香樟精油抑制灰綠曲霉的活性與機理研究

陳可欣 駱鄭航 李 玲 顧玉婷 袁 康 胡振陽 都立輝

(南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇省糧油品質(zhì)控制及深加工技術(shù)重點實驗室，南京 210023)

我國是糧食生產(chǎn)大國，然而每年有近3%的糧食因霉菌污染而浪費[1]。霉菌是影響糧食安全儲藏的重要因素之一，糧食受到霉菌侵染后，會霉?fàn)€腐敗而產(chǎn)生霉、酸、腐臭等難聞氣味，不僅降低了糧食品質(zhì)，給我國農(nóng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，還會給消費者的健康安全帶來隱患[2，3]。

化學(xué)農(nóng)藥因其毒性較大，污染環(huán)境等弊端受到消費者排斥[4]。而與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥的有效成分是天然產(chǎn)物，使用后易分解為無毒物質(zhì)，對人體危害小，對環(huán)境無污染，有較好的應(yīng)用前景[5]。

隨著人們健康與環(huán)保意識增強，天然植物精油在食品行業(yè)中的應(yīng)用已經(jīng)成為近年來的研究熱點。植物精油 (essential oils) 是植物不同組織中一類次生物質(zhì)，由分子量較小的簡單化合物組成，是一類易揮發(fā)、有強烈的芳香氣味的油狀液體[6]。香樟精油是從香樟葉 (Cinamomumcamphora)中提取的活性物質(zhì)，主要成分為α-松油醇、β-松油醇、樟腦烯、檸檬烴和丁香油酚等[7，8]。植物精油中的活性物質(zhì)通過不同方式發(fā)揮作用，因而起到廣譜的抑菌效果[9]。香樟精油已廣泛應(yīng)用于香精香料、精細化學(xué)品合成、藥物合成、日用化工等領(lǐng)域，相關(guān)研究及開發(fā)利用等工作由來已久[10]。現(xiàn)有的相關(guān)研究主要圍繞植物精油的抑菌機理、抑菌成分及檢測技術(shù)進行，并已取得一定成果，但香樟精油應(yīng)用于儲糧霉菌的研究較少，因此有必要對香樟精油作用于儲糧霉菌如灰綠曲霉的抑菌效果進一步研究[11，12]。

基于香樟精油在食品中微生物抑制領(lǐng)域的應(yīng)用，本試驗主要測定了香樟精油對灰綠曲霉的最小抑制濃度，研究不同濃度的香樟精油的抑菌活性，探討香樟精油抑制灰綠曲霉的抑菌機理，為香樟精油對灰綠曲霉的控制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰綠曲霉、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯(Potato Dextrose Broth，PDB)、香樟精油；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1酶標(biāo)儀，BSC-250隔水式恒溫培養(yǎng)箱，TM3000掃描電鏡，傅里葉紅外光譜，流式細胞儀BD FACSVerse，紫外分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

配置新鮮的PDA培養(yǎng)基，接種灰綠曲霉，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，挑取長勢良好的霉菌接種于新鮮的PDA培養(yǎng)基上，相同條件，重復(fù)三次。將培育好的霉菌接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培育3～5 d。將菌液與已滅菌的30%的甘油以體積比1∶1混合均勻，-70 ℃保存。使用菌種時，菌液解凍活化，取1%菌液接種于PDB培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，備用[13]。

孢子液的制備：在PDA培養(yǎng)基上接種灰綠曲霉，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用無菌水反復(fù)沖洗菌落表面，洗下孢子，用無菌紗布濾去菌絲，制得孢子懸浮液。充分振蕩混勻后，用血球計數(shù)板在顯微鏡下觀察計數(shù)。保存在4 ℃冰箱中，備用。

1.3.2 香樟精油對灰綠曲霉的最小抑菌濃度的測定

將適量香樟精油溶于5%的Tween-80水溶液中，得到初始濃度為16 μL/mL的精油溶液，通過二倍稀釋法得到精油濃度為8、4、2、1、0.5、0.25 μL/mL的體系。將計數(shù)后的菌液，取適量離心，并用不同濃度的精油溶液重懸，使得霉菌孢子濃度為105CFU/mL，以不加菌液的培養(yǎng)基作為陽性對照，以不加精油的菌液作為陰性對照。28 ℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、12、24、36、48、60、72 h和84 h時檢測不同濃度精油處理后霉菌的OD600值(在波長600 nm處測定樣品的光密度Optical density，OD600)，與陽性對照組OD600值相近的最小精油濃度為香樟精油對灰綠曲霉的最小抑菌濃度[14]。

1.3.3 香樟精油對灰綠曲霉最小殺菌濃度的測定

按上述方法，配制濃度為8、4、2、1、0.5 μL/mL的香樟精油，并調(diào)節(jié)灰綠曲霉孢子濃度為105CFU/mL，未經(jīng)精油處理的菌液作為空白對照，于恒溫振蕩箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，取50 μL經(jīng)精油處理的灰綠曲霉孢子液滴加在PDA培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察其生長情況，拍照記錄。

1.3.4 香樟精油抑制菌絲生長活性的測定

按上述方法，將灰綠曲霉孢子懸浮液按5×105CFU/mL的濃度分別接種于含有0.5、1、2 μL/mL不同濃度香樟精油的PDB培養(yǎng)基中，以精油未處理組樣品為對照組。于恒溫振蕩箱中28 ℃培養(yǎng)3 d后，收集菌絲體，于烘箱中60 ℃干燥至恒重，稱重其干基[15]；與對照組對比，計算菌絲生長的抑制率。公式如下：

菌絲抑制率=(WC-WS)/WC×100%

式中：WC為對照中的平均菌絲干重；WS為含有香樟精油的培養(yǎng)基中的平均菌絲干重。

1.3.5 香樟精油對孢子萌發(fā)的影響

將灰綠曲霉分別接種于PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃靜置培養(yǎng)，待其生長成熟后，用無菌水沖洗平板中菌絲，經(jīng)紗布過濾制得霉菌孢子懸浮液；離心收集孢子，分別用含有0、0.5、1、2 μL/mL濃度的香樟精油PDB培養(yǎng)液重懸霉菌孢子，使孢子的最終濃度為105CFU/mL，置于28 ℃恒溫孵育，并分別在6、9、12 h時在顯微鏡下觀察，當(dāng)孢子萌芽的長度比孢子直徑長時，即判定為孢子萌發(fā)，計算霉菌孢子萌發(fā)率。

1.3.6 香樟精油對灰綠曲霉質(zhì)膜中麥角固醇含量的影響

霉菌麥角固醇含量的測定方法如下：將霉菌孢子懸浮液按5×105CFU/mL的濃度接種于含0、0.5、1、2 μL/mL濃度香樟精油的PDB培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)5 d，無菌水沖洗菌絲體，并在濾紙上過濾收集，置于25%的KOH醇溶液中，在85 ℃下孵育4 h，加入2 mL無菌水和5 mL正庚烷后振蕩2 min后，將正庚烷層收集，并用UV-1700在230 nm至300 nm之間掃描。正庚烷層中麥角固醇(在282 nm)和麥角固醇的中間產(chǎn)物(脫氫麥角固醇在230 nm和282 nm)的存在導(dǎo)致了特征曲線。未經(jīng)精油處理的樣品為對照。麥角固醇含量的計算公式如下：

脫氫麥角固醇=(A230/518)/菌絲濕重

麥角固醇=(A282/290)/菌絲濕重-脫氫麥角固醇

式中：A230為230 nm處吸收峰的吸光度；A282為282 nm處吸收峰的吸光度。

1.3.7 掃描電子顯微鏡觀察香樟精油處理對灰綠曲霉形態(tài)的影響

按上述方法培養(yǎng)，取適量灰綠曲霉孢子液分別加入0、0.5、1、2 μL/mL濃度的香樟精油，將樣品于28 ℃培養(yǎng)24 h。取出孢子液離心(3 000 r/min，10 min)，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)重懸兩次，加入戊二醛溶液于4 ℃固定4 h。用不同濃度的酒精溶液(30%、50%、70%、90%、100%)梯度脫水，叔丁醇置換酒精，噴金后用掃描電子顯微鏡觀察[16]。

1.3.8 香樟精油處理對灰綠曲霉線粒體ATP酶活性的影響

根據(jù)上述方法收集 0、0.5、1、2 μL/mL濃度香樟精油處理的灰綠曲霉菌絲體，重懸于10 mL含有50 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)，1 mmol/LPMSF(苯基甲磺酰氟)的緩沖液中后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，以10 000 g離心30 min后用2%的葡萄糖溶液破壞細胞獲得線粒體，并以2 000 g離心5 min，然后以10 000 g離心30 min。將10%的線粒體重懸于緩沖液中并儲存于4 ℃?zhèn)溆?。使用ATP酶試劑盒(A016-1-1)檢測香樟精油處理霉菌中的線粒體ATP酶活性。

1.3.9 傅里葉紅外光譜對香樟精油處理灰綠曲霉菌絲體的測定

按上述方法培養(yǎng)，將生長成熟的灰綠曲霉，分別用0、0.5、1、2 μL/mL濃度的香樟精油處理，所有樣品均置于28 ℃培養(yǎng)24 h。離心(3 000 r/min，10 min)，用PBS重懸2次，30 ℃烘干。烘干后的樣品與光譜純溴化鉀按比例混勻，反復(fù)研磨制備成透明的薄膜壓入顆粒中。將薄片放在紅外光譜儀中進行紅外光譜檢測[17-19]。

1.3.10 流式細胞儀檢測香樟精油作用后灰綠曲霉細胞的死亡情況

按上述方法培養(yǎng)，取適量灰綠曲霉孢子液離心(9 000 r/min，3 min)，除去上清液，分別加入0、0.5、1、2 μL/mL濃度的香樟精油，振蕩混合，所有樣品均置于28 ℃培養(yǎng)24 h后離心，用PBS溶液沖洗，重懸兩次，過膜。加入1 μg/mL PI(Propidium Iodide)染液，于35 ℃避光保存30 min[20]。用流式細胞儀進行檢測。

1.3.11 實驗數(shù)據(jù)處理

本文中所有實驗均平行三次。運用SPSS 23.0軟件統(tǒng)計對試驗結(jié)果單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯方差分析(P<0.05)，采用Origin 2018軟件處理并繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟精油對灰綠曲霉的最小抑菌濃度(MIC)測定

通過MIC和MFC定性和定量評估香樟精油的抑菌活性，由圖1可以看出，不同濃度的香樟精油對灰綠曲霉具有良好的抑制效果。當(dāng)香樟精油濃度達到1 μL/mL時，灰綠曲霉呈現(xiàn)出與陽性對照類似的生長趨勢且為1 μL/mL，香樟精油處理后的菌體在600 nm下的吸光度與陰性對照相比無顯著性差異(P>0.05)，表明灰綠曲霉的MIC為1 μL/mL。

圖1 不同濃度香樟精油對灰綠曲霉的生長抑制作用

2.2 香樟精油對灰綠曲霉最小殺菌濃度測定

灰綠曲霉孢子經(jīng)不同體積濃度的香樟精油溶液處理后，孢子活力發(fā)生改變，在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長呈濃度依賴性抑制狀態(tài)。當(dāng)香樟精油的體積濃度為8倍MIC(8 μL/mL)及以上時，灰綠曲霉孢子在PDA培養(yǎng)基上不生長，由此可推測灰綠曲霉的最小殺菌濃度為8 μL/mL。

2.3 香樟精油抑制灰綠曲霉菌絲生長

隨香樟精油濃度的增加，灰綠曲霉的菌絲生長受到不同程度的抑制。如表1所示，經(jīng)過不同濃度(0、0.5、1和2 μL/mL)香樟精油處理3 d后其菌絲干重分別為0.47、0.26、0.16、0.09 g。與對照組比較，在0.5、1和2 μL/mL濃度精油對灰綠曲霉菌絲生長抑制率分別為23.32%、33.16%、66.58%、74.80%，經(jīng)0.5 μL/mL及以上濃度香樟精油處理后的菌絲干重呈現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

表1 灰綠曲霉經(jīng)不同濃度香樟精油處理的菌絲干重、麥角固醇及ATP酶活性變化

2.4 香樟精油抑制灰綠曲霉孢子萌發(fā)

如圖2所示，空白組灰綠曲霉的孢子萌發(fā)率在6、9、12 h時分別為43.33%、77.33%和96%，未受精油處理的灰綠曲霉孢子在12 h內(nèi)幾乎全部萌發(fā)。而不同濃度精油處理組(0.5、1、2 μL/mL)的霉菌孢子在6 h幾乎不萌發(fā)，1 μL/mL精油處理組的孢子萌發(fā)率在12 h時僅為27.33%，孢子萌發(fā)率受抑制效果顯著(P<0.05)。由此可見，當(dāng)灰綠曲霉孢子濃度為105CFU/mL時，0.5 μL/mL及以上濃度的香樟精油可有效抑制灰綠曲霉孢子萌發(fā)生長為菌絲體。

注：不同小寫字母表示不同處理之間差異達0.05顯著水平。圖2 不同濃度香樟精油對灰綠曲霉孢子萌發(fā)的影響

2.5 香樟精油抑制灰綠曲霉質(zhì)膜中麥角固醇的生成

麥角固醇是霉菌細胞膜的主要成分之一，麥角固醇含量是評價霉菌膜完整性的重要指標(biāo)之一。如表1所示，灰綠曲霉經(jīng)0、0.5、1、2 μL/mL濃度香樟精油處理后，灰綠曲霉質(zhì)膜中麥角固醇含量分別為814.41、220.10、155.06、131.90 μg/g。因此，當(dāng)香樟精油濃度達0.5 μL/mL及以上時，質(zhì)膜中麥角固醇含量顯著降低(P<0.05)，霉菌細胞膜的組分發(fā)生了變化。麥角固醇含量的降低，往往伴隨著細胞整體性被破壞和霉菌細胞膜通透性的改變。

2.6 掃描電鏡檢測香樟精油處理對灰綠曲霉菌體形態(tài)的影響

由圖3可知，空白對照組中灰綠曲霉的孢子形態(tài)完整，圓潤飽滿，表面平滑。而用0.5 μL/mL體積濃度的香樟精油處理后，灰綠曲霉表面變得不平整，產(chǎn)生褶皺與凹陷，表明灰綠曲霉的細胞膜受到一定損傷；當(dāng)濃度增加到1 μL/mL和2 μL/mL時，菌絲體形體遭嚴(yán)重破壞，扭曲變形。由此推測香樟精油導(dǎo)致菌絲體內(nèi)含物流出[21]。

圖3 掃描電鏡觀察不同濃度香樟精油處理后灰綠曲霉形態(tài)

2.7 香樟精油抑制灰綠曲霉ATP酶的活性

ATP酶可催化ATP分解為ADP和磷酸根離子，并在此過程中釋放能量，為細胞供能。如表1所示，經(jīng)過不同濃度(0、0.5、1、2 μL/mL)香樟精油處理3天后其菌絲體ATP酶活性分別為1.08、0.88、0.55和0.47 U/mgprot。隨香樟精油濃度的增加，灰綠曲霉線粒體ATP酶活性降低。與對照組比較，0.5、1、2 μL/mL濃度香樟精油處理對灰綠曲霉ATP酶活性的抑制率分別為18.11%、48.76%和56.83%。結(jié)果顯示，與對照組相比，處理組的線粒體ATP酶活性顯著降低(P<0.05)且各處理組間差異顯著(P<0.05)，表明0.5 μL/mL及以上濃度的香樟精油可顯著抑制灰綠曲霉的線粒體ATP酶活性(P<0.05)。ATP酶活性的降低可能會導(dǎo)致細胞內(nèi)供能不足，使霉菌生長代謝紊亂從而干擾霉菌正常生理活動。

2.8 紅外光譜檢測香樟精油處理對灰綠曲霉組成成分的影響

利用紅外光譜(FTIR)測定灰綠曲霉在香樟精油的作用下官能團變化情況，進一步了解其結(jié)構(gòu)性質(zhì)的改變。結(jié)合圖表分析可以看出，3 400 cm-1譜峰相對強度有所減小，說明灰綠曲霉結(jié)構(gòu)中羥基減少[25]；2 910 cm-1譜峰相對強度減小，說明甲基(—CH3)和亞甲基(—CH2)含量減小；1 650 cm-1譜峰強度有所減小，表明有機羧酸含量減小[26]；1 530 cm-1吸收峰強度減小，說明脂肪族化合物、木質(zhì)素以及碳水化合物的量減小。1 380 cm-1處吸收峰強度減小，表明氨基含量減??；1 250 cm-1譜峰減弱表明C—O、Si—O減?。? 050 cm-1譜峰強度減弱，表明纖維素有少量的降解[27]。因此，隨著香樟精油濃度升高，對灰綠曲霉作用增大，灰綠曲霉的組成物質(zhì)逐漸被消耗，樣品的光譜信息也隨之改變。

圖4 紅外光譜觀察經(jīng)不同濃度香樟精油處理后灰綠曲霉的表征變化

表2 ATR-FTIR光譜區(qū)的功能團特性[22-24]

2.9 流式細胞儀測定香樟精油對灰綠曲霉細胞膜完整性的影響

非通透性PI染液，不能穿透活細胞的細胞膜，只能穿過受損的細胞膜并對細胞核染色[28]。因此可用PI作為染液用流式細胞儀分析香樟精油對灰綠曲霉的膜完整性的影響[29，30]。由圖5可知，隨著香樟精油體積濃度提高，染色細胞增加，膜完整性破壞的程度也隨之呈依賴性升高[31]。經(jīng)過0.5倍MIC(0.5 μL/mL)的香樟精油處理后，灰綠曲霉的死亡細胞明顯增長，推測是由于正常菌體細胞的細胞壁和細胞膜的完整性發(fā)生變化，引起自身溶解和死亡所致[32，33]。

圖5 流式細胞儀測定香樟精油對灰綠曲霉細胞膜完整性的影響

3 結(jié)論

本研究通過最小抑菌濃度、最小殺菌濃度、孢子萌發(fā)和菌絲干重對香樟精油的抑菌能力進行檢測；通過麥角固醇含量、掃描電鏡檢測、線粒體ATP酶活性、紅外光譜和流式細胞術(shù)等實驗對香樟精油抑制灰綠曲霉的機理進行了探索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)香樟精油對灰綠曲霉有很好的抑菌效果，其最低抑菌濃度為1 μL/mL，最低殺菌濃度為8 μL/mL，菌絲生長受到抑制。經(jīng)0.5 μL/mL及更高濃度的香樟精油處理，灰綠曲霉菌落數(shù)顯著減少，灰綠曲霉孢子表面產(chǎn)生褶皺與凹陷，且與對照組相比差異明顯；隨香樟精油濃度提升，孢子萌發(fā)率顯著降低，孢子的凋亡情況也顯著增強，精油體積濃度越高，香樟精油抑制灰綠曲霉的效果越顯著。香樟精油處理后，灰綠曲霉細胞變形，霉菌表面明顯受損。且精油濃度越高，霉菌受到的損傷越嚴(yán)重，精油處理會改變霉菌細胞的完整性與膜滲透性。因此，香樟精油抑制灰綠曲霉的作用方式主要是降低質(zhì)膜中麥角固醇的含量，使細胞膜通透性增加，改變細胞膜內(nèi)外平衡；使線粒體ATP酶活性降低，破壞其表面結(jié)構(gòu)，最終達到抑菌效果。

綜上，香樟精油作為抑菌劑，可有效抑制灰綠曲霉，為精油作為天然抑菌劑應(yīng)用于糧食儲藏提供了理論依據(jù)。后續(xù)可進一步對香樟精油作用于不同類型的儲糧菌種以及復(fù)合精油的作用進行深入研究。