物理法誘導(dǎo)花生芽細(xì)胞白藜蘆醇生產(chǎn)條件優(yōu)化

陶志杰，胡瑞瑞，顏成瑞，盧夢婷，賈付康

(蚌埠學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

白藜蘆醇，二苯乙烯類化合物，具有預(yù)防腫瘤，降低血小板聚集，治療動脈粥樣硬化，預(yù)防心腦血管疾病的功能[1]，現(xiàn)已在多個領(lǐng)域如食品、保健、臨床醫(yī)學(xué)、化妝品等得到應(yīng)用[2-4]。白藜蘆醇來源于植物體內(nèi)，主要有葡萄、虎杖、花生、桑葚等。白藜蘆醇是植物在受到外界脅迫時產(chǎn)生的植物抗毒素[5]。目前，白藜蘆醇主要從虎杖、釀酒副產(chǎn)品葡萄渣中回收，通過優(yōu)化提取工藝以獲得更高的提取率[6]。

植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗癌多酚的研究是生物工程新戰(zhàn)略。從植物細(xì)胞培養(yǎng)物中回收二苯乙烯可以被認(rèn)為是一種新的二苯乙烯來源[7]，已有研究者對葡萄等細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)白藜蘆醇進(jìn)行相關(guān)研究[8-9]。白藜蘆醇生物合成誘集方法主要包括生物誘集和非生物誘集[9-10]。生物誘集是利用微生物侵染植物體，誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生相關(guān)合成酶，從而合成白藜蘆醇。非生物誘集是利用物理[11-12]、化學(xué)[13-14]等因素刺激植物，誘發(fā)植物產(chǎn)生大量的白藜蘆醇。生物誘導(dǎo)并非所有微生物都有效果，需要通過實驗尋找微生物物種。而目前發(fā)現(xiàn)較為有效的非生物誘導(dǎo)方法主要有機(jī)械力、紫外照射、超聲波等作用[15]，研究表明，通過該類方法誘導(dǎo)植物體，白藜蘆醇含量可獲得數(shù)倍甚至數(shù)百倍的增長。誘集法是當(dāng)前白藜蘆醇合成方法的研究熱點之一。本研究利用物理復(fù)合方法誘導(dǎo)培養(yǎng)花生芽組織塊細(xì)胞制取白藜蘆醇，并利用正交試驗設(shè)計法對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為花生芽組織懸浮培養(yǎng)產(chǎn)白藜蘆醇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

花生品種：魯花一號花生帶殼種子，購于京東綠友園林專營店。

主要試劑：白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品(分析標(biāo)準(zhǔn)品≥98%，阿拉丁)，蔗糖、硫酸銅、無水乙醇等均為分析純。

主要儀器：FA214電子天平(上海?？惦娮觾x器廠)；微電腦智能控制豆芽機(jī)DYJ-S6031(小熊牌)。內(nèi)切式勻漿機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；JBQ-ZD全溫振蕩器(常州普天儀器制造有限公司)；JW-3021H高速離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；UV-9000型雙光束紫外可見分光光度計(上海元析科技儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1花生催芽及消毒

利用豆芽機(jī)進(jìn)行花生發(fā)芽，待發(fā)芽5天時采收。選取健康粗壯的花生芽，去根和子葉，留莖桿，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒待用[16]。

1.2.2花生芽莖細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)

稱取上述消毒花生芽莖2.00 g，切成1 cm小段，加入40 mL花生芽培養(yǎng)液(600 μmol/L CuSO43%蔗糖溶液)，在內(nèi)切式勻漿機(jī)下以不同轉(zhuǎn)速，不同處理時間對花生芽莖細(xì)胞進(jìn)行剪切力誘導(dǎo)，待花生芽莖組織塊分散后放入恒溫振蕩箱，紫外照射不同時間對花生芽細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。紫外照射處理后，在25 ℃下避光培養(yǎng)不同時間。待培養(yǎng)結(jié)束，提取白藜蘆醇，測定含量。

1.2.3白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，在50 mL容量瓶中添加白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品后用甲醇定容，稀釋搖勻，再取3 mL于25 mL容量瓶中用甲醇定容，吸取標(biāo)準(zhǔn)液 0、1、2、3、4、5 mL，再次分別定容25 mL，然后逐一測其在306 nm處的吸光值，測定3次，求平均值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)：

Y=0.1342X-0.0350，R2=0.9970

1.2.4白藜蘆醇含量的測定

將不同處理的花生細(xì)胞懸浮液，在高速勻漿機(jī)10000 r/min，1 min條件下破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎后，60 ℃水浴中乙醇浸提2 h。浸提結(jié)束后，在6000 r/min下離心1 min，取上清液在306 nm波長下測定白藜蘆醇吸光度[17]，通過公式計算白藜蘆醇含量:

W=(CVn)/M

式中：W為材料中白藜蘆醇的含量(μg/g)，M為花生芽的質(zhì)量(g)，V為花生細(xì)胞提取液體積(mL)，n為稀釋倍數(shù)，C為提取液白藜蘆醇的濃度(μg/mL)

1.2.5白藜蘆醇富集培養(yǎng)條件的單因素試驗

按1.2.2節(jié)方法誘導(dǎo)，在不同試驗條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)液中白藜蘆醇含量測定結(jié)果，考察：剪切速度：不同轉(zhuǎn)速3000、4000、5000、6000、7000 r/min，剪切18 s，紫外照射30 min，培養(yǎng)24 h；剪切時間：在4000 r/min轉(zhuǎn)速下，分別剪切0、6、12、18、24 s，紫外照射30 min，培養(yǎng)24 h；紫外照射時間：在4000 r/min轉(zhuǎn)速下剪切18 s，分別紫外照射0、10、30、50、70、90 min，培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)時間：在4000 r/min轉(zhuǎn)速下剪切18 s，紫外照射30 min后，分別培養(yǎng)16、20、24、28、40 h。培養(yǎng)結(jié)束后，按1.2.4節(jié)方法測定白藜蘆醇含量。

1.2.6物理誘導(dǎo)培養(yǎng)合成白藜蘆醇的正交試驗

在物理誘導(dǎo)作用下，白藜蘆醇富集培養(yǎng)條件單因素試驗基礎(chǔ)上，研究紫外照射時間(A)、培養(yǎng)時間(B)、剪切時間(C)、剪切速度(D)四個因素對白藜蘆醇含量的影響。進(jìn)行4因素3水平正交試驗，采用L9(34)正交試驗設(shè)計方案進(jìn)行誘導(dǎo)條件優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 正交因素水平表

1.2.7驗證試驗

取三份批次相同的花生芽組織塊，分別放入100 mL燒杯中，以優(yōu)化得出的最佳誘導(dǎo)條件培養(yǎng)，其余條件保持一致。按1.2.2節(jié)方法提取白藜蘆醇，測定含量，取平均值，驗證試驗的可重復(fù)性。

1.2.8比較試驗

取九份相同批次的花生芽，一組花生芽直接提取白藜蘆醇，重復(fù)三次；一組花生芽未經(jīng)過誘導(dǎo)條件處理，重復(fù)三次；一組花生芽以實驗所得最佳誘導(dǎo)條件處理，重復(fù)三次。比較三種不同條件中花生芽白藜蘆醇含量變化情況，得出物理誘導(dǎo)處理方式對白藜蘆醇含量差異的影響結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 剪切速度對花生芽白藜蘆醇含量的影響

圖1 剪切速度對花生芽白藜蘆醇含量的影響

由圖1可知，隨著剪切力度的增加，花生芽莖細(xì)胞會受到刺激而產(chǎn)生白藜蘆醇，但當(dāng)剪切速度達(dá)到4000-5000 r/min時，由于剪切力度過大，超過細(xì)胞承受能力而受損，白藜蘆醇合成降低。因此，當(dāng)剪切速度合適的時候?qū)ㄉ?xì)胞產(chǎn)白藜蘆醇呈正向激發(fā)。

2.2 剪切時間對花生芽白藜蘆醇含量的影響

由圖2可知，各組處理中剪切時間為12 s時，花生芽莖細(xì)胞合成白藜蘆醇含量最高。

圖2 剪切時間對花生芽白藜蘆醇含量的影響

在相同轉(zhuǎn)速條件下，隨著剪切時間的延長，白藜蘆醇含量呈上升趨勢，在最高峰時達(dá)(275±7.253) μg/g，比對照組提高了56.3%。再次證明剪切力大小對花生細(xì)胞產(chǎn)白藜蘆醇有刺激作用。隨著剪切時間的延長，剪切力度增大，導(dǎo)致細(xì)胞受損，代謝產(chǎn)物隨之減少。

2.3 紫外照射時間對花生芽白藜蘆醇含量的影響

資料顯示，紫外照射對植物合成白藜蘆醇有誘導(dǎo)作用(見圖3)。

圖3 紫外照射時間對花生芽白藜蘆醇含量的影響

從圖3中可以看出，固定紫外照射強(qiáng)度，隨著照射時間的延長，白藜蘆醇含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當(dāng)紫外照射時間達(dá)10 min時，白藜蘆醇含量達(dá)到最大值(566±14.385) μg/g，是對照組的2.0倍。紫外照射組均比對照組的白藜蘆醇含量高，說明紫外照射對花生細(xì)胞產(chǎn)白藜蘆醇有誘導(dǎo)作用。

2.4 培養(yǎng)時間對花生芽白藜蘆醇含量的影響

通過剪切和紫外照射復(fù)合處理后，花生細(xì)胞在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。由圖4可知，培養(yǎng)時間為20 h時白藜蘆醇含量達(dá)到峰值。

第四，實行綠色生產(chǎn)：推廣生物肥料，施用農(nóng)家肥；使用治標(biāo)又治本的植物農(nóng)藥；秸稈還田，改良土壤，減輕對化肥的依賴，減少環(huán)境污染。

圖4 培養(yǎng)時間對花生芽白藜蘆醇含量的影響

隨著培養(yǎng)時間的延長，白藜蘆醇含量減少，超過28 h后，急劇下降。由于細(xì)胞受到刺激，產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)后無法正常生長，白藜蘆醇含量出現(xiàn)急劇下降。因此，通過花生細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)白藜蘆醇適宜的培養(yǎng)時間為20 h。

2.5 花生芽莖細(xì)胞物理誘導(dǎo)培養(yǎng)的優(yōu)化試驗結(jié)果

2.5.1正交試驗結(jié)果

花生芽組織塊懸浮培養(yǎng)產(chǎn)白藜蘆醇的正交試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 花生芽產(chǎn)白藜蘆醇的正交試驗結(jié)果

表3 花生芽產(chǎn)白藜蘆醇正交試驗結(jié)果方差分析

由表2、表3可知，在花生芽組織塊細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)白藜蘆醇的研究試驗過程中，紫外時間、培養(yǎng)時間、剪切時間、剪切速度四因素對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響大小為A﹥B﹥C﹥D，即紫外時間﹥培養(yǎng)時間﹥剪切時間﹥剪切速度。最優(yōu)組合條件為A2B2C2D1：紫外處理時間為10 min，培養(yǎng)時間為 20 h，剪切時間為12 s，剪切速度為 4000 r/min。此外，還可以看出剪切力對細(xì)胞產(chǎn)白藜蘆醇有影響但不顯著，紫外照射時間對白藜蘆醇產(chǎn)量的影響表現(xiàn)極顯著，證明了紫外照射一定時間對花生芽細(xì)胞產(chǎn)白藜蘆醇有很大的影響，細(xì)胞培養(yǎng)20 h為最佳收集期。

2.5.2驗證試驗結(jié)果

取3份根據(jù)上述最優(yōu)條件誘導(dǎo)處理培養(yǎng)的花生芽細(xì)胞團(tuán)，測得懸浮培養(yǎng)花生芽莖細(xì)胞中白藜蘆醇平均含量為(585±15.752) μg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=2.8%，表明該培養(yǎng)條件穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性較好。

2.5.3比較試驗結(jié)果

通過三組不同試驗條件測定其白藜蘆醇含量，結(jié)果見表4。

表4 比較試驗結(jié)果

未經(jīng)培養(yǎng)，直接從花生芽莖中提取白藜蘆醇，得到平均含量為(154±3.832) μg/g，未經(jīng)物理誘導(dǎo)處理直接培養(yǎng)后提取白藜蘆醇的結(jié)果比第一組的增長了41%。通過人工物理誘導(dǎo)刺激花生芽莖細(xì)胞培養(yǎng)后，其白藜蘆醇含量大幅度增加，增長率為284%，是第一組白藜蘆醇含量的3.8倍。因此可以得出，紫外照射和機(jī)械剪切物理誘導(dǎo)對花生芽莖細(xì)胞產(chǎn)白藜蘆醇有明顯地刺激作用。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗對物理法誘導(dǎo)花生芽細(xì)胞富集白藜蘆醇條件進(jìn)行優(yōu)化。采集發(fā)芽5天的花生芽莖，在剪切速度4000 r/min下剪切12 s，通過紫外照射10 min后再培養(yǎng)20 h。在此條件下測得懸浮培養(yǎng)花生芽莖細(xì)胞中白藜蘆醇平均含量為(585±15.752) μg/g。通過人工物理誘導(dǎo)刺激花生芽莖細(xì)胞培養(yǎng)后，其白藜蘆醇含量增長率為284%。實驗中采用紫外分光光度計法測定白藜蘆醇含量應(yīng)比HPLC法測定值偏高。雖然存在偏差，但仍可測定出物理誘導(dǎo)對花生芽細(xì)胞產(chǎn)白藜蘆醇的顯著差異。后續(xù)實驗將會對細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察，掌握細(xì)胞生長狀態(tài)與產(chǎn)白藜蘆醇的關(guān)系。本研究利用了花生芽莖組織塊懸浮培養(yǎng)合成白藜蘆醇，與黃衛(wèi)文[18]的方法相比較，具有培養(yǎng)液無需滅菌、培養(yǎng)時間短、操作簡單等優(yōu)點，可以為植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)白藜蘆醇提供了新途徑。