柑橘精油納米乳的制備及對金黃色葡萄球菌的抑制活性研究

蔣書歌 侯宇豪 劉 堅 李高陽 付復華 單 楊

(1. 湖南大學研究生院隆平分院，湖南 長沙 410125；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長沙 410125；3. 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410125；4. 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全國際聯(lián)合實驗室，湖南 長沙 410125)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一種常見的食源性致病菌，可造成嘔吐腹痛等癥狀，因此市售食品中往往會添加一些防腐劑抑制金黃色葡萄球菌的生長[1]。隨著人們對健康、綠色食品的追求，天然抑菌劑成為一種趨勢。柑橘精油主要存在于柑橘外果皮的油囊中，可通過蒸餾、冷榨或萃取等技術提取。柑橘精油富含檸檬烯、松油烯、月桂烯等抑菌活性成分[2]，可作為理想的天然抑菌劑替代亞硝酸鈉、苯甲酸鈉等傳統(tǒng)防腐劑[3-4]。然而，柑橘精油水溶性差、易揮發(fā)、易氧化，極大地限制了其應用范圍。

納米乳是一種非熱力學穩(wěn)定的膠體分散體系，粒徑一般為10～100 nm[5]，根據(jù)油或水作為分散相，分為水包油型、油包水型、雙連續(xù)型3種[6]。納米乳具有良好的動力學穩(wěn)定性，其乳中乳化劑及其他助乳化劑的存在，降低了油水界面張力[7]，同時，縮小粒徑至納米級別可減少液滴聚集、絮凝和引力作用從而顯著提高乳液穩(wěn)定性[8]。將精油制備成納米乳能提高精油的水溶性，使得親脂性成分快速融入以水為主要溶劑的食品生產(chǎn)體系[9-11]。另外，納米乳具有高分散性、高滲透性等優(yōu)點，提高了精油的抗菌、抗氧化等生物活性[12-13]。

研究擬以8種柑橘精油為原料，金黃色葡萄球菌為受試菌種，通過抑菌圈大小篩選合適的柑橘精油作為油相，并以吐溫80為乳化劑，去離子水為水相，利用相轉變法制備柑橘精油納米乳并確定最佳配方。根據(jù)平均粒徑、多分散相系數(shù)、粒度分布對柑橘精油納米乳穩(wěn)定性進行評價，通過抑菌圈直徑、最小抑菌濃度、最小殺菌濃度以及掃描電鏡比較柑橘精油納米乳和純精油的抑菌活性，旨在為柑橘精油作為一種天然食品抑菌劑的開發(fā)與應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

佛手柑：產(chǎn)地浙江省金華市，市售；

甜橙：產(chǎn)地云南省玉溪市，市售；

酸橙：產(chǎn)地湖南省漣源市，市售；

蜜柚：產(chǎn)地福建省漳州市，市售；

沙田柚：產(chǎn)地廣西省容縣，市售；

金桔：產(chǎn)地廣西省陽朔縣，市售；

蜜橘：產(chǎn)地湖南省石門縣，市售；

帝王柑：產(chǎn)地廣東省德慶縣，市售；

金黃色葡萄球菌：廣東省微生物培養(yǎng)中心；

無水硫酸鈉：分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司；

吐溫80：化學純，國藥集團化學試劑有限公司；

蘇丹紅III：化學純，上海麥克林生化科技有限公司；

LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、MH瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：LHS-250HC-11型，上海一恒科學儀器有限公司；

空氣浴搖床：TS-100B型，金壇市精達儀器制造有限公司；

離心機：Avanti 1-26xp型，美國Beckman有限公司；

磁力攪拌器：HJ-6A型，江蘇金怡儀器科技有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，美國Agilent公司；

掃描電子顯微鏡：A02100301型，德國Zeiss公司；

激光粒度儀：Zetasizer Nano ZS90型，英國馬爾文儀器公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 柑橘精油的制備 將柑橘皮與4倍質(zhì)量的水混勻于燒瓶蒸餾3 h，將餾分用無水硫酸鈉干燥后置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌種活化 取甘油管保藏的金黃色葡萄球菌至80 mL 的LB肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，取200 μL培養(yǎng)液接入80 mL的LB肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃，200 r/min下震蕩培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)2代，用LB肉湯培養(yǎng)基稀釋菌體濃度為1×107CFU/mL備用。

1.2.3 柑橘精油的篩選 采用濾紙片[14]法對精油抑菌效果進行比較篩選，取活化的菌液均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上。將含有6 μL精油的無菌圓盤濾紙片置于平板，不含精油的空白濾紙片作為對照，平板于37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈大小。

1.2.4 柑橘精油化學成分測定 參照蘇瑾等[15]的方法，通過氣相色譜—質(zhì)譜(GC-MS)分析柑橘精油化學成分。

1.3 柑橘精油納米乳的制備

1.3.1 偽三元相圖繪制 采用相轉變法制備柑橘精油納米乳[16]。固定柑橘精油和吐溫80的質(zhì)量為2 g，按m乳化劑∶m精油分別為9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9于燒杯中混勻，25 ℃、500 r/min 下磁力攪拌，以1 mL/min的流速依次向燒杯中滴加去離子水，當燒杯中溶液由澄清變渾濁再變澄清時，即為相轉變點，記錄此時所滴加的去離子水質(zhì)量，并計算各組分在相轉變點的質(zhì)量分數(shù)，用Origin 8.0繪制偽三元相圖。

1.3.2 納米乳平均粒徑、多分散相系數(shù)(PDI)及粒度分布測定 將樣品用去離子水稀釋100倍以避免多重散射的影響，使用馬爾文激光粒度儀測定乳液的平均粒徑、PDI及粒度分布，測定條件為溫度25 ℃，散射角173°、平衡時間5 min、測試時間5 min。

1.4 柑橘精油納米乳抑菌性

1.4.1 納米乳抑菌活性

(1) 納米乳抑菌圈直徑:取活化后的菌液100 μL均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上。將含有20 μL納米乳或普通乳液的無菌圓盤濾紙片置于平板，其中普通乳液中各組分含量與納米乳一致，通過初步混合制備?？瞻捉M添加含24%吐溫80的稀釋液。平板于37 ℃下培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈大小。

(2) 納米乳最小抑菌濃度:參照Guo等[14]的方法采用倍半稀釋法分別測定柑橘精油納米乳及對應濃度純精油的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)。

1.4.2 納米乳對微生物微觀結構的影響 參照Moghimi等[17]的方法用掃描電鏡(SEM)觀察經(jīng)納米乳處理后的金黃色葡萄球菌的形態(tài)變化。

1.5 統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示。使用GraphPad Prism 8軟件進行繪圖與ANOVA差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 柑橘精油的篩選

2.1.1 柑橘精油抑菌性 由圖1和表1可知，抑菌圈直徑大小分別為佛手柑>蜜柚>甜橙>帝王柑>沙田柚>金桔>酸橙>蜜橘，且佛手柑、蜜柚、甜橙三者抑菌圈大小無顯著性差異，因此篩選出抑菌效果較好的佛手柑、蜜柚、甜橙精油進一步試驗。

2.1.2 柑橘精油化學成分 由表2可知，分別鑒定了3種精油中的30種化合物，其分別占出峰總物質(zhì)的97.74%(佛手柑)，98.86%(甜橙)，98.46%(蜜柚)。佛手柑精油的主要化合物為γ-松油烯(35.97%)、D-檸檬烯(32.79%)、3-蒈烯(5.15%)；甜橙精油的主要化合物為D-檸檬烯(73.86%)、β-月桂烯(7.65%)、β-水芹烯(3.21%)；蜜柚精油的主要化合物為D-檸檬烯(56.52%)、β-月桂烯(26.82%)、β-蒎烯(4.72%)。據(jù)報道[18-19]，γ-松油烯和D-檸檬烯具有廣譜抑菌效果。此外，蒈烯、月桂烯及β-蒎烯等其他主要成分也具有較好的抑菌活性[20-22]。

圖1 8種柑橘精油對金黃色葡萄球菌抑菌效果圖Figure 1 Diagram of the antibacterial effect of eight citrus essential oils on Staphylococcus aureus

2.2 柑橘精油納米乳的制備

2.2.1 偽三元相圖的繪制 由圖2可知，當m乳化劑∶m精油為5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9時，佛手柑精油納米乳無相轉變，當m乳化劑∶m精油為4∶6，3∶7，2∶8，1∶9時，甜橙、蜜柚精油納米乳無相轉變，這些情況下均無法形成納米乳。由于載油量越大抑菌活性越強，因此選擇載油量最大的組合作為納米乳最優(yōu)配方。當m乳化劑∶m精油為8∶2時，佛手柑清油、甜橙精油、蜜柚精油3種乳液中精油均具有最大質(zhì)量比，分別為(5.97±0.00)%，(6.79±0.00)%，(6.17±0.00)%，故選取m乳化劑∶m精油為8∶2制備乳液。為避免載油量差異對后續(xù)抑菌試驗造成偏差，將3種納米乳的配方統(tǒng)一設定為精油質(zhì)量分數(shù)6%、吐溫80質(zhì)量分數(shù)24%、水質(zhì)量分數(shù)70%。

2.2.2 納米乳平均粒徑、PDI及粒度分布 在確定最佳配方基礎上，制備3種柑橘精油納米乳，分別測定其平均粒徑、PDI及粒徑分布，結果見表3、圖3。

由表3可知，佛手柑精油、甜橙精油、蜜柚精油3種納米乳的平均粒徑分別為(15.01±0.85)，(15.36±0.76)，(17.43±0.22) nm，佛手柑與甜橙之間無顯著性差異，蜜柚的平均粒徑偏大。佛手柑精油納米乳的PDI顯著低于甜橙精油納米乳和蜜柚精油納米乳，PDI越小，乳液液滴分布越均勻，體系越穩(wěn)定，說明佛手柑精油納米乳相較其他兩種納米乳粒徑分布更均勻。粒度分布結果更直觀反映了3種納米乳在穩(wěn)定性上的差異，其中佛手柑精油納米乳的粒徑分布最窄且呈單峰，說明液滴粒徑一致性好。佛手柑精油納米乳的高穩(wěn)定性可能與佛手柑精油中高比例極性化合物有關，極性化合物會促進吐溫80在液滴界面上的覆蓋，從而進一步改善乳化作用并產(chǎn)生相對較強的界面[23]。

表1 8種柑橘精油對金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑的影響?

表2 3種柑橘精油的化學成分分析

圖2 3種柑橘精油納米乳的偽三元相圖Figure 2 Pseudo-ternary phase diagrams of three citrus essential oil nanoemulsions

表3 3種柑橘精油納米乳的平均粒徑及PDI?

2.3 柑橘精油納米乳的抑菌性

2.3.1 納米乳抑菌活性 由表4可知，與普通精油乳液相比，3種柑橘精油納米乳的抑菌圈直徑顯著增大。佛手柑、甜橙、蜜柚精油的MIC分別為9.375，18.750，18.750 mg/mL，且三者MIC與MBC一致；而佛手柑、甜橙、蜜柚精油納米乳的MIC分別為3.750，15.000，7.500 mg/mL，MBC分別為3.750，15.000，15.000 mg/mL。3種柑橘精油中，佛手柑精油對金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強，甜橙、蜜柚精油抑菌活性無明顯差異。將精油制備成納米乳后，佛手柑精油納米乳的抑菌效果提升最顯著，其MIC、MBC均為純精油的2.5倍，而另外2種精油納米乳的抑菌活性也有小幅度的提升。佛手柑精油納米乳的最高抑菌活性可能與以下兩方面有關：①D-檸檬烯是甜橙、蜜柚精油的主要成分，相對于佛手柑精油的主要成分γ-松油烯，其抗氧化能力更強，對氧氣更加敏感[18]，納米乳制備過程中，樣品由于空氣、磁力攪拌等因素可能在一定程度上造成檸檬烯的損失，導致抑菌效果產(chǎn)生明顯差異；② 更穩(wěn)定的乳液體系能降低乳液在貯藏及加工過程中破乳、分層、聚集等現(xiàn)象的產(chǎn)生，避免乳液成分損失[24]，納米乳穩(wěn)定性試驗表明，佛手柑精油納米乳在3種納米乳中穩(wěn)定性最好，抑菌過程中有效成分揮發(fā)相對較少，因此抑菌效果提升最明顯。精油成分上的優(yōu)勢以及納米乳的高穩(wěn)定性，可能是佛手柑精油納米乳表現(xiàn)出較高抑菌活性的主要原因。

圖3 3種柑橘精油納米乳的粒徑分布圖Figure 3 Diagramsofthe particle size distribution of three citrus essential oil nanoemulsions

表4 金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑、MIC及MBC?

2.3.2 納米乳對微生物微觀結構的影響 由圖4可知，與空白對照組和純精油處理的細胞相比，納米乳處理的微生物細胞呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化?？瞻讓φ战M的微生物細胞具有光滑完整的表面；精油處理組的微生物細胞形態(tài)結構受到較小程度的破壞，某些細胞出現(xiàn)凹陷、變形，但大部分細胞仍完整；而納米乳處理的微生物細胞呈現(xiàn)大面積不同程度的變形、粘連及破損，有更大范圍的凹陷和畸形細胞群體。說明佛手柑精油及其納米乳對金黃色葡萄球菌均具有良好的抑制作用，且納米乳的抑菌效果更顯著。

3 結論

探究了柑橘精油納米乳對食源性細菌金黃色葡萄球菌的抑制作用，篩選出了抑菌效果最強的3種柑橘精油(佛手柑、甜橙、蜜柚)。結果顯示，當精油質(zhì)量分數(shù)為6%、吐溫80質(zhì)量分數(shù)為24%、去離子水質(zhì)量分數(shù)為70%時，制備的納米乳粒徑為10～20 nm且分布較均勻，其中佛手柑精油納米乳的穩(wěn)定性最佳。抑菌試驗表明，將3種柑橘精油制備成納米乳后其抑菌活性得到不同程度的提升，其中佛手柑精油納米乳的抑菌活性提升為純精油的2.5倍，具有最突出的抑制金黃色葡萄球菌效果，這可能與乳液穩(wěn)定性及不同品種柑橘精油的成分差異有關。掃描電鏡表明，佛手柑精油納米乳及其純精油對微生物形態(tài)結構都具有破壞作用，且納米乳的破壞程度更顯著。試驗制備的佛手柑精油納米乳對金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用，可作為一種天然抗菌劑進一步開發(fā)利用。