不同溶劑提取穇子多酚的抗氧化性及對龍眼保鮮作用的研究

王嘉琪 王 樂 馬麗婭 李 彥 李赤翎

(長沙理工大學化學與食品工程學院1，長沙 410007) (內(nèi)蒙古紅太陽食品有限公司2，呼和浩特 010000)

龍眼(DimocarpusLongyanLour)，原產(chǎn)于我國南部地區(qū)，生長在南亞熱帶地區(qū)，喜溫暖濕潤氣候[1, 2]。龍眼在中醫(yī)上有很多功效，龍眼核中有大量的黃酮，具有抗氧化、抗心腦血管疾病、降糖降脂、調(diào)節(jié)免疫力等作用[3, 4]。目前，國內(nèi)外在龍眼保鮮研究方面都取得了明顯的效果。李少華等[5]發(fā)現(xiàn)氣調(diào)冷藏比普通冷藏具有更好的保鮮效果；李亞娜等[6]通過ε-PL/PVA復合膜對龍眼進行保鮮，提高了龍眼果實的好果率，抑制了果皮褐變指數(shù)和果肉自溶指數(shù)等；Viswanath等[7]研究了穇子多酚的抗菌作用,表明穇子多酚可以抑制金黃色葡萄球菌，腸膜亮腸球菌等微生物；邱瑞瑾等[8]研究了不同濃度的茶多酚溶液均可提高龍眼果實貯藏期間的好果率和可溶性固形物的含量。

穇子多酚具有較強的抗氧化性[9, 10]，且安全無污染無毒性，可以作為天然保鮮劑的良好來源。但穇子多酚應用于果蔬保鮮的研究鮮見報道，本研究通過比較不同溶劑提取穇子多酚的抗氧化性，選出具有較強抗氧化性的穇子多酚，將其與茶多酚和VC進行了保鮮效果比較，以探究穇子多酚的實際抑菌保鮮能力。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

穇子多酚；無水碳酸鈉(AR)、福林酚、水楊酸鈉(AR)、DPPH自由基、抗壞血酸(AR)、BHT、過氧化氫、鐵氰化鉀(AR)、三氯化鐵(AR)、茶多酚(純度90%以上)、氫氧化鈉、鹽酸、草酸、2,6-二氯酚靛酚。

1.2 儀器與設(shè)備

YP-B10001電子天平，AVY120電子分析天平，S22pc可見分光光度計，DELTA320 pH儀，YRE-2000B恒溫水浴鍋，BS-1E恒溫培養(yǎng)箱。

2 方法與過程

2.1 穇子多酚的制備

取粉碎過篩后的穇子皮，分別用甲醇、乙醇、酸性甲醇和酸性乙醇為提取溶劑，在80 ℃的恒溫水浴鍋中浸提50 min，抽濾，得到粗提液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對其進行濃縮，3 000 r/min離心10 min，取上清液，將上清液以2 mL/min的速度進行洗脫純化，用70%的乙醇進行洗脫，將收集的溶液進行旋蒸，真空冷凍干燥得到多酚樣品。

2.2 穇子多酚抗氧化活性的測定

2.2.1 清除DPPH自由基能力的測定

參考張赟彬[11]的方法略作修改，分別取不同質(zhì)量濃度的穇子多酚溶液與DPPH乙醇溶液充分混合，室溫下避光反應30 min，在517 nm處測定吸光度值(Ai)。超純水為空白對照(A0)，相同梯度的VC、BHT為陽性組，以同樣方法測定吸光度。按照(1)式計算DPPH自由基的清除能力。

ηDPPH=(1-Ai/A0) ×100%

(1)

2.2.2 鐵離子還原能力測定

分別取不同質(zhì)量濃度的穇子多酚溶液，PBS和鐵氰化鉀(1%)按順序加入并混勻，50 ℃恒溫水浴反應20 min，待冷卻至室溫后加入2.5 mL三氯乙酸(10%)，4 000 r/min離心10 min；取4.0 mL上清液和4.0 mL去離子水，再加入0.4 mL FeCl3溶液(0.1%)充分混勻，用去離子水調(diào)零。室溫下避光反應10 min，700 nm測定吸光度值。同濃度范圍的 VC、BHT 溶液為陽性對照組，以同樣方法測定吸光值。吸光度的高低表示穇子多酚物質(zhì)還原能力的強弱。

2.2.3 羥基自由基的清除能力

采用水楊酸法[12]進行測定，分別取用不同濃度的穇子多酚溶液，2.00 mL的水楊酸鈉(9 mmol/L)、2.0 mL的 FeSO4(9 mmol/L)和2.0 mL H2O2(0.01%)依次加入，混合均勻后恒溫水浴30 min。以去離子水調(diào)零，在520 nm測定其吸光度(A2)，以去離子水代替過氧化氫作為對比測定吸光度(A1)，以超純水為空白組測定吸光度大小(A0)。按照(2)計算羥基自由基清除能力(η·OH)。相同濃度梯度的 VC 和 BHT 作為對照組。

η·OH=[1-(A2-A1)/A0]×100%

(2)

2.3 穇子多酚保鮮作用的研究

2.3.1 實驗處理

2.3.1.1 配制溶液

將不同溶劑提取的穇子多酚溶液進行濃縮、冷凍干燥，再分別取不同溶劑提取的穇子多酚、茶多酚和VC，用超純水進行稀釋，分別得到10、20、30 mg/L的穇子多酚溶液，茶多酚和VC溶液。

2.3.1.2 樣品處理

設(shè)置對照(清水處理)和不同溶劑提取的穇子多酚溶液、茶多酚和VC進行處理，取質(zhì)量相同、形狀與生理狀態(tài)相似的龍眼，分別在不同溶劑提取的穇子多酚溶液、茶多酚溶液、VC溶液中浸泡10 min，取出，再按照不同處理組別，分別裝入塑料袋中，放置在25 ℃恒溫箱中，測量其質(zhì)量變化并觀察外形。

2.3.2 龍眼表形指數(shù)測定

2.3.2.1 失重率

失重率= (貯藏前果實質(zhì)量-貯藏后果實質(zhì)量)/貯藏前果實質(zhì)量×100%

2.3.2.2 腐爛率

袋中所處理的龍眼以果皮完好無損、手捏不軟、無褐變、無腐爛、不流汁為完好果實，剩余果實為腐爛果實，腐爛果實占所調(diào)查果實總數(shù)的百分比為腐爛率。

腐爛率=(腐爛果實數(shù)/調(diào)查果實數(shù))×100%

2.3.2.3 可滴定酸含量

采用酸堿中和滴定法測定。每次測定時，分別取經(jīng)過不同處理過的龍眼，去皮去核，將果肉榨汁，經(jīng)4層紗布過濾后，將果汁攪拌均勻，用0.005 mol/L的氫氧化鈉溶液進行滴定。

可滴定酸=(V×C×K/M)×100%

式中：V表示消耗氫氧化鈉的體積/L；C表示氫氧化鈉溶液的濃度/mol/L；K為蘋果酸換算系數(shù)(0.067)；M表示測定時的果汁質(zhì)量/g。

2.3.2.4 VC含量的測定

參考《生化實驗技術(shù)與實施教程》[13]，利用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定VC含量，分別取50 g經(jīng)過不同處理的龍眼，加入2%的草酸50 mL，榨汁過濾，攪拌均勻。分別吸取樣液10 mL，加入16 mL 1%的草酸溶液，用2,6-二氯酚靛酚溶液進行滴定，直至粉紅色出現(xiàn)且15 s不消失；另取10 mL1%的草酸做空白對照。計算每100 g樣品中抗壞血酸的量(mg/100 g)=[(V1-V2) ×K×V]/(V3×W)

式中：V1為滴定樣液所用染料的體積/mL；V2為滴定空白所用染料的體積/mL；V3為樣品測定時所用濾液的體積/mL；V為樣品提取液稀釋的總體積/mL；K為1 mL的2,6-二氯酚靛酚溶液所能氧化的抗壞血酸的量/mg/mL；W為10 mL的樣液相當于樣品的質(zhì)量。

2.3.2.5 還原糖含量的測定

取粉碎果肉1 g 于三角瓶中，加入30 mL 水，沸水浴浸提20 min，冷卻后定容至50 mL，過濾，留取濾液備用。試管中加樣液(即濾液)0.1 mL、DNS 試劑0.5 mL 和水0.4 mL，沸水中煮5 min，冷卻后加4 mL 水，以水代替樣液作對照，測定540 nm處的吸光度值。由標準曲線查得葡萄糖質(zhì)量，并計算濃度。

2.3.2.6 總糖含量的測定

取粉碎果肉1 g 于三角瓶中，加入10 mL 濃度為6 mol/L 的鹽酸，于沸水浴上浸提30 min，冷卻后用6 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，定容至50 mL，然后過濾，留取濾液備用?？偺呛康臏y定方法同還原糖。

2.3.3 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

每組實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016進行處理、計算，使用SPSS 22.0進行描述性統(tǒng)計分析，圖表采用Origin 9.0進行繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 穇子多酚的組分

采用Diamonsil C18色譜柱對4種不同溶劑提取的穇子多酚進行高效液相色譜分析，得到四種穇子多酚的含量及組分如表1。

表1 四種溶劑提取的穇子多酚物質(zhì)HPLC分析/mg/g

3.2 穇子多酚抗氧化活性的測定

3.2.1 清除DPPH自由基的能力

不同提取條件的穇子多酚和對照組VC、BHT清除DPPH自由基的能力如圖1所示。不同提取條件下的穇子多酚、VC和BHT清除DPPH自由基的能力，隨著濃度的上升而增強?？傮w來看，除酸性甲醇提取的多酚之外，其他3種多酚的清除能力均高于BHT，但都比VC的清除能力弱；其中酸性乙醇提取的多酚的清除效果最好，是因為多酚中含有酚酸，呈弱酸性，酸性條件下更易提取[14]。綜合來說，穇子多酚具有較好的抗氧化能力。

圖1 穇子多酚、BHT、VC對DPPH自由基的清除效果

3.2.2 還原能力的測定

由圖 2可知，4種不同溶劑提取的多酚樣品包括BHT和VC，在測定的濃度范圍內(nèi)的還原能力,隨著濃度升高逐漸加強。除甲醇提取的穇子多酚樣品的還原鐵離子能力大于VC，弱于BHT外，其他3種樣品均不如BHT、VC的還原能力，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是甲醇提取的穇子多酚更易釋放出氫與環(huán)境中的自由基相結(jié)合，從而終止了氧化反應的發(fā)生[15]。綜合來說，穇子多酚具有良好的還原鐵離子能力，即有較好的抗氧化活性。

圖2 穇子多酚、BHT、VC還原能力的測定

3.2.3 清除羥基自由基的能力

圖3為穇子多酚、BHT和VC清除羥基自由基的結(jié)果。4種多酚樣品包括BHT、VC，在整個濃度范圍內(nèi)，清除羥基自由基的效果隨著濃度的上升而增強?？傮w來說，4個樣品的羥基自由基清除率都不及VC和BHT，其中，酸性乙醇的消除能力在梯度范圍內(nèi)均高于其余3個樣品，且當其濃度增大到一定程度時，清除羥基自由基的能力已經(jīng)接近甚至超過BHT。由此看出，穇子多酚有較好的羥基自由基清除能力，有一定的抗氧化能力。

圖3 穇子多酚、BHT、VC清除羥基自由基能力的測定

3.3 穇子多酚保鮮作用的測定

3.3.1 失重率

即使龍眼果實被采摘，它們?nèi)跃哂幸欢ǖ纳砘顒?，會通過果皮呼吸，并因蒸氣壓差而引起水分損失[16]。由表2可知，不同溶劑提取多酚物質(zhì)處理的龍眼質(zhì)量變化的趨勢基本一致，質(zhì)量損失率隨著貯藏時間的增加逐漸變大。貯藏期間，經(jīng)過VC處理的龍眼失重率最少，顯著低于其他3種；經(jīng)過穇子多酚的處理中，又以酸性乙醇提取的穇子多酚處理后的龍眼較好，由表1可以看出，可能是由于酸性乙醇相較于酸性甲醇提取出較多的多酚活性物質(zhì)，保鮮效果較好。

表2 不同樣品失重率的變化/%

3.3.2 腐敗率

由表3可知，總體來說，隨著貯藏時間的增加，龍眼果實的腐敗率顯著上升。經(jīng)過4種不同處理后，VC處理的龍眼果實腐敗率顯著低于其他3種，隨著多酚濃度的增加，不同處理的龍眼腐敗率差異不顯著。整體來看，酸性乙醇提取的穇子多酚和酸性甲醇提取的穇子多酚處理的樣品,其防腐效果接近茶多酚和VC。因多酚中含有大量的酚酸，呈弱酸性[17]，因此在酸性條件下比較穩(wěn)定，表現(xiàn)出較好的活性，具有較好的保鮮能力。

表3 不同樣品腐敗率的變化/%

3.3.3 可滴定酸含量

由表4可得，龍眼果實在貯藏期間，可滴定酸含量隨著時間的增加顯著下降，但從第6天開始，下降速度明顯減慢；可滴定酸含量隨著濃度的增加逐漸增多?？傮w來看，經(jīng)過酸性乙醇處理的龍眼果實可滴定酸含量顯著高于其余3組，保鮮作用依次為：酸性乙醇提取的穇子多酚>VC>酸性甲醇提取的穇子多酚>茶多酚。

表4 不同樣品可滴定酸含量的變化/%

3.3.4 VC含量的測定

VC極易氧化，保護VC不被氧化成為貯藏龍眼的關(guān)鍵。龍眼果實在貯藏期間的變化，由表5可以看出，隨著貯藏天數(shù)的延長，龍眼果實VC含量顯著降低。不同溶劑提取的穇子多酚保護VC的能力雖不及茶多酚和抗壞血酸，但差異并不顯著。

表5 不同樣品VC含量的變化/%

3.3.5 還原糖含量

觀察表6可知，經(jīng)過不同處理后，龍眼果實的還原糖含量隨著天數(shù)的增加顯著下降，但隨著濃度的增大逐漸增大，各濃度之間的還原糖含量差異顯著。酸性乙醇和酸性甲醇提取的穇子皮多酚對龍眼果實的保鮮效果差異不顯著，接近于茶多酚和VC。龍眼中還原糖含量的降低，可導致龍眼果實風味被破壞，加入穇子多酚可減緩龍眼中還原糖的反應。

表6 不同樣品還原糖含量的變化/%

3.3.6 總糖含量

由表7可以看出，貯藏過程中，經(jīng)過不同處理的龍眼果實的總糖含量差異顯著，但變化趨勢基本一致，隨著天數(shù)的增加逐漸增長。經(jīng)過VC處理后的效果顯著高于其他3種，其次為茶多酚、酸性乙醇提取的穇子多酚和酸性甲醇提取的穇子多酚，保鮮效果接近VC和茶多酚。

表7 不同樣品總糖含量的變化/%

4 結(jié)論

研究不同溶劑提取的穇子多酚的抗氧化性，與VC和BHT相比較，穇子多酚具有良好的自由基清除能力。涂抹穇子多酚、茶多酚和VC后，延緩了龍眼的生命代謝活動，龍眼果實的外形指數(shù)表征均有一定的改善，穇子多酚具有良好的保鮮性能，且采用酸性乙醇提取的穇子多酚，配制成30 mg/mL時的保鮮效果最佳。