富硒大豆低聚肽的制備及其抗疲勞功能的研究

白海軍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319)

硒元素是一種具有較強(qiáng)抗氧化能力且人體所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素，它能夠有效預(yù)防癌癥、防治多種心腦血管慢性疾病[1]。由于硒元素在地殼中分布不均，部分國(guó)家或地區(qū)的人們會(huì)出現(xiàn)硒缺乏癥，需要通過(guò)膳食或藥物干預(yù)防治硒缺乏癥。除這部分人群外，研究表明競(jìng)技型運(yùn)動(dòng)員會(huì)由于長(zhǎng)期訓(xùn)練導(dǎo)致血硒含量降低，因而體力型勞動(dòng)從業(yè)者也需要服用硒補(bǔ)充劑，防止由缺硒所導(dǎo)致的疲勞氧化損傷從而緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞[2]。硒補(bǔ)充劑分兩大類：無(wú)機(jī)硒補(bǔ)充劑主要為硒酸鹽，它毒性較大、生物利用率低，而富含有機(jī)硒的富硒農(nóng)產(chǎn)品相較之下是一種安全、可靠適用人群更廣的硒營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充品[3]。富硒農(nóng)產(chǎn)品的生產(chǎn)主要在富硒土壤地區(qū)栽培作物，或是在栽培作物的過(guò)程中進(jìn)行葉面施灑無(wú)機(jī)硒肥料。大豆是一種可聚硒的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)植物資源，它能根據(jù)環(huán)境中無(wú)機(jī)硒的含量通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，并以硒結(jié)合蛋白的形式存在于大豆蛋白中[4]。高思薇等[5]研究發(fā)現(xiàn)，富硒大豆蛋白酶解后硒蛋白含量更高，在飼喂等量硒元素條件下富硒低聚肽能使血硒更快達(dá)到峰值。此外，大豆低聚肽易吸收且具有抗氧化、抗疲勞活性等，但它在原蛋白質(zhì)序列中并不能顯現(xiàn)出活性[6]。因而，通過(guò)酶解處理富硒大豆蛋白制備富硒大豆低聚肽，不但能夠促進(jìn)硒元素在小腸中的吸收，同時(shí)還能進(jìn)一步提高抗氧化、抗疲勞活性。

根據(jù)疲勞產(chǎn)生的“自由基理論”，機(jī)體疲勞的產(chǎn)生主要是由于體內(nèi)活性氧自由基的生成和清除速率失衡，致使活性氧蓄積機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而造成脂質(zhì)過(guò)氧化損傷等一系列副反應(yīng)，抗過(guò)氧化損傷是疲勞緩解與恢復(fù)的重要因素。研究表明硒是機(jī)體抗氧化物酶的重要組成，體現(xiàn)在硒蛋白參與構(gòu)成的酶中，作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性中心，主要以硒代半胱氨酸形式存在[7]。郭建軍[8]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期訓(xùn)練的小鼠在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)下硒元素能顯著提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，從而使機(jī)體抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力增強(qiáng)。劉丹等[9]發(fā)現(xiàn)富硒麥芽能夠延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于富硒大豆低聚肽的抗氧化活性研究較為充分，但其抗疲勞活性的相關(guān)研究并不完善，本實(shí)驗(yàn)擬采用富硒大豆為原料制備富硒大豆蛋白低聚肽，并通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜法對(duì)低聚肽中硒的含量、形態(tài)進(jìn)行測(cè)定，在此基礎(chǔ)上建立運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠模型，通過(guò)負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)以及肝糖原、肌糖原、血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、丙二醛生化指標(biāo)，對(duì)富硒大豆低聚肽的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞功能進(jìn)行研究，以期以富硒大豆低聚肽為原材料的抗疲勞類保健品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種雄性健康小鼠60只，個(gè)體質(zhì)量約(20±2.0)g，購(gòu)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及自由飲水，恒定濕度55%，室溫(25±1) ℃，自由進(jìn)食一周后應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2 材料與試劑

東升1號(hào)富硒大豆、中性蛋白酶(Neutrase)、風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)、PLBC07610millipore超濾膜-3 ku、生化指標(biāo)檢測(cè)試劑盒；其他所用試劑為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

BHS-2恒溫水浴鍋，7500c型電感耦合等離子體質(zhì)譜，LC-1200型液相色譜，F(xiàn)C酶標(biāo)儀，磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司，UV-2600紫外可見分光光度計(jì)，恒溫游泳池。

1.4 富硒大豆低聚肽的制備

1.4.1 富硒大豆蛋白的制備

富硒大豆蛋白的制備參考文獻(xiàn)[10]稍作修改，清理新鮮大豆后粉碎過(guò)80目篩網(wǎng)，用正己烷脫脂后將富硒大豆粉與去離子水溶解后，調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min去除上清液后調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0使蛋白質(zhì)沉淀溶解，冷凍干燥后于密封袋中-20 ℃保存。

1.4.2 富硒大豆低聚肽的制備

富硒大豆低聚肽的制備參考董硯博[11]的方法稍加修改，采用雙酶酶解法提高大豆低聚肽的產(chǎn)率，具體操作如下，配置5%的富硒大豆蛋白溶液，向溶液中加入中性蛋白酶(400 U/g)和風(fēng)味蛋白酶(200U/g)，在50 ℃下酶解3 h，滅酶后在4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min取上清液，超濾后冷凍干燥后于密封袋中-20 ℃保存。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白的測(cè)定》，采用微量凱氏定氮法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 硒含量的測(cè)定

總硒元素測(cè)定參考GB5009.268—2016。低聚肽中硒形態(tài)的測(cè)定采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法參考文獻(xiàn)[12]，將0.5 g的大豆低聚肽、2.0 mL的H2O2、10.0 mL的HNO3于消化管中充分混合，于微波消解儀中消化后定容至容量瓶中。進(jìn)樣體積10 μL，等度洗脫，流動(dòng)相A為95%水，流動(dòng)相B為5%甲醇，流速0.8 mL/min，洗脫時(shí)間20 min。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.6.1 動(dòng)物模型的建立

將60只健康雄性小鼠隨機(jī)分為6組，設(shè)立對(duì)照組、模型組、富硒大豆低聚肽低/高劑量組(SeP-L/H)、大豆低聚肽低/高劑量組(P-L/H)。采用灌胃法給予樣品容量均0.2 mL/d，模型組、對(duì)照組給予等量生理鹽水，大豆低聚肽劑量組分別設(shè)置為20、100 mg/(kgbw·d)兩個(gè)劑量組。動(dòng)物模型的建立如下：在實(shí)驗(yàn)第1周進(jìn)行適應(yīng)性游泳訓(xùn)練，除除模型組外，其余6組小鼠在第1周每日游泳訓(xùn)練10 min，第2周訓(xùn)練15 min，第3周負(fù)重自身體重5%訓(xùn)練至力竭，實(shí)驗(yàn)7 d為1周期，每隔6 d休息1 d，每周稱重，約21 d后小鼠出現(xiàn)動(dòng)作遲緩、鼠毛稀疏、食欲減退等典型運(yùn)動(dòng)性疲勞行為學(xué)異常狀況。

1.6.2 負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)

末次給予樣品30 min后，將小鼠置于(25±1)℃的恒溫游泳箱中，鼠尾根部負(fù)荷約體重5%的鉛皮，記錄小鼠自游泳開始至力竭的時(shí)間(min)。當(dāng)小鼠完全下沉至水面下超過(guò)10 s且撈出后無(wú)法完成翻正反射，即為力竭。

1.7 生化指標(biāo)檢測(cè)方法

在力竭游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即將小鼠斷頸處死，眼球取血并將采集到的新鮮血液于4℃靜置1 h后，在3 000 r/min條件下分離15 min取上層血清，肝組、肱四頭肌經(jīng)生理鹽水處理后搗碎處理成10%組織勻漿。肝糖原(LG)、肌糖原(LA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)含量嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定，剩余樣本保存于-70 ℃超低溫冰箱中備用。

1.8 統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示，多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn)，各組間多重比較采用LSD法，P≤0.05為差異有顯著性。采用Origin 2017軟件進(jìn)行圖表處理及圖譜分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒元素分析

經(jīng)微量凱氏定氮法計(jì)算，粉碎富硒大豆粉的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為46.73%，富硒大豆蛋白的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為88.32%。實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC-ICP-MS法對(duì)大豆分離蛋白以及低聚肽中元素硒含量進(jìn)行了測(cè)定，其中富硒大豆分離蛋白中硒元素含量為(76.39±1.09) μg/kg，大豆低聚肽的中元素硒含量為(90.03±3.23) μg/kg，主要形態(tài)硒為硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸。富硒大豆低聚肽總硒元素含量高于富硒大豆分離蛋白，可能是由于分子質(zhì)量為3 ku的富硒大豆低聚肽中所包含硒蛋白序列更多。 Khanam[13]研究發(fā)現(xiàn)硒代蛋氨酸和硒代半胱氨酸是谷物和豆類中硒的主要存在形式，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

圖1 ICP-MS色譜圖

2.2 負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)

小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的長(zhǎng)短是評(píng)價(jià)受試樣品抗疲勞能力的最直接指標(biāo)[14]。各組小鼠收拾前后體重的變化及小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間見表1，可以發(fā)現(xiàn)各組小鼠的體重在試驗(yàn)前后并未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，但在第三周模型組有個(gè)別小鼠死亡，但總樣本數(shù)大于8只，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與對(duì)照組相比模型組的負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)顯著降低(P<0.05)，說(shuō)明模型組出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)性疲勞癥狀；富硒大豆低聚肽低/高劑量組以及大豆低聚肽組低/高劑量與模型組相比負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P<0.05)，表明富硒大豆低聚肽與大豆低聚都具有一定的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞能力，富硒大豆低聚肽低劑量組與大豆低聚肽組高劑量負(fù)重游泳時(shí)間無(wú)顯著差異(P>0.05)，富硒大豆低聚肽高劑量組效果最佳，負(fù)重游泳時(shí)長(zhǎng)約提高了48.22%，表明富硒大豆低聚肽在高劑濃度下具有良好的抗運(yùn)動(dòng)性疲勞能力。

表1 小鼠體重變化及負(fù)重游泳時(shí)間

2.3 小鼠體內(nèi)生化指標(biāo)

機(jī)體在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，為了滿足機(jī)體能量代謝的需求氧化代謝強(qiáng)度必然大大增加，這就導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)的活性氧自由基的必然增加，由于測(cè)量血液和組織中自由基水平比較困難，而檢測(cè)血液和組織中抗氧化酶則相對(duì)簡(jiǎn)單，以此來(lái)間接反映機(jī)體內(nèi)自由基蓄積水平，從而判斷機(jī)體疲勞程度。

2.3.1 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶是氧自由基的唯一底酶，它廣泛存在于體細(xì)胞中，能過(guò)通過(guò)歧化反應(yīng)將活性氧自由基轉(zhuǎn)化成毒性相對(duì)較低的H2O2，從而起到基保護(hù)細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能完整性的作用[15]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組中超氧化物歧化酶的活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，從統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆低聚肽低劑量組SOD活性雖高于模型組但差異不顯著(P>0.05),富硒大豆低聚肽低劑量組與大豆低聚肽低劑量組無(wú)顯著差異(P>0.05)，但顯著高于模型組(P<0.05)，富硒大豆低聚肽高劑量組與大豆低聚肽高劑量組顯著高于模型組(P<0.05)，分別提高了28.42%、12.78%。

2.3.2 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶以谷胱甘肽為底物，其主要抗氧化機(jī)制是將體內(nèi)的H2O2高效還原成H2O，從而免受組織和細(xì)胞免受氧化損傷[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，富硒大豆低聚肽低劑量組與大豆低聚肽低劑量組與模型組相比未能顯著提高GSH-Px酶活性(P>0.05)，與大豆低聚肽高劑量組也無(wú)顯著差異(P>0.05)，但富硒大豆低聚肽高劑量組和大豆低聚肽高劑量組與模型組相比分別提高了23.85%和10.70%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。富硒大豆低聚肽中的硒代半胱氨酸能夠作為GSH-Px的活性中心，使GSH-Px活性的提高。此外，人體組織不能合成硒代蛋氨酸[17]，Navarro等[18]也發(fā)現(xiàn)硒代蛋氨酸也具有較好恢復(fù)GSH-Px活性的作用。

2.3.3 丙二醛

丙二醛的過(guò)量堆積會(huì)致使組織與細(xì)胞的過(guò)氧化損傷，它是一種由機(jī)體過(guò)剩自由基導(dǎo)致的不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，可用以評(píng)估自由基所引起的脂質(zhì)過(guò)氧化程度[19]。模型組小鼠血清中丙二醛的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，四組劑量組均能使小鼠血清中丙二醛的含量顯著低于模型組(P<0.05)，其中富硒低聚肽高劑量組MDA含量最低，脂質(zhì)抗過(guò)氧化能力最強(qiáng)，約降低了23.43%，表明富硒低聚肽在高劑量組下抗運(yùn)動(dòng)性疲勞效果良好。

表2 小鼠血清生化指標(biāo)

2.3.4 肌糖原與肝糖原的變化

研究表明由運(yùn)動(dòng)所導(dǎo)致的體力耗盡與肌糖原的消耗同步進(jìn)行，而為了維持運(yùn)動(dòng)狀態(tài)所需的血糖水平會(huì)逐漸消耗肝糖原，使肝糖原含量降低[20]。肌糖原與肝糖原的變化結(jié)果見表3，通過(guò)對(duì)照組與模型組小鼠運(yùn)動(dòng)后肝糖原和肌糖原含量可以發(fā)現(xiàn)，LA與LG的數(shù)據(jù)結(jié)果相似，運(yùn)動(dòng)性疲勞會(huì)導(dǎo)致小鼠肝糖原與肌糖原含量顯著降低(P<0.05)，四組劑量組均能夠使小鼠的肝糖原與肌糖原含量升高，但兩組低劑量組未能使LG和LA含量與模型組產(chǎn)生顯著性差異(P>0.05)，富硒低聚肽高劑量組LG和LA含量顯著高于其余三組劑量組。

表3 小鼠肌糖原及肝糖原

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)采用了超濾輔助雙酶酶解法制備了富硒大豆低聚肽，并在運(yùn)動(dòng)性疲勞小鼠模型下，采用負(fù)重力竭游泳實(shí)驗(yàn)以及相關(guān)生化指標(biāo)對(duì)四組劑量組的抗疲勞效果進(jìn)行評(píng)估。其中富硒大豆低聚肽高劑量組力竭游泳時(shí)間最長(zhǎng)約為(37.47±1.33)min，小鼠體內(nèi)血液生化指標(biāo)的結(jié)果總體顯示該劑量組具有最佳的抗氧化活性，這主要是由于攝入的硒元素能夠參與體內(nèi)抗氧化酶的合成，提高了抗氧化物酶的酶活，從而延緩了由于脂質(zhì)過(guò)氧化而產(chǎn)生的疲勞；肌糖原與肝糖原的含量表明該劑量組能使小鼠具有更高的糖原儲(chǔ)備，因而可以通過(guò)消耗更多糖原提供能量，從而提高了小鼠的抗疲勞能力。