元寶楓組織培養(yǎng)及快速繁殖技術研究

馬秋月，李倩中，李淑順，朱 璐，顏坤元，李淑嫻，張 斌，聞 婧*

(1.江蘇省農業(yè)科學院休閑農業(yè)研究所，江蘇 南京 210014；2.南京林業(yè)大學，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

元寶楓(AcertruncatumBunge)為槭屬(Acer)落葉小喬木，樹高8～13 m，主要分布于我國的黃河流域，以及東北、內蒙古、江蘇、安徽等地區(qū)[1]，為我國園林綠化的主要樹種之一。元寶楓還是一種多用途的木本油料樹種，種仁中含油脂約48%、蛋白質25%～27%，種皮含單寧可達60%，葉中還含有黃酮、綠原酸、強心苷等多種活性物質[2-3]；其油脂的脂肪酸組成中含有5%～6%的神經酸，神經酸是世界公認的能修復、疏通受損大腦神經纖維并促使神經細胞再生的有效物質，幫助治療腦中風后遺癥、腦萎縮、老年癡呆癥等世界性疾病的潛力巨大[4-7]。元寶楓油于2011年被中華人民共和國衛(wèi)生部批準為新資源食品，2017年被國家林業(yè)和草原局確定為珍貴木本油料樹種，江蘇省將其列入珍貴彩色樹種名錄。因此，開展集觀賞及藥食同源于一體的元寶楓優(yōu)良種質的規(guī)?；缂夹g研究意義重大。目前，元寶楓常規(guī)生產主要以播種或嫁接方式繁殖為主，關于元寶楓繁育技術的研究相對較少。于震宇[8]曾進行了元寶楓的愈傷組織誘導培養(yǎng)；李艷菊等[9]于2005年在元寶楓的組培快繁方面取得了一定進展，但有關組培成苗的報道鮮見。以往常規(guī)的播種或嫁接繁殖過程發(fā)現(xiàn)，種苗質量受繁殖材料的影響會出現(xiàn)品質退化或病蟲害積累等問題，種苗繁殖受季節(jié)影響很大，優(yōu)良遺傳性狀難以保持穩(wěn)定，導致良種推廣種植受到極大限制。實踐表明，對于重要樹種，利用組培快繁技術能在短期內快速成苗[10]。為此，以元寶楓1年生莖段為試驗材料，通過對外植體采集時間、外植體的消毒時間、腋芽誘導和生根培養(yǎng)基的配方篩選及優(yōu)化，建立元寶楓離體培養(yǎng)成苗快速繁殖體系，以期為元寶楓優(yōu)良種質的栽培規(guī)模化及產業(yè)化提供科學依據及技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料來源及外植體處理

選擇不同時期(5、7和9月)健壯、無病蟲害的元寶楓優(yōu)良植株(大田和溫室盆栽)，以當年生枝條為供試材料，植株來自南京市溧水區(qū)江蘇省槭樹良種基地和江蘇省農業(yè)科學院溫室盆栽，外植體為帶芽莖段。

處理方法：將外植體切割成2～3 cm的帶芽莖段，用0.05%的洗衣粉溶液清洗表面2 min，再用無菌水清洗至洗衣粉溶液洗脫干凈。在超凈工作臺上，按照體積分數(shù)75%乙醇(處理時間10、20、30 s)和質量分數(shù)0.1%的HgCl2(處理時間120、180、240 s)不同組合的混合處理進行充分振蕩滅菌，每個組合經處理后均用無菌水清洗5次，并置于無菌紙上，吸干表面水分，將完成滅菌的外植體接種于腋芽誘導培養(yǎng)基中。所有的培養(yǎng)基pH均為5.8，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃，光照度為2 000 lx，每天光照12 h。

1.2 元寶楓莖段腋芽誘導的培養(yǎng)

選取經過滅菌處理后長勢一致的莖段接種到腋芽誘導培養(yǎng)基，以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69(購自北京酷來搏科技有限公司)為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質量濃度的IBA(0、0.2和0.4 mg/L)和30 g/L蔗糖的固體培養(yǎng)基中，共12個處理組合，每個處理接種30個外植體，重復3次，10 d后觀察并統(tǒng)計外植體的出芽率和污染率。其中：污染率=(污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%，死亡率=(死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%，成活率=(移栽成活的株數(shù)/移栽的總株數(shù))×100%，出芽率=(出芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

1.3 有效苗培育和生根培養(yǎng)

當腋芽誘導后獲得的無菌芽苗約0.5 cm時，將其切下轉入生根誘導培養(yǎng)基，以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69為基本培養(yǎng)基，在每種基本培養(yǎng)基中分別添加不同質量濃度的IBA(0.2、0.4和0.6 mg/L)和15 g/L的蔗糖，每個處理接種30個外植體，重復3次，共12個處理組合。于25 d后觀察記錄結果，并統(tǒng)計生根率、根數(shù)及根系生長狀況(分為長勢最好、長勢一般、長勢稍差)。

1.4 煉苗及移栽

打開已生根且生長健壯的元寶楓苗組培瓶封口膜，在培養(yǎng)室中進行環(huán)境適應性鍛煉7 d后，將組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，用清水將培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽至苗缽中，其中基質泥炭土、珍珠巖、蛭石體積比為7∶2∶1，且基質在移栽1周前用20%的多菌靈溶液消毒，移栽后進行常規(guī)管理。

1.5 數(shù)據處理

試驗所有數(shù)據在Excel 2020中整理，以平均值±標準誤表示，采用SPSS 22.0軟件進行One-way ANOVA分析，利用LSD進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同處理方法對外植體滅菌效果的影響

不同處理和不同消毒時間對元寶楓外植體的污染和死亡造成了明顯的影響(表1)。其中處理1的污染率顯著高于其他處理(P<0.01)，成活率只有4.1%；隨著處理時間的延長，污染率逐漸降低，成活率有所提高。從污染率來看，本研究中經過75%乙醇滅菌30 s+0.1%HgCl2滅菌240 s(處理9)的效果最佳，成活率為61.9%。同時可以看出，隨著HgCl2滅菌時間的增加，元寶楓外植體的成活率反而降低，說明過長時間的HgCl2處理會對植物組織產生一定的毒害作用，從而影響其正常生長，甚至會導致死亡。因此綜合考慮外植體的污染率和成活率，外植體的最適消毒時間為：75%乙醇滅菌30 s+0.1%HgCl2滅菌180 s。

表1 不同處理對外植體滅菌效果的影響Table 1 Effects of different disinfection methods on explants

為進一步研究不同時期及不同立地環(huán)境采集外植體對滅菌效果的影響，在不同季節(jié)(5、7和9月)以及不同立地環(huán)境(大田植株和溫室盆栽苗)采集外植體，經過75%乙醇滅菌30 s及0.1%HgCl2滅菌180 s后比較不同處理間的污染率情況，結果(表2)顯示：5月采集的外植體污染率最低，且大田植株和溫室盆栽苗外植體污染率差異不大；7月的大田污染率要略高于溫室盆栽外植體；9月大田植株的外植體與室內盆栽污染率差異極其顯著，室外大田污染率高達94.4%，而室內盆栽為31.1%，說明7月份以后更適合在室內采集元寶楓外植體。

表2 不同時期采集外植體對污染率的影響Table 2 Effects of pollution rate of explants collected in different periods

2.2 基本培養(yǎng)基和外源激素對腋芽誘導的影響

以1/2 MS、MS、1/2 NN69、NN69為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的IBA對元寶楓腋芽或頂芽的誘導有顯著影響(表3、圖1)。

表3 不同培養(yǎng)基和外源激素對腋芽誘導的影響Table 3 Effects of different culture mediums and exogenous hormones on cluster bud

A.元寶楓莖段stem segment of A.truncatum；B.腋芽的誘導induce axillary buds；C1-C2.生根的組培苗rooting of tissue culture seedling；D.移栽成活的組培苗tissue culture seedlings were transplanted。圖1 元寶楓腋芽的誘導與生根Fig.1 Axillary buds and root induction of Acer truncatum

由表3可見，添加0.2 mg/L IBA和0.4 mg/L IBA處理的芽誘導率較高，均在85%以上，且不定芽生長良好，15 d后就可看到翠綠葉片(圖1B)，但是不同的基本培養(yǎng)基誘導腋芽出芽及展葉時間差別較大，其中處理8培養(yǎng)基的效果最佳。大部分處理組合培養(yǎng)結果顯示，當IBA質量濃度為0.2 mg/L時，其誘導率高于未添加激素和0.4 mg/L的處理；誘導率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明添加過高濃度的IBA對元寶楓誘導芽起到抑制作用。比較12個處理可知，誘導元寶楓外植體產生腋芽的最佳培養(yǎng)基為：NN69+IBA(0.2 mg/L)。

2.3 不同基本培養(yǎng)基和外源激素IBA對元寶楓誘導生根的影響

將1～2 cm生長健壯的腋芽轉入生根誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d左右，在莖段基部接觸培養(yǎng)基處有根基凸起，形成根原基；15 d左右出現(xiàn)不定根，培養(yǎng)30 d后形成完整根系(圖1C1、1C2)。盡管每種處理的培養(yǎng)基均能不同程度地誘導元寶楓生根(表4)，但是當IBA的質量濃度為0.2～0.4 mg/L時，生根率隨著濃度的增加而增加，而質量濃度在0.4～0.6 mg/L時，生根率反而下降。通過不同基本培養(yǎng)基和不同濃度激素處理下對元寶楓組培苗生根效果進行顯著性分析表明：以1/2 NN69為基本培養(yǎng)基、IBA質量濃度為0.4 mg/L時生根率最高，可達87.8%，且根系生長發(fā)達，平均根數(shù)也最多。因此基于生根率、生根數(shù)以及根系生長狀況綜合分析認為，1/2 NN69+ IBA(0.4 mg/L)是誘導元寶楓生根的最適宜配方組合。

表4 不同培養(yǎng)基和外源激素對生根的影響Table 4 The effects of different culture mediums and hormones on rooting

2.4 元寶楓組培苗的煉苗與移栽

將經過7 d煉苗后生長健壯的組培苗從培養(yǎng)瓶中取出，用無菌水清洗根部培養(yǎng)基后移入泥炭、珍珠巖、蛭石體積比為7∶2∶1的基質(經過20%的多菌靈溶液消毒)中進行移栽，保持中等濕度，苗長成活率達95.0%以上。

3 討 論

3.1 元寶楓外植體取材時間及方式

外植體的表面滅菌是組織培養(yǎng)中至關重要的一步[11]，且不同植物不同部位的外植體對消毒劑的敏感程度也不同。關于元寶楓的組織培養(yǎng)技術，李艷菊等[9]以不同樹齡和不同季節(jié)的元寶楓大田苗外植體為材料進行組培，發(fā)現(xiàn)外植體對組培苗的污染率和存活率會產生很大影響。本研究除采集室外大田材料，同時以溫室盆栽材料為對照，比較不同的外植體滅菌處理方式對不同時期、不同采集地點元寶楓組織培養(yǎng)過程污染率及成活率的影響，研究發(fā)現(xiàn)HgCl2滅菌的時間過長或過短都會影響元寶楓的成活率，這與高盆櫻桃(Cerasuscerasoides)[12]、牛樟(Cinnamomumkanehirae)[13]、狹葉黃芩(Scutellariaregeliana)[14]等材料組培效果相近。但本研究中發(fā)現(xiàn)9月左右在室外大田采集外植體，元寶楓組培污染率極高，這可能與室外高溫潮濕、雜菌和灰塵較多，容易通過皮孔或傷口進入植物體內部，造成內生菌寄生有關[13,15-16]，但該時期室內采集的效果較好，污染率較低。

3.2 基本培養(yǎng)基及外源生長調節(jié)劑IBA對元寶楓組織培養(yǎng)的影響

不同植物由于遺傳背景及生物學特性有一定的差異，因此對基本培養(yǎng)基各類營養(yǎng)成分的需求也有很大差別，同時外源生長調節(jié)劑的合理配比對不定芽的誘導以及增殖、生根等尤為重要[17]。已有研究發(fā)現(xiàn)槭樹科內不同的種之間差異較大，如：李艷敏等[18]發(fā)現(xiàn)WPM基本培養(yǎng)基與IBA組合，更適宜金葉復葉槭(Acernegundo‘Aurea’)的增殖與生根生長；李巖巖[19]發(fā)現(xiàn)在1/2 MS基本培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L的IBA對茶條槭(Acerginnalum)的生根有很好的效果；顧地周等[20]在MS培養(yǎng)基中添加KT和IBA外源激素對誘導生根效果明顯；而李艷菊等[9]的研究結果顯示，在MS培養(yǎng)基中添加適宜濃度的TDZ和IBA可有效促進元寶楓外植體的增殖和生長。

IBA是組培苗不定芽和根的誘導中常用的生長調節(jié)劑[21-22]，本研究以1/2 MS、1/2 NN69、MS和NN69為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的IBA對元寶楓進行腋芽和生根誘導培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)4種培養(yǎng)基配合不同濃度IBA均可誘導腋芽生長，但誘導時間差異較大，其中以NN69中添加0.2 mg/L IBA誘導率最高，時間最短。同樣，組培苗的生根能力強弱及根系的生長狀況也直接影響植株的移栽成活率[14]。本研究表明，在1/2 NN69的基本培養(yǎng)基中添加0.4 mg/L的IBA時外植體生根效果最好，生根率可達87.8%，且根系健壯，移栽成活率可達95.0%；但IBA濃度過高或過低均未較好地促進根的誘導，類似現(xiàn)象在其他植物組織培養(yǎng)中也常見[12-14,23-24]。

目前，元寶楓的種苗繁育主要以播種、扦插或嫁接技術繁殖為主，但存在受季節(jié)影響或優(yōu)良特性難以穩(wěn)定保存的問題。本研究以元寶楓莖段為外植體，篩選適宜元寶楓不定芽及生根的最優(yōu)培養(yǎng)基，建立了一套從元寶楓無菌外植體、腋芽誘導和生根誘導及煉苗移栽的元寶楓組培快繁體系，為短時間內繁育大量元寶楓優(yōu)良株系以及推廣應用提供了重要技術支撐和理論保障，也可為后期元寶楓再生遺傳轉化體系的建立提供技術參考。