NLRP1信號通路在心房顫動發(fā)病機(jī)制中的作用

康品方，朱飛宇,2a，高琦,2a，高琴，唐碧，王洪巨

心房顫動(atrial fibrillation, AF)發(fā)病以各種內(nèi)外源性因素干擾正常心房電生理為誘發(fā)因素，引起局灶性異位活動和折返，從而引起心房的高頻興奮，導(dǎo)致心房的不同步收縮和心室的不規(guī)則興奮，最終引起心臟損傷及心臟負(fù)荷加重[1-2]。炎癥與AF發(fā)存在密切關(guān)聯(lián)性，如AF患者血清炎癥標(biāo)志物水平升高[1]。AF發(fā)病常始于陣發(fā)性發(fā)作并隨著頻率和持續(xù)時間增加演變?yōu)槌志眯头款?，即“房顫誘發(fā)房顫”現(xiàn)象，炎癥反應(yīng)可通過介導(dǎo)心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，從而與房顫的發(fā)生和進(jìn)展相互促進(jìn)[2-6]，而房顫本身可在心房重塑過程中誘發(fā)炎癥，使心律失常持續(xù)存在[3]，表明炎癥與房顫相關(guān)。IL-1β是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，對于宿主反應(yīng)和抵抗病原體必不可少，但在慢性病和急性組織損傷時加劇損害[4]。針對白細(xì)胞介素IL-1β的抗炎治療降低了既往心臟病發(fā)作患者復(fù)發(fā)心血管事件的風(fēng)險[5]。炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的蛋白復(fù)合物，在引起細(xì)胞程序性死亡的同時具有炎癥活化作用。NLRP1炎癥小體參與多種疾病，特別是心血管疾病[6]。NLRP1可在內(nèi)外源性損傷因素作用下聚集ASC，誘導(dǎo)Caspase-1蛋白前體活化，促進(jìn)IL-1β產(chǎn)生。房顫患者外周血NLRP 1-ASC-Caspase-1通路可能在某種誘因下被激活，釋放具有活性的 IL-1β，進(jìn)而激活下游信號通路，促發(fā)心臟局部或全身的炎癥反應(yīng)，誘發(fā)房顫的發(fā)病與進(jìn)展。

孤立性房顫患者心房病理呈淋巴單核細(xì)胞浸潤和鄰近肌細(xì)胞壞死[7]。另外，PAF或nPAF患者外周血中活化的T淋巴細(xì)胞(CD3)百分比較高，對于復(fù)律后維持竇性心律患者，活化現(xiàn)象可逆轉(zhuǎn)[8]。淋巴單核細(xì)胞在心房中分泌高水平的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、TNF、和IL-6，導(dǎo)致心房纖維化和電重構(gòu)[9-10]。提示PBMC可能通過炎癥活化參與心房顫動的發(fā)病，但目前房顫患者PBMCs中炎癥活化的機(jī)制及致病過程尚未被闡明，缺乏臨床相關(guān)性研究。本研究擬通過觀察PA患者PBMCs中NLRP1炎癥小體相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)水平，探討PBMCs中NLRP1誘導(dǎo)的炎癥信號通路在AF發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2019年1月—2019年12月我院收治的房顫患者(AF)40例，其中陣發(fā)性房顫(PAF)和非陣發(fā)性房顫(nPAF)各20例，所有受試者均行12導(dǎo)聯(lián)心電圖或24小時動態(tài)心電圖檢查。選取同期體檢者20例作為正常對照組(CON組)，入選患者均簽署知情同意書，研究方案獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)(2019KY023)。診斷標(biāo)準(zhǔn)：PAF定義為房顫7天內(nèi)終止，否則定義為nPAF[11]；排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重心血管疾病、高血糖、肝腎疾病、骨折、肺部疾病、感染性和自身免疫性疾病、腫瘤、精神疾病患者。

1.2 試劑材料 NLRP1抗體：Abcam公司；ASC、Caspase-1抗體：Novus Biologicals公司；β-actin抗體來自protintech公司；免疫磁珠試劑盒：STEMCELL Technologies公司；人外周血淋巴細(xì)胞分離液：北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、熒光定量檢測試劑盒、第一鏈合成試劑盒：TIANGEN公司；引物：上海生工生物工程有限公司(序列：表1)。

1.3 方法

1.3.1 樣本準(zhǔn)備與PBMCs分離 標(biāo)本準(zhǔn)備：所有患者通宵禁食,早上采集外周血置于EDTA-抗凝管中，離心，取上層血漿，于-80 ℃冰箱保存。

PBMCs分離：患者外周血液用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋兩倍，加至淋巴細(xì)胞分離液層面上，2 000 r/min離心20 min，用巴式管輕輕吸出此PBMC層的細(xì)胞,用PBS重懸細(xì)胞，4 ℃、1 500 r/min離心10 min，棄上清，重復(fù)2次，用移液槍吸出殘留液體，加入配置好的血清(胎牛血清：二甲基亞砜=9∶1)重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至凍存管。-80 ℃冰箱保存。

表1 引物序列

1.3.2 qRT-PCR檢測NLRP1通路相關(guān)mRNA在PBMCs中的表達(dá)水平 用Trizol試劑提取PBMC總RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用SYBR實時熒光定量PCR方法進(jìn)行熒光定量。用β-actin進(jìn)行校正，用2-ΔΔt法進(jìn)行相對數(shù)據(jù)處理，計算相關(guān)基因的表達(dá)率。

1.3.3 Western blot檢測NLRP1通路相關(guān)蛋白在PBMCs中的表達(dá)情況 使用前期提取的PBMCs，使用RIPA緩沖液加蛋白酶抑制劑提取總蛋白，10 % SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜；脫脂牛奶常溫封閉2 h；一抗室溫孵育4 ℃過夜二抗室溫孵育1 h；ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3.4 ELISA法檢測各組血漿中IL-1β 水平 使用ELISA法測定血漿中IL-1β水平，根據(jù)生產(chǎn)商說明檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)血漿樣品中IL-1β的含量。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者臨床資料比較 3組受試者年齡、性別、血糖水平、ALT、TG、HDL、Scr、LDL、AST指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)鑒定人PBMCs純度 用磁珠結(jié)合CD14+抗體純化受試者PBMC后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選鑒定顯示，PBMCs純度在90%以上。見圖1。

表2 3組受試者臨床資料比較 (n=20)

1A 同型對照組 1B 試驗組FITC-CD14 1C 同型對照組+試驗組圖1 人CD14+抗體純化后的PBMC純度

2.3 3組受試者PBMCs中NLRP1通路的mRNA表達(dá)水平比較 以對照組mRNA水平行歸一化處理，結(jié)果示：PAF組NLRP1(2.134±0.107)、ASC(1.947±0.217)、Caspase-1(2.054±0.193)的mRNA表達(dá)水平高于CON組(1.000,1.000,1.000),低于nPAF組(8.248±1.404, 3.718±0.5254, 6.036±0.475)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2A 3組受試者NLRP1 mRNA表達(dá)水平 2B 3組受試者ASC mRNA表達(dá)水平 2C 3組受試者Caspase-1 mRNA表達(dá)水平圖2 3組受試者PBMCs中NLRP1(A), ASC(B), Caspase-1(C) mRNA表達(dá)水平。注：與CON組比較，*P<0.05； 與PAF組比較，#P<0.05。

2.4 3組受試者PBMCs中NLRP1信號通路蛋白表達(dá)水平比較 PAF組NLRP1(0.672±0.270), ASC(0.667±0.218),Caspase-1(0.725±0.185)蛋白表達(dá)水平高于CON組(0.304±0.140, 0.296±0.177, 0.426±0.141)，低于nPAF組(1.070±0.244, 1.112±0.215, 1.098±0.195)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 3組受試者PBMCs中NLRP1, ASC, Caspase-1蛋白表達(dá)水平。 注：與CON組比較，*P<0.01 ;與PAF組比較，#P<0.01。

2.5 3組受試者PBMC中IL-1β水平比較 PAF組IL-1β水平高于CON組，低于nPAF組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組受試者PBMC中IL-1β水平比較

3 討論

AF為臨床常見心率失常，在心房重構(gòu)過程中會自發(fā)誘發(fā)炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致心律失常[12-13]，Bruins等[14]首次報道AF與炎癥間可能存在關(guān)聯(lián)性后，這種關(guān)聯(lián)性不久便被進(jìn)一步得到了驗證[15]，這表明炎癥過程是一個潛在的治療靶點。使用皮質(zhì)類固醇預(yù)防炎癥也可以減少電復(fù)律后AF復(fù)發(fā)[16-18]，而動物模型進(jìn)一步表明了AF和炎癥之間的關(guān)聯(lián)性，如犬無菌心包炎模型中，發(fā)生AF的幾率顯著增加[19-20]。

AF患體內(nèi)能檢測到炎癥活化(如中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的升高)及促炎因子(如IL-1β，IL-18和TNF-α等)釋放[3-9]。此外，在房顫的預(yù)后評估中，炎癥因子尚具有一定的預(yù)測價值[6，21]。一般認(rèn)為，持續(xù)應(yīng)用促炎細(xì)胞因子IL-1β，可通過環(huán)氧合酶和脂氧合酶途徑產(chǎn)生的脂質(zhì)第二信使改變心肌細(xì)胞的電學(xué)特性[22]；大鼠經(jīng)IL-1β受體拮抗劑(IL-1Ra)治療后，中性粒細(xì)胞蛋白酶導(dǎo)管素G注射分娩后表現(xiàn)出炎癥減少和心臟重塑和功能的改善[23]。IL-1β基因表達(dá)的上調(diào)影響膠原蛋白代謝，可能有助于AF期間的心房纖維化[24]。表明IL-1β可能參與了AF的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn)PAF組和nPAF組患者血清IL-1β水平高于對照組，nPAF組患者血清IL-1β水平高于PAF組，提示IL-1β可能參與了AF的發(fā)病。

關(guān)于炎癥的活化具有多種途徑，其中NLRP信號通路是近年來研究的熱點。機(jī)體在內(nèi)外源性損傷因素作用下可引起NLRP的表達(dá)并聚集ASC，激活Caspase-1，活化的Caspase-1促進(jìn)IL-1β的表達(dá)與成熟[25]。NLRP信號通路的異?；罨c類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)，克羅恩病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，腎小球腎炎等多種慢性炎癥疾病密切相關(guān)[26-29]。AF與在心臟組織和循環(huán)過程中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的免疫細(xì)胞和相關(guān)蛋白的浸潤有關(guān)[30]，但其具體機(jī)制尚不明確。本研究檢測患者PBMCs中NLRP1、ASC和Caspase-1信號通路的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PAF組和NPAF組患者外周血中NLRP1、ASC、Caspase-1 mRNA和蛋白表達(dá)均高于正常組，nPAF組高于PAF組；血清炎癥產(chǎn)物IL-1β表達(dá)在3組間與其一致；提示AF的發(fā)病可能與NLRP1-ASC-Caspase-1信號通路誘導(dǎo)的炎癥激活有關(guān)。

綜上所述，AF患者PBMC中NLRP1-ASC-Caspase-1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)隨著炎癥的激活而顯著增加，且隨AF類型的加重而增加。此外，目前還沒有對PBMCs中的相關(guān)信號通路采取干預(yù)措施，以驗證通路誘導(dǎo)的慢性炎癥在心房顫動治療中的作用。因此，歡迎更深入的動物實驗進(jìn)一步探索NLRP1通路在心房顫動中作用的具體機(jī)制。