膀胱癌O⁶_-甲基鳥嘌呤-DNA轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子甲基化及其臨床意義

劉曉麗 單曉輝 王桃霞 馮淑寧 王曉英 段小婷 李桂英

[摘要] 目的 研究膀胱癌O6-甲基鳥嘌呤-DNA轉(zhuǎn)移酶（MGMT）基因啟動(dòng)子甲基化情況，探討其與臨床病理特征間的關(guān)系及臨床意義。 方法 選取2010年1月～2012年1月于河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院就診并行手術(shù)切除治療的膀胱癌患者93例，選取同期就診且經(jīng)膀胱鏡檢查證實(shí)無膀胱腫瘤的47例患者作為對照。應(yīng)用甲基化特異聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測膀胱癌組織和正常膀胱黏膜組織中MGMT基因甲基化狀況。統(tǒng)計(jì)分析MGMT甲基化與臨床病理特點(diǎn)關(guān)系，Kaplan-Meier分析MGMT甲基化與患者預(yù)后間的關(guān)系。 結(jié)果 膀胱癌組織中MGMT相對甲基化程度明顯高于正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。MGMT甲基化與分期、分級相關(guān)（均P < 0.01），與年齡、性別、腫瘤大小、數(shù)目、形態(tài)及復(fù)發(fā)頻率無關(guān)（均P > 0.05）。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)甲基化組患者5年總體生存率明顯低于非甲基化組（均P > 0.05）。 結(jié)論 膀胱癌組織中MGMT基因甲基化水平明顯增高，MGMT甲基化與腫瘤分期、分級及不良預(yù)后有關(guān)，可作為判斷膀胱癌病情判斷及預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志，值得臨床關(guān)注。

[關(guān)鍵詞] 膀胱癌;O6-甲基鳥嘌呤-DNA轉(zhuǎn)移酶;甲基化;臨床意義

[中圖分類號] R737.14? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）03（b）-0022-04

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在我國泌尿系腫瘤中排在第一位，死亡率較高[1]。病理類型包括移行細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、小細(xì)胞癌等。膀胱癌的發(fā)病機(jī)制與癌基因激活及抑癌基因的失活有關(guān)[2]，導(dǎo)致細(xì)胞正常生長和死亡調(diào)控機(jī)制異常，細(xì)胞無限增殖。近年來膀胱癌的發(fā)病機(jī)制研究雖有很大進(jìn)展，但目前仍無法有效預(yù)測和阻止腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的發(fā)生，因此需對膀胱癌發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步研究。尋找腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)標(biāo)志物及有效藥物治療靶點(diǎn)是近年來的研究熱點(diǎn)[3]，O6-甲基鳥嘌呤-DNA轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT），是一種高效的DNA修復(fù)酶，可以修復(fù)DNA中損傷的6氧甲基鳥嘌呤。MGMT基因是一種抑癌基因，研究[4]表明MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)富含CpG區(qū)甲基化是該抑癌基因失活的機(jī)制之一，并與膀胱癌的惡性生物學(xué)行為相關(guān)，其有希望成為判斷膀胱癌預(yù)后的分子生物學(xué)標(biāo)志物。本研究對膀胱癌組織中MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化進(jìn)行分析，并探討其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月～2012年1月于河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）就診并行手術(shù)切除治療的膀胱癌患者93例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次發(fā)現(xiàn)膀胱癌，術(shù)后組織病理學(xué)檢查明確診斷為膀胱細(xì)胞癌。②未接受手術(shù)、放化療等腫瘤治療。③所有患者或其家屬對本研究均已知情同意，且簽署知情同意書。④病歷資料齊全，均完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫系統(tǒng)疾病者。②合并全身嚴(yán)重感染等嚴(yán)重疾病者。③合并其他惡性腫瘤。在入選的93例患者中男70例，女23例;年齡29～82歲，平均（39.63±9.70）歲;年齡≤60歲40例，>60歲53例;病理分級：其中高分化33例，中低分化60例;分期標(biāo)準(zhǔn)參照國際抗癌聯(lián)盟2009年TNM分期系統(tǒng)[5]：肌層浸潤69例，非肌層浸潤24例;腫瘤單發(fā)43例，多發(fā)50例;腫瘤直徑≤3 cm者68例，直徑>3 cm者25例;乳頭狀腫瘤70例，非乳頭狀腫瘤23例;術(shù)后定期查尿脫落細(xì)胞、膀胱鏡檢查判斷有無腫瘤復(fù)發(fā)，其中無復(fù)發(fā)60例，有復(fù)發(fā)33例。所有患者術(shù)后隨訪1～60個(gè)月，平均（47.6±8.7）個(gè)月，以門診或電子通訊方式，隨訪至死亡或隨訪時(shí)間結(jié)束（截至2017年1月）。對照人群選取同期就診并接受外科手術(shù)治療，且經(jīng)膀胱鏡證實(shí)無膀胱腫瘤的患者，良性前列腺增生患者32例，膀胱結(jié)石15例，共47例，其中男17例，女30例;年齡30～82歲，平均（38.89±9.81）歲;年齡≤60歲23例，>60歲24例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 MGMT甲基化表達(dá)檢測

提取與純化石蠟包埋組織DNA，依據(jù)QIA mp Mini Kit試劑盒（美國Qiagen公司，27104）說明書進(jìn)行，然后應(yīng)用亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA，操作按照EZ DNA Methylation-Gold Kit說明書（美國ZYMO RESEARCH公司，D5005）進(jìn)行，以將DNA中尚未甲基化的胞嘧啶（C）修飾為尿嘧啶（U）。甲基化特異PCR：引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成，MGMT基因甲基化引物正義鏈序列：5′-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3′，反義鏈序列：5′-GCACTCTCCGA-AAACGAAACG-3′，MGMT基因非甲基化引物正義鏈序列：5′-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3′，反義鏈序列：5′-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAA-AACA -3′。反應(yīng)體系根據(jù)PCR反應(yīng)試劑盒說明（美國Fermentas公司）進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，程序?yàn)?5℃變性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s;72℃延伸10 min，4℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL反應(yīng)產(chǎn)物，應(yīng)用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以去離子水為陰性對照，應(yīng)用成像分析系統(tǒng)照相。根據(jù)DNA條帶判斷結(jié)果：①判斷甲基化陽性：M引物擴(kuò)增出目的條帶，而U引物未擴(kuò)增出或未擴(kuò)增出目的條帶。②判斷甲基化陰性：U引物擴(kuò)增出目的條帶，M引物未擴(kuò)增出目的條帶。用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算出各條帶密度值，計(jì)算同一標(biāo)本的甲基化條帶/非甲基化條帶密度值，得出標(biāo)本的相對甲基化程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);Kaplan-Meier生存分析（Log-rank檢驗(yàn)）評價(jià)MGMT基因甲基化對生存率影響。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MGMT甲基化情況及比較

47例正常膀胱黏膜組織MGMT均未發(fā)現(xiàn)甲基化，樣本僅見非甲基化條帶;93例膀胱細(xì)胞癌組織中60例出現(xiàn)甲基化，可見甲基化與非甲基化兩條條帶或甲基化一條條帶，33例僅見非甲基化條帶。膀胱細(xì)胞癌組織MGMT相對甲基化程度明顯高于正常膀胱黏膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。

2.2 膀胱癌組織MGMT甲基化與臨床病理特點(diǎn)關(guān)系

MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與年齡、性別、腫瘤大小、數(shù)目、形態(tài)及復(fù)發(fā)無關(guān)（均P > 0.05），與腫瘤分期、分級有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見表1。

2.3 Kaplan-Meier生存曲線分析MGMT甲基化對患者預(yù)后影響

93例膀胱癌患者隨訪至術(shù)后5年，Kaplan-Meier生存分析（Log-rank檢驗(yàn)）發(fā)現(xiàn)，MGMT未甲基化患者的5年總生存率顯著高于MGMT甲基化患者5年總生存率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（？字2=7.351，P = 0.004）。

3 討論

目前膀胱癌的主要治療方式包括手術(shù)、化療等，但不能達(dá)到治愈目的，對術(shù)后出現(xiàn)腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后較差。膀胱癌復(fù)發(fā)和進(jìn)展的危險(xiǎn)因素包括腫瘤分期、分級、大小、復(fù)發(fā)頻率等，但均無法準(zhǔn)確預(yù)測腫瘤的生物學(xué)行為及評估預(yù)后。因而人們希望尋找新的分子生物標(biāo)志。研究[6-8]發(fā)現(xiàn)，多種人類腫瘤組織，如膀胱癌、肺癌、膠質(zhì)瘤、結(jié)直腸癌等，均存在MGMT啟動(dòng)子異常甲基化現(xiàn)象，其與腫瘤發(fā)生、增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)。Jahed等[9]在非肌層浸潤膀胱癌研究中發(fā)現(xiàn)，45%癌組織MGMT發(fā)生甲基化，復(fù)發(fā)的癌組織MGMT甲基化高達(dá)92.5%，MGMT甲基化與腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Bilgrami等[10]研究發(fā)現(xiàn)MGMT甲基化與低分化肌層浸潤膀胱癌關(guān)系密切，可作為評價(jià)膀胱癌侵襲性的標(biāo)志。此外，DNA甲基化修飾多發(fā)生于腫瘤的早期階段，血液、尿液和唾液等標(biāo)本中分子標(biāo)志水平異?？捎糜谀[瘤早期診斷，減少不必要的膀胱鏡檢查及活檢[11]。國外學(xué)者[10]在膀胱癌患者血清標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)MGMT甲基化，且認(rèn)為其與癌組織中MGMT甲基化水平密切相關(guān)。亦有學(xué)者[12]觀察到膀胱癌患者尿液標(biāo)本中MGMT甲基化水平升高。這些研究有助于膀胱癌早期無創(chuàng)檢測。

MGMT是一種抑癌基因，定位于人類染色體10q26，其編碼的MGMT蛋白包含207個(gè)氨基酸長度，是一種DNA修復(fù)酶。MGMT基因表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)CpG島的特殊位點(diǎn)調(diào)控，啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化使其活力部位與底物甲基結(jié)合后喪失活性，導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活。國外學(xué)者[13]報(bào)道顯示，非肌層浸潤膀胱癌和肌層浸潤膀胱癌均存在MGMT基因異常高甲基化，且在高級別、肌層浸潤膀胱癌中更為常見。非肌層浸潤膀胱癌MGMT啟動(dòng)子的異常高甲基化與腫瘤復(fù)發(fā)、進(jìn)展和較短的整體生存時(shí)間有關(guān)[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，93例膀胱細(xì)胞癌組織中，60例出現(xiàn)MGMT甲基化，MGMT甲基化與膀胱癌分期、分級相關(guān)，且多見于中低分化、肌層浸潤腫瘤組織中，提示MGMT甲基化在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，MGMT甲基化可作為膀胱癌惡性行為的生物標(biāo)志。其作用機(jī)制可能是膀胱癌組織中MGMT基因啟動(dòng)子通過發(fā)生甲基化，導(dǎo)致表達(dá)沉默，從而使其對腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用受到抑制[17-18]。本研究對93例膀胱癌患者術(shù)后5年隨訪中發(fā)現(xiàn)，MGMT甲基化組患者的總體生存率明顯低于未甲基化組患者，提示MGMT甲基化提示膀胱癌患者不良預(yù)后，與文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道一致可能與發(fā)生MGMT甲基化的膀胱癌多為中低分化、肌層浸潤腫瘤有關(guān)。

綜上所述，MGMT基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，MGMT甲基化可作為預(yù)測膀胱癌不良預(yù)后的分子標(biāo)志，MGMT甲基化檢測可能成為膀胱癌診斷和預(yù)后的重要手段，有助于新的膀胱癌預(yù)后的評估體系的建立以及作為抗腫瘤藥物研發(fā)的治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2018-10-10? 本文編輯：封? ?華）