原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌微血管侵犯的術(shù)前預(yù)測及其模型的建立

姚嵐清，陳鐘

原發(fā)性肝癌是全球第四大最常見的惡性腫瘤，并且是第二大最常見的死亡原因[1]。我們中心位于南通，它是中國肝癌的高發(fā)地區(qū)，具有很高的代表性[2-3]。原發(fā)性肝癌的病理類型可分為三大類：肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)，肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC)和肝細(xì)胞膽管癌混合型(HCC-ICC)，HCC占肝癌的絕大多數(shù)，占85%～90%。目前，肝癌的治療仍以手術(shù)切除為基礎(chǔ)[4-5]，但術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然很高。已有研究表明微血管侵犯(microvascular invasion,MVI)是肝癌切除術(shù)后HCC患者復(fù)發(fā)的重要危險因素[6-11]。

我們通常依靠術(shù)后病理診斷MVI，也可以根據(jù)臨床證據(jù)做出預(yù)測。肝癌患者M(jìn)VI的術(shù)前預(yù)測可指導(dǎo)手術(shù)方式的選擇[12]，并可以與藥物治療相結(jié)合[13]，從而減少腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。先前的研究提出了許多MVI危險因素，例如年齡，甲胎蛋白(AFP)，嗜中性粒細(xì)胞，谷氨酰胺肽酶，淋巴細(xì)胞，乙型肝炎，乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量，門脈高壓癥，巴塞羅那肝病臨床(BCLC)分期 ，腫瘤大小，數(shù)量，腫瘤影像學(xué)特征等[14-15]，以及患者血清中的某些腫瘤標(biāo)志物和DNA[16-18]。我們將所有這些可能的危險因素納入我們的研究，將術(shù)前實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)和影像學(xué)指標(biāo)結(jié)合起來分析。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括：異常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶Ⅱ(GGT-Ⅱ)，血小板計(jì)數(shù)(PLT)，乙型肝炎，乙型肝炎病毒(HBV)DNA含量，甲胎蛋白(AFP)，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NE)，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LY)，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比率(NLR)，國際標(biāo)準(zhǔn)化比率(INR)。術(shù)前影像學(xué)指標(biāo)包括：肝硬化，腫瘤數(shù)目，腫瘤直徑，邊緣狀況，動脈期增強(qiáng)是否均勻，腫瘤周圍增強(qiáng)以及是否與主血管相鄰。為建立一個好的預(yù)測模型，我們收集了2012年10月至2020年8月間南通大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科二病區(qū)行肝癌切除 術(shù)的162例HCC患者的臨床數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，以全面探討HCC患者M(jìn)VI的危險因素。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前肝功能分級(child分級)A級或B級；②術(shù)前未行任何抗腫瘤治療及降期治療術(shù)者；③行肝癌切除術(shù)；④術(shù)后病理診斷為HCC患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①復(fù)發(fā)型或混合型肝癌；②術(shù)前已有肝外轉(zhuǎn)移者；③既往有惡性腫瘤病史者；④影像診斷已有血管癌栓者。

本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 觀察指標(biāo) 我們應(yīng)用EXCEL中的簡單隨機(jī)抽樣方法抽選出162例病例，并將患者所有的資料錄入到數(shù)據(jù)庫中，影像資料是由我院兩位工作時間超過10年的影像科醫(yī)生在不知道患者資料的前提下分開讀片，并由影像科主任審核得出結(jié)果。一般指標(biāo)：年齡、性別、乙肝、Child-pugh分級。影像學(xué)指標(biāo)：肝硬化、腫瘤數(shù)目、最大腫瘤直徑、邊緣是否光滑、動脈期強(qiáng)化是否均勻、瘤周強(qiáng)化、毗鄰血管主干。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：術(shù)前異常凝血酶原(PIVKA-Ⅱ)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶Ⅱ(GGT-Ⅱ)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)、乙肝病毒核酸定量(HBV-DNA)、甲胎蛋白(AFP)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(NE)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(LY)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)/淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)比值(NLR)、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(INR)。

1.3 MVI的診斷 本文入組病例根據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》2019年版本所描述的“7 點(diǎn)”基線取材法，按1∶1分別在腫瘤3點(diǎn)、6點(diǎn)、9點(diǎn)、12點(diǎn)位置的癌與癌旁組織交界處取材；在腫瘤內(nèi)至少取材1 處；距腫瘤邊緣≤1 cm(近癌旁)和>1 cm(遠(yuǎn)癌旁)范圍的瘤周組織分別取材1塊。因?yàn)槎嘟Y(jié)節(jié)性肝癌具有單中心和多中心兩種起源方式，所以在不能排除肝內(nèi)轉(zhuǎn)移的情況下，應(yīng)該對單個腫瘤直徑≤3 cm的肝癌組織，全部取材分析。診療規(guī)范中MVI定義為：在電子顯微鏡下于內(nèi)皮細(xì)胞襯覆的血管腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞巢團(tuán)，以癌旁門靜脈分支為主(含包膜內(nèi)血管)(圖1)。本文入組病例的切片結(jié)果由2位工作時間超過10年的病理科醫(yī)師在不知道患者資料的前提下分開審核。

1a：微血管癌栓陽性患者切片；1b：微血管侵犯陰性患者切片圖1 肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤病理切片(HE ×100)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件，利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)取約登指數(shù)(敏感度+特異度-1)最大時為臨界值，確定各指標(biāo)預(yù)測MVI的最佳臨界值。用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行單因素分析，將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)納入多因素Logistic回歸模型分析MVI的獨(dú)立危險因素，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)獨(dú)立危險因素的風(fēng)險系數(shù)(B)建立預(yù)測模型：P=1/1 +[e(B0-B1×X1-B2×X2-B3×X3-BN×XN)]。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 162例患者，男139例，女23例；年齡≥59歲有75例，年齡<59歲有87例；肝功能Child分級A級144例，B級18例；乙型肝炎患者128例，無肝炎患者34例，病理結(jié)果提示MVI陽性患者60例，MVI陰性患者102例。

2.2 影像學(xué)資料 肝硬化患者96例，無肝硬化患者66例；腫瘤單發(fā)143例，多發(fā)19例；邊緣光滑100例，不光滑62例；動脈期強(qiáng)化均勻76例，強(qiáng)化不均勻86例；瘤周強(qiáng)化58例，不強(qiáng)化104例；毗鄰血管主干83例，不毗鄰79例。HCC是患者影像特點(diǎn)見圖2。

2a：腫瘤邊緣光滑，邊緣強(qiáng)化；2b：腫瘤動脈期強(qiáng)化均勻，邊緣有凸起不光滑；2c：腫瘤邊緣光滑，邊緣強(qiáng)化，內(nèi)部強(qiáng)化不均勻圖2 肝細(xì)胞肝癌患者腫瘤影像特點(diǎn)

2.3 實(shí)驗(yàn)室資料 γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶Ⅱ(GGT-Ⅱ)陽性患者87例，陰性患者75例。采用ROC曲線分析PIVKA-Ⅱ、PLT、AFP、NE、LY、NLR、INR、腫瘤最大直徑各個指標(biāo)預(yù)測MVI的發(fā)生情況(圖3)，取約登指數(shù)對應(yīng)的值作為臨界值，結(jié)果如下：PIVKA-Ⅱ取516 mAU/ml，PLT取169.5×109/L，NE取值3.105×109/L，NLR取值1.896，AFP取值50.38 ng/ml，腫瘤最大直徑取值5.65 cm。而LY和INR的P值>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各指標(biāo)ROC曲線結(jié)果見表1。

圖3 通過ROC曲線獲取各個指標(biāo)的約登指數(shù)

表1 各指標(biāo)ROC曲線結(jié)果

2.4 HCC患者M(jìn)VI的危險因素分析 單因素分析結(jié)果顯示：HCC患者的PIVKA-Ⅱ≥516 ng/ml、GGT-Ⅱ陽性、PLT≥169.5×109/L、NE≥3.105×109/L、NLR≥2.32、AFP≥50.38 ng/ml、最大腫瘤直徑≥5.65 cm、動脈期不均勻強(qiáng)化、瘤周強(qiáng)化是HCC患者發(fā)生MVI的危險因素(P<0.05)(表2)。

表2 HCC患者M(jìn)VI影響因素的單因素分析

將單因素分析中影響HCC 患者發(fā)生MVI的臨床指標(biāo)納入多因素Logistic回歸模型中分析得出：PIVKA-Ⅱ≥516 mAU/ml、NE≥3.105×109/L、腫瘤最大直徑≥5.65 cm，是HCC患者發(fā)生MVI的獨(dú)立危險因素(P<0.05)(表3)。

表3 HCC患者M(jìn)VI影響因素的logistic多因素回歸分析

2.5 預(yù)測模型的建立 根據(jù)Logistic 回歸分析結(jié)果，我們將三個獨(dú)立危險因素(PIVKA-Ⅱ≥516 mAU/ml賦值為1，PIVKA-Ⅱ<516 mAU/ml賦值為0；NE≥3.105×109/L賦值為1，NE<3.105×109/L賦值為0；腫瘤最大直徑≥5.65 cm賦值為1，腫瘤最大直徑<5.65 cm賦值為0)納入我們創(chuàng)建的MVI的預(yù)測模型：P=1/1+[e(2.398-1.554×X1-1.032×X2-1.502×X3)](X1、X2、X3分別對應(yīng)PIVKA-Ⅱ、NE、腫瘤最大直徑的賦值)，我們使用ROC曲線測試了模型的區(qū)分度(曲線下面積：0.862,95%CI：0.803-0.921)(圖4)，使用霍斯默萊梅肖(Hosmer-Lemeshow)擬合度檢驗(yàn)檢測模型的校準(zhǔn)度(P=0.635)(圖5)，并用R語言繪制了列線圖(圖6)。我們認(rèn)為P>0.5(列線圖上的分?jǐn)?shù)超過116分)具有很高的MVI發(fā)生概率。

圖4 預(yù)測模型區(qū)分度的ROC曲線

圖5 預(yù)測模型校準(zhǔn)度的散點(diǎn)圖

圖6 預(yù)測模型的列線圖

2.6 驗(yàn)證預(yù)測模型 按照之前相同的納入排除標(biāo)準(zhǔn)和簡單隨機(jī)抽樣方法，我們從2019年1月至2020年6月間南通大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科一病區(qū)隨機(jī)選擇了50例術(shù)后病理診斷為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的患者。在該隊(duì)列中，病理診斷提示有10例MVI患者和40例無MVI患者。我們使用建立的模型對50例患者進(jìn)行了術(shù)前MVI的預(yù)測。MVI陽性預(yù)測的準(zhǔn)確性為6/10(60%)，MVI陰性預(yù)測的準(zhǔn)確性為32/40(80%)?？傮w準(zhǔn)確度為38/50(76%)。預(yù)測模型的敏感性為71%，特異性為83%。

3 討論

HCC患者當(dāng)前的治療策略是手術(shù)切除，結(jié)合藥物治療。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，患者的預(yù)后和生活質(zhì)量得到了明顯改善。然而，腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然限制了患者的長期生存，MVI仍然是HCC患者手術(shù)切除后腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵危險因素[19]。在我們的研究中，37%的患者發(fā)生了MVI，表明術(shù)前MVI預(yù)測的重要性。在選擇手術(shù)切除方法時，對于高度懷疑MVI陽性的患者，肝功能良好的，首選解剖性肝切除[20-22]，對于腫瘤直徑較大超過肝段的患者，優(yōu)先采用肝葉或者半肝切除。對于發(fā)生MVI風(fēng)險低的患者，我們則可以行保證切緣的局部切除和楔形切除，從而降低患者出血、感染的風(fēng)險和對肝功能的影響，提高患者的近期預(yù)后[23]。

對于懷疑MVI陽性的患者，可以在術(shù)前或術(shù)中行經(jīng)動脈化學(xué)栓塞治療(TACE)[24-25]。靶向或免疫藥物可在手術(shù)后及時投入使用，從而最大程度的殺滅患者肝內(nèi)殘存的癌細(xì)胞。對于發(fā)生MVI風(fēng)險低的患者，經(jīng)濟(jì)條件好的家庭，在充分告知利弊后由患方?jīng)Q定是否盡早使用藥物治療；而對于經(jīng)濟(jì)條件差的家庭，如果病理提示MVI陰性則可在一定程度上減少家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[26]。

異常凝血酶原和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶Ⅱ都可以通過術(shù)前檢測肝癌酶譜得到，而異常凝血酶原數(shù)值的變化更具有規(guī)律性，它也成為本研究的一個重點(diǎn)[27]。Poté和Nicolas 曾提出異常凝血酶原與MVI的發(fā)生有關(guān)[28]，之后便沒有了更深入的研究，也沒有與之相關(guān)的預(yù)測模型的建立。我們知道人體在缺乏維生素K的情況下，肝細(xì)胞不能合成正常的凝血因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ)，而只能合成異常凝血酶原。HCC患者由于凝血酶原前體羧化不足，從而生成大量的異常凝血酶原，隨著腫瘤的進(jìn)展，當(dāng)瘤周微血管受到侵犯時(發(fā)生MVI)，其所供給的那部分肝細(xì)胞受到影響，異常凝血酶原的值便隨之升高。從本文研究的數(shù)據(jù)我們可以發(fā)現(xiàn)異常凝血酶原與MVI的發(fā)生呈高度正相關(guān)，甚至比腫瘤直徑更敏感。因此HCC患者在術(shù)前對于異常凝血酶原值的測定就很有意義。

腫瘤的發(fā)生與炎癥有關(guān)[29]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程離不開炎癥反應(yīng)所提供的微環(huán)境。本研究得出NE(≥3.105×109/L)是MVI的獨(dú)立危險因素。也有中心得出NLR是獨(dú)立的危險因素[30]。腫瘤的發(fā)生刺激了局部炎癥反應(yīng)的開始，同時也意味著機(jī)體免疫功能的下降，隨著腫瘤的進(jìn)展，NE和LY兩者的平衡被逐漸打破，形成了一個惡性循環(huán)，這可能導(dǎo)致了腫瘤微環(huán)境的改變，從而一定程度上促成了MVI的發(fā)生。但是由于大部分病例NE和LY的指標(biāo)都在正常范圍，且數(shù)值的上下區(qū)間很小，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上，這種數(shù)值波動范圍很小的變量要依賴于大的樣本量才能得出更加準(zhǔn)確的結(jié)果，故炎癥反應(yīng)與MVI的發(fā)生之間的關(guān)系有待多中心大樣本量的研究去進(jìn)一步論證支持。

現(xiàn)如今對于AFP的研究已經(jīng)很成熟[31]。它是原發(fā)性肝細(xì)胞癌的主要血清生物標(biāo)志物，主要來源于胚胎肝細(xì)胞，原發(fā)性肝癌病理上分為高、中、低分化肝細(xì)胞肝癌，一定意義上就是與原始胚胎肝細(xì)胞的相似程度。隨著腫瘤的進(jìn)展，這些“胚胎肝細(xì)胞”(肝癌細(xì)胞)增多，AFP值升高。本中心多因素分析得出的P值為0.093，認(rèn)為AFP不是MVI發(fā)生的獨(dú)立危險因素。對于臨界值的選擇，有的中心選擇200 ng/ml，有的選擇400 ng/ml，但是在樣本量足夠的情況下，我們認(rèn)為還是通過ROC曲線分析得出約登指數(shù)所對應(yīng)的AFP值更有說服力。

HCC患者M(jìn)VI的發(fā)生與腫瘤的大小相關(guān)[32]。病程越長，腫瘤直徑越大，血液供應(yīng)就越豐富，MVI發(fā)生的可能性就越高。大多數(shù)中心分析使用的腫瘤直徑臨界值為5 cm。當(dāng)直徑超過5 cm時，發(fā)生MVI的風(fēng)險將增加。本中心采用ROC曲線分析得出腫瘤直徑≥5.65 cm是HCC患者發(fā)生MVI的獨(dú)立危險因素，這與絕大部分中心所得結(jié)果一致。

通過影像學(xué)診斷肝癌是臨床上的重要步驟，借助影像去發(fā)現(xiàn)病灶，進(jìn)行定位，測量其大小，排除其他地方的病變等。很多中心通過分析CT、MRI中腫瘤的特性尋找到了規(guī)律[33-36]。造影劑在腫瘤組織里排出要比正常組織慢，而腫瘤內(nèi)部組織質(zhì)地的不規(guī)則，尤其血供的不規(guī)則就會造成強(qiáng)化的不均勻，瘤體質(zhì)地軟硬的參差不齊，特別是壞死的組織，容易脫落隨著血流轉(zhuǎn)移，從而增加了MVI的風(fēng)險，同樣的情況還會出現(xiàn)在門靜脈期及延遲期的不均勻強(qiáng)化。瘤周包膜的強(qiáng)化是腫瘤周圍新生的血管受壓形成，本文在單因素分析過程中發(fā)現(xiàn)腫瘤的不均勻強(qiáng)化和瘤周強(qiáng)化與MVI的發(fā)生存在一定的相關(guān)性(P<0.05)，雖然最終多因素分析結(jié)果不是獨(dú)立危險因素，但仍然存在研究的價值。也有中心提出腫瘤形態(tài)的不規(guī)則與MVI發(fā)生有關(guān)[37]，本中心研究發(fā)現(xiàn)這集中表現(xiàn)在直徑>5 cm的腫瘤，而對于一些小肝癌，腫瘤形態(tài)大多規(guī)則。

沈鋒曾在2016年提出了一個預(yù)測模型[38]。他們收集了1 004例接受肝切除的HBV相關(guān)HCC患者的數(shù)據(jù)，得出與MVI相關(guān)的7個術(shù)前因素是：腫瘤直徑，包膜的不完整，腫瘤多發(fā)，乙型肝炎病毒DNA>104 IU/mL，血小板計(jì)數(shù)<100×103/μl，甲胎蛋白水平>20 ng/mL，以及對比增強(qiáng)磁共振成像上的典型腫瘤形態(tài)。這與我們中心單因素分析得到的結(jié)果基本一致，但是依然存在一些局限的地方。血小板和甲胎蛋白水平的臨界值并不是通過ROC曲線得到的，而在臨床上絕大部分患者的血小板計(jì)數(shù)都是正常的，因此對結(jié)果的可信度造成一定的影響。腫瘤包膜的完整性主要是通過術(shù)后的病理診斷，而術(shù)前診斷依賴于影像醫(yī)生的主觀判斷，從而會產(chǎn)生誤差。最后，這個預(yù)測模型研究對象是合并乙肝的患者，并不適用于沒有肝炎感染的HCC患者。本中心將2012年至2020年我科所有行肝癌切除的患者納入數(shù)據(jù)庫，借助EXCEL隨機(jī)篩選，根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)，最終將162例病理診斷為肝細(xì)胞肝癌的患者納入研究，做到了隨機(jī)性原則。我們基于前人的研究，將所有可能與MVI發(fā)生相關(guān)的指標(biāo)全部納入，將單因素分析有意義的指標(biāo)納入到多因素Logistic 回歸中去研究，所納入的風(fēng)險因素越多，多因素分析得出的結(jié)果就越準(zhǔn)確，也就是與MVI發(fā)生的相關(guān)性越高。由于每個中心所納入多因素分析的指標(biāo)不同，所得出的結(jié)果自然有差異。我們對預(yù)測模型進(jìn)行了外部驗(yàn)證，而不是內(nèi)部驗(yàn)證，從而大大提高了預(yù)測模型的準(zhǔn)確性和臨床適用性。但是由于樣本量并不是很大，屬于單中心的研究，故本研究存在一定的局限性。

綜上所述，異常凝血酶原≥516 mAU/ml、NE≥3.105×109/L、腫瘤最大直徑≥5.65 cm，是HCC患者發(fā)生MVI的獨(dú)立危險因素，與HCC患者的MVI發(fā)生有關(guān)，根據(jù)這3個指標(biāo)構(gòu)建的預(yù)測模型有助于HCC患者M(jìn)VI的術(shù)前預(yù)測，從而指導(dǎo)患者手術(shù)切除策略的選擇，有一定的臨床意義。