Beclin1和Ki67在肺腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義▲

張秀玲 龐 晨 葉星江 劉姍姍 張錫流

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南寧市 530001，電子郵箱：414845910@qq.cm)

肺癌是世界各國常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率位居惡性腫瘤之首[1-2]，其也是廣西高發(fā)的惡性腫瘤之一[3]，且發(fā)病率有逐年增長之勢(shì)[4]。肺腺癌早期癥狀隱匿，不易發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時(shí)已多為晚期，并伴多部位轉(zhuǎn)移[5]。自噬與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，是目前的研究熱點(diǎn)。Beclin1是自噬的重要調(diào)控因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)自噬活性[6]。研究顯示，Beclin1蛋白在肺腺癌組織中表達(dá)，但其表達(dá)水平不一致，且機(jī)制未明[7-8]。Ki67是判斷細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)，其陽性表達(dá)率與腫瘤細(xì)胞增殖活躍程度密切相關(guān)[9]，并且臨床上已將其作為重要的腫瘤風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)，用于判斷腫瘤的進(jìn)展、惡性程度等，具有重要的生物學(xué)意義及臨床意義[10]。Beclin1與Ki67在肺腺癌中的表達(dá)關(guān)系如何，還未見相關(guān)報(bào)道。本研究探討自噬相關(guān)蛋白Beclin1與Ki67在肺腺癌中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年10月至2019年10月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的100例肺腺癌患者的癌組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：初診患者且臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)前接受過放療、化療等抗癌治療；合并其他惡性腫瘤等。記錄肺腺癌患者的臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤-淋巴結(jié)-遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并獲得批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器及試劑 HH-B11型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；BCD-227B型立式冷藏柜(青島海爾股份有限公司)；BX41-SD02光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)。鼠抗人Ki67單克隆抗體(一抗/即用型，福建邁新公司，批號(hào)：1907170672h、190704S407b)；Beclin1單克隆抗體(一抗，美國Abcam公司，批號(hào)：GR3204186-2)；即用型快捷免疫組化MaxVision-HRP鼠/兔(通用二抗，福建邁新公司，批號(hào)：190704S407b)。

1.3 免疫組化法檢測(cè)Beclin1與Ki67的表達(dá) 將肺腺癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本用10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟包埋及并制作切片(厚度4 μm)，采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(streptavidin-peroxidase,SP)法檢測(cè)癌組織及癌旁組織的Beclin1蛋白表達(dá)和Ki67增殖指數(shù)情況。先使用多聚賴氨酸防脫載玻片貼4 μm石蠟切片，75℃烤片30 min，再將切片脫蠟至水；加入一定量的pH 6.0檸檬酸緩沖液(液面高過切片為度)，加溫至沸騰進(jìn)行抗原熱修復(fù)；冷卻后，將組織切片置于3% H2O2水溶液中15～20 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，用磷酸鹽緩沖液沖洗3次(1 min/次)；滴加適當(dāng)稀釋的一抗[Beclin1(1 ∶80)、ki67抗體(即用型)]，37℃孵育90～120 min，4℃過夜后用磷酸鹽緩沖液沖洗3次(3 min/次)；滴加二抗37℃孵育30 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次(5 min/次)；二氨基聯(lián)苯胺顯色3～10 min，顯微鏡下監(jiān)控顯色程度，水洗終止顯色，之后進(jìn)行蘇木精復(fù)染、1%鹽酸酒精分化、飽和碳酸鋰水溶液返藍(lán)、梯度酒精脫水、透明，最后封片觀察。

1.4 結(jié)果判讀 由兩位主治醫(yī)師以上級(jí)別病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片。如果兩位醫(yī)生閱片結(jié)果不一致，則協(xié)商確定結(jié)果。

1.4.1 Beclin1蛋白：該蛋白主要表達(dá)于肺腺癌細(xì)胞胞質(zhì)，陰性細(xì)胞呈淡黃色、黃色或棕黃色顆粒。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞；根據(jù)細(xì)胞染色評(píng)分和陽性細(xì)胞百分比評(píng)分乘積判斷Beclin1的表達(dá)情況[11]。(1)細(xì)胞染色評(píng)分。無染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。(2)陽性細(xì)胞百分比評(píng)分。無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞百分比<10%為1分，陽性細(xì)胞百分比10%～49%為2分，陽性細(xì)胞百分比50%～74%為3分，陽性細(xì)胞≥75%為4分。計(jì)算細(xì)胞染色評(píng)分與陽性細(xì)胞百分比評(píng)分的乘積，乘積≤3分為陰性表達(dá)，乘積>3分為陽性表達(dá)。

1.4.2 Ki67：Ki67表達(dá)于肺腺癌細(xì)胞細(xì)胞核中，陽性表達(dá)為棕黃色。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞；細(xì)胞無染色為陰性(-)，陽性細(xì)胞百分比<10%為弱陽性(1+)，陽性細(xì)胞百分比10%～49%為陽性(2+)，陽性細(xì)胞數(shù)≥50%為強(qiáng)陽性(3+)[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Beclin1蛋白在癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況 Beclin1蛋白表達(dá)于肺腺癌細(xì)胞胞質(zhì)，呈淺黃色至棕黃色顆粒，見圖1。100例癌組織中，Beclin1蛋白陽性79例，陽性表達(dá)率為79%；100例癌旁組織中，Beclin1蛋白陽性23例，陽性表達(dá)率為23%。癌組織Beclin1陽性表達(dá)率高于癌旁組織(χ2=62.745，P<0.001)。

圖1 Beclin1在癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(SP染色，×400)

2.2 癌組織Beclin1蛋白表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同Beclin1蛋白表達(dá)情況的患者之間年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 癌組織Beclin1蛋白表達(dá)情況與患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 癌組織中Beclin1蛋白表達(dá)陽性和陰性患者間Ki67表達(dá)情況的比較 79例Beclin1蛋白陽性的癌組織中，Ki67強(qiáng)陽性16例，陽性47例，弱陽性或陰性16例；21例Beclin1陰性的癌組織中，Ki67強(qiáng)陽性3例，陽性7例，弱陽性或陰性11例。Beclin1蛋白陽性的癌組織中Ki67表達(dá)水平高于Beclin1蛋白陰性的癌組織(z=2.356，P=0.019)。

3 討 論

自噬是真核細(xì)胞中細(xì)胞初級(jí)溶酶體處理內(nèi)源性底物的分解過程，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和蛋白代謝平衡均有十分重要的作用[6]。研究表明，自噬不僅是細(xì)胞自我保護(hù)的一種方式，在一定條件下也可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]；而與此同時(shí)，自噬可抑制凋亡的發(fā)生，其通過清除受損細(xì)胞器或蛋白，為細(xì)胞重新供能，使細(xì)胞免于凋亡[6]。Beclin1基因位于人類染色體17q21，主要定位于細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體[13]。Beclin1是首個(gè)被鑒定出來的介導(dǎo)哺乳動(dòng)物自噬的基因，在細(xì)胞自噬的調(diào)控中起到關(guān)鍵作用；其可招募自噬關(guān)鍵蛋白到自噬體前體，與Vps34和ps15形成復(fù)合物，參與自噬的早期階段，促進(jìn)自噬囊泡的成核，并從胞質(zhì)中吸收蛋白質(zhì)[15]。因此，Beclin1的異常表達(dá)可引起自噬和凋亡分子通路受損，從而導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生[16-17]。

不同的研究中，肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率存在差異：張秀義等[8]報(bào)告肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率為30.43%：董桂蘭等[11]報(bào)告肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率為51.2%；Wang等[18]報(bào)告肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率為46.15%。本研究結(jié)果顯示，Beclin1蛋白主要表達(dá)于肺腺癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，且癌組織Beclin1蛋白陽性表達(dá)率為79%，高于癌旁組織(P<0.05)，也明顯高于上述研究結(jié)果，與孫雪麗等[19]報(bào)告的肺腺癌組織Beclin1蛋白陽性率(86.36%)相近，但與杜海磊等[7]報(bào)告的研究結(jié)果(肺腺癌癌組織Beclin1蛋白陽性表達(dá)率低于癌旁組織)相反。在本研究中，Beclin1蛋白表達(dá)情況可能與肺腺癌患者的臨床病理特征(年齡、性別、TNM分期、腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況)無關(guān)，與孫雪麗等[19]的研究結(jié)果相似。但相關(guān)研究顯示，肺腺癌患者Beclin1蛋白表達(dá)情況與其腫瘤分化程度[8，18]、TNM分期[11]、臨床分期[7]、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況[7-8，18]、吸煙[18-19]、性別[18]相關(guān)。造成這些差異的原因可能與研究樣本量、納入標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)方法、標(biāo)本固定處理方法不同有關(guān)。

Ki67是判斷細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)，其陽性表達(dá)率與腫瘤細(xì)胞增殖活躍程度密切相關(guān)[9]。因Ki67的半衰期短，臨床上已將其作為評(píng)估腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)，用于判斷腫瘤的進(jìn)展、惡性程度等，具有重要的生物學(xué)意義及臨床意義[10]。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌癌組織Beclin1蛋白陽性患者的Ki67表達(dá)水平高于癌組織Beclin1蛋白陰性的患者(P<0.05)，提示Beclin1或可通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖分裂，參與肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展。但因本研究樣本量有限，相關(guān)研究結(jié)論有待大樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，自噬相關(guān)基因Beclin1在肺腺癌組織中高表達(dá)，且在Beclin1高表達(dá)的肺腺癌組織中Ki67也高表達(dá)。由此推測(cè)，Beclin1蛋白促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖分裂，從而參與肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展，其有望成為判斷肺腺癌惡性程度的生物學(xué)指標(biāo)。