǎng)第1、3、7、20和30天時相同接種處理下，高氮(N2)處理的硝態(tài)氮含量顯著高于低氮(N1)以及不施氮(N0)處理(P<0.05)，相同施氮水平下，接種AMF處理的硝態(tài)氮含量均顯著高于不接種處理(P<0.05)。在培養(yǎng)初始時(1 d)，N0處理下，接種AMF的硝態(tài)氮含量低于不接種處理?？傮w來看，硝態(tài)氮含量表現(xiàn)出先增加后降低最后趨于穩(wěn)定的趨勢。

表2 接種AMF及施氮處理的鹽土在不同培養(yǎng)時間的硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量Table 2 The content of nitrate nitrogen and ammonium nitrogen in saline soil inoculated with AMF and nitrogen treatments at different cultivation time mg/kg

施氮并未對銨態(tài)氮含量表現(xiàn)出顯著的促進作用(表3)。在培養(yǎng)初始時(1 d)，相同施氮處理下，接種AMF的銨態(tài)氮含量顯著低于不接種處理(P<0.05)，接種AMF處理中，N1濃度的銨態(tài)氮含量顯著低于N0和N2處理(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間的增加，銨態(tài)氮含量表現(xiàn)出先升高而后逐漸降低的趨勢。試驗結束時，相同施氮處理下，接種AMF處理的銨態(tài)氮含量顯著高于不接種處理(P<0.05)，而在接種處理下，N2處理銨態(tài)氮含量要顯著高于NO處理。

2.3 接種AMF及施氮對凈硝化速率、凈氨化速率的影響

隨著培養(yǎng)時間的增加，土壤凈硝化速率和凈氨化速率均表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(圖3A)。在培養(yǎng)第3天時，不接種AMF條件下，凈硝化速率最高的是N1處理，為8.90 mg/(kg·d)；接種AMF條件下，凈硝化速率最低也是N1處理，為4.90 mg/(kg·d)；除N1處理外，接種AMF處理的凈硝化速率均大于不接種處理(圖3A)。這可能是由于AMF影響了植物根系對土壤氮礦化過程中形成的礦質氮的吸收。

圖3 接種AMF及施氮在不同培養(yǎng)時間對鹽土的凈硝化速率、凈氨化速率及凈氮礦化速率的影響Fig.3 Effects of AMF inculation and nitrogen fertilizer application on net nitrification rate,net ammonification rate and net nitrogen mineralization of saline soil inoculated at different cultivation time

圖柱上不同大寫字母表示同一處理不同培養(yǎng)時間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示相同培養(yǎng)時間不同處理間差異顯著(P<0.05)。Different capital letters on the column indicate significant differences in different incubation times for the same treatment (P<0.05),and different lowercase letters indicate significant differences between different treatments for the same incubation time (P<0.05).圖4 接種AMF及施氮對鹽土凈氮礦化量的影響Fig.4 Effects of AMF inoculation and nitrogen application on net nitrogen mineralization of saline soil

凈氨化速率表現(xiàn)出隨著培養(yǎng)時間增加而逐漸下降最后趨于穩(wěn)定的趨勢。培養(yǎng)初期(3 d)，不接種AMF條件下，施氮處理并未表現(xiàn)出對凈氨化速率的促進作用；而接種AMF條件下，施氮處理的凈氨化速率高于不施氮處理，最高為N1處理的1.37 mg/(kg·d)。在相同施氮處理下，接種AMF的凈氨化速率均表現(xiàn)出高于不接種處理，其中N1處理時差異極顯著(P<0.01)(圖3B)。這說明接種AMF有助于銨態(tài)氮的同化。

2.4 接種AMF及施氮對凈氮礦化的影響

分析結果表明，在不接種AMF處理中，N1濃度的氮處理相比N0、N2處理對凈氮礦化量的積累表現(xiàn)出更明顯的促進作用，在培養(yǎng)的第20、30天均達到顯著水平(P<0.05)(圖4A)。高氮處理對凈氮礦化量的積累并無明顯作用，這表明過多的氮添加并不能對濱海鹽土的供氮能力產生積極影響。在接種AMF處理中，氮的施用并沒有表現(xiàn)出對凈氮礦化量的明顯促進作用，僅有N2處理的凈氮礦化量在第7天顯著高于N0、N1處理(P<0.05)(圖4B)。

各組處理的凈氮礦化速率隨著培養(yǎng)時間的增加而逐漸下降并趨于一致(圖3C)。

在培養(yǎng)初期，接種AMF處理下，N2濃度的凈氮礦化速率高于N0、N1處理，達到最高值9.45 mg/(kg·d)；不接種處理下，N1濃度的凈氮礦化速率高于N0、N2處理。這進一步說明接種AMF和施高氮處理對濱海鹽土的氮礦化能力具有促進作用，而對于不接種AMF的處理來說，更高的氮施用量并沒有促進土壤氮礦化速率更多的提升。

2.5 接種AMF及施氮對濱海鹽土氮礦化的交互作用

接種AMF和施氮處理對濱海鹽土凈硝化和凈氮礦化過程具有極顯著的交互作用(P<0.001)，而對凈氨化量和凈氨化速率的交互作用并不顯著(表3)。雙因素方差分析結果表明，凈硝化量、凈硝化速率在不同施氮處理間無顯著差異，在接種處理間差異顯著(P=0.010)，施氮和接種對其交互作用差異顯著(P<0.001)。凈氨化量和凈氨化速率在施氮處理和接種處理下均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.001)，但彼此之間的交互作用并不顯著。凈氮礦化量以及凈氮礦化速率在施氮處理和接種處理下差異均不顯著，但交互作用對其產生顯著影響(P<0.001)。

表3 土壤氮礦化各項指標方差分析Table 3 Analysis of variance on various indicators of soil nitrogen mineralization

3 討 論

本試驗中，施氮對菌根侵染率具有極顯著的促進作用(P<0.01)，施氮量為92 mg/kg時菌根侵染率最大。過高的施氮量反而抑制叢枝菌根真菌與植物共生關系的建立，這與前人的研究結果基本一致[26-27]。分析其原因可能是過多的氮添加，致使土壤中的無機氮移動性更強，植物能夠吸收更多的氮素，植物對AMF的依賴性因此減弱，分配給從枝菌根真菌的光合產物也隨之減少，從而導致侵染率降低。高氮處理的菌根侵染率仍然顯著高于不施氮處理(P<0.05)，可能是由于外源氮添加同時造成土壤中氮磷比增大，叢枝菌根真菌有助于植物體吸收更多的磷[28]，因此植物體為了維持體內氮磷比平衡，而在一定程度上仍然依賴于AMF。

凈氮礦化量以及凈氮礦化速率均受施氮和接種AMF處理的交互作用影響。有研究表明，高濃度的施氮有利于提高土壤供氮能力[29,31]。但本試驗結果顯示，在未接種AMF處理中，施氮量為184 mg/kg時凈氮礦化量顯著低于92 mg/kg施氮處理(P<0.05)，過多的氮添加并沒有對濱海鹽土的供氮能力產生積極作用。另有學者通過相關研究也得出類似結論[31-32]，但針對這一現(xiàn)象的解釋卻不盡相同。例如，張璐等[33]認為高氮添加由于其鹽效應降低了土壤pH，從而抑制氮素的礦化。而有外國學者認為,外源施氮促進了各種形式氮素的周轉速率,從而降低土壤的礦化潛力[34]。本研究供試土壤為濱海鹽土，過量的氮添加與土壤的鹽分可能產生交互作用，在盆栽期間加重了鹽分對植物的脅迫，從而阻礙了氮素的轉移。因此，后續(xù)的土壤培養(yǎng)試驗過程中，表現(xiàn)出高氮肥對氮礦化量的抑制作用。適宜的氮素施用量是促進濱海鹽土氮礦化能力的重要影響因素。

施氮對耐鹽植物的菌根侵染率有極顯著的促進作用(P<0.01)。施氮量為92 mg/kg時,菌根侵染率達到45.22%；施氮量為184 mg/kg時菌根侵染率僅有32.44%。在鹽土條件下，過多的氮添加反而抑制叢枝菌根真菌與植物共生關系的建立。更高的菌根侵染率導致植物對銨態(tài)氮更多的吸收，在培養(yǎng)初期(1 d)，低氮處理下的銨態(tài)氮含量顯著低于不施氮和高氮處理(P<0.05)。在培養(yǎng)1和3 d時，相同接種處理下，高氮處理的硝態(tài)氮含量顯著高于低氮以及不施氮處理(P<0.05)，相同施氮水平下，接種AMF處理的硝態(tài)氮含量均顯著高于不接種處理(P<0.05)。未接種AMF時，高氮處理的凈氮礦化量低于低氮處理，過高的氮添加并沒有對鹽堿土的供氮能力產生積極作用。

在氮礦化過程中，硝化作用除了受到接種處理的影響，同時也受施氮和接種處理的交互作用；施氮和接種處理對氨化作用表現(xiàn)出顯著影響(P<0.001)，但并未對其產生交互作用；凈氮礦化量和凈氮礦化速率僅受交互作用影響。適宜的施氮量是提高濱海鹽土氮素利用效率以及氮礦化潛力的重要舉措，接種叢枝菌根真菌能有效提高濱海鹽土氮素利用效率。