沉默miR-221抑制裸鼠舌鱗癌移植瘤早期 改變的IVIM-DWI研究

張夢潔, 肖澤宇, 李嫻, 何舒奇*

(1. 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì) 第九〇四醫(yī)院 口腔科, 江蘇 無錫 214000； 2. 暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 影像中心，廣東 廣州 516032； 3. 暨南大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 口腔醫(yī)療中心, 廣東 廣州 516032; 4. 暨南大學(xué) 附屬口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 516032)

全球每年大約有2%的新發(fā)生癌癥為口腔癌，且在口腔癌中舌鱗狀細(xì)胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC) 所占的比例最高,約40%左右[1].目前，盡管舌鱗癌手術(shù)、放療和化療有一些進(jìn)展，但患者5年生存率仍只有50%左右[2].因此，進(jìn)一步探討舌鱗癌的發(fā)病機(jī)制以及潛在治療靶點(diǎn)將有助于舌癌的治療.本課題組前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)miRNA-221在舌鱗癌細(xì)胞中高表達(dá)，并具有促進(jìn)舌鱗癌增殖和侵襲遷移的能力[3].該實(shí)驗(yàn)建立了裸鼠舌鱗癌皮下移植瘤模型，基于體素內(nèi)不相干運(yùn)動(intravoxel incoherent motion, IVIM)原理，采用多b值彌散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging, DWI)掃描技術(shù)，對沉默miR-221抑制裸鼠舌鱗癌皮下移植瘤生成，進(jìn)行監(jiān)測與定量評估，并結(jié)合病理組織學(xué)與免疫組化結(jié)果，探討抑制miR-221的表達(dá)對早期病理生理改變與IVIM參數(shù)的相關(guān)性.

1 材料與方法

1.1 材料

人舌鱗癌細(xì)胞株UM1購自中科院上海細(xì)胞庫.4～5周齡BALB/C裸鼠12只，雌性，體質(zhì)量為16～20 g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心.實(shí)驗(yàn)條件負(fù)荷無特定病原體(SPF)要求所用物品均經(jīng)高溫滅菌消毒.

RPMI 1640購自美國sigma公司，無菌滅活小牛血清購自美國Gibco公司，胰蛋白酶凍干粉購自美國Invitrogen公司.釓貝葡胺注射液(商品名：莫迪司)購自意大利博萊科公司，質(zhì)量摩爾濃度為0.1 mmol/kg(0.2 mL/kg).

1.2 方法

1.2.1 人舌鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立

實(shí)驗(yàn)分為兩組，各6只裸鼠.實(shí)驗(yàn)組在裸鼠腋下皮下注射慢病毒穩(wěn)定低表達(dá)miR-221的UM1細(xì)胞(即anti miR-221組)，對照組在相同部位注射慢病毒空載體的UM1細(xì)胞(即miR-NC組).消化對數(shù)生長期細(xì)胞，離心、計(jì)數(shù)，用無血清RPMI 1640制成細(xì)胞懸液(5×107/mL)，按每只鼠0.2 mL接種于裸鼠右側(cè)腋下.常規(guī)飼養(yǎng)，建立裸鼠舌鱗癌皮下移植瘤模型.每日觀察記錄裸鼠及皮下瘤灶的生長狀態(tài).

1.2.2 核磁共振影像(MRI)檢查及數(shù)據(jù)后處理

實(shí)驗(yàn)組和對照組于接種后7、21 d，進(jìn)行體素內(nèi)不相干運(yùn)動彌散成像，動態(tài)測量真性擴(kuò)散系數(shù)(D值)、假性擴(kuò)散系數(shù)(D*值)及灌注分?jǐn)?shù)(f值).在21 d掃描完畢后全部處死取腫瘤組織.并將病理結(jié)果與MRI表現(xiàn)進(jìn)行對照分析.每只裸鼠在掃描前尾靜脈注射體積分?jǐn)?shù)為4%水合氯醛(10 μL/g)進(jìn)行麻醉.MRI檢查采用美國GE公司的Signa 1.5T MR掃描儀，動物線圈，頭先進(jìn)，仰臥位，將移植瘤的中心定位于線圈及磁體的中心.掃描序列：常規(guī)快速自旋回波序列(fast spin echo，F(xiàn)SE)的T1加權(quán)像，參數(shù)：TE=17.6 ms，TR=440 ms，層厚2 mm，層間距0.2 mm，F(xiàn)OV=7.0 cm×4.9 cm，矩陣256×192，NEX=2.快速恢復(fù)自旋回波(fast recovery fast spin echo，F(xiàn)RFSE)的T2加權(quán)像，相關(guān)參數(shù)：TR=2 280 ms，TE=77.6 ms，F(xiàn)OV=7.0 cm×5.6 cm，矩陣256×192，NEX=2，層厚2 mm，層間距0.2 mm.IVIM-DWI檢查序列：TR=4 200 ms，TE=101.7 ms，F(xiàn)OV=7.0 cm×5.6 cm，矩陣256×192，NEX=2，層厚2 mm，層間距0.2 mm.共13個b值，分別為0、25、50、75、100、150、200、400、600、800、1 000、1 200、1 500 s/mm2，對應(yīng)的NEX分別為1、2、2、3、3、3、4、4、4、6、6、8、10，擴(kuò)散梯度分別施加于x、y、z三個方向，軸位掃描.

數(shù)據(jù)處理在美國GE公司提供的ADW 4.5圖像后處理工作站進(jìn)行，觀察常規(guī)序列T1WI、T2WI圖像，根據(jù)經(jīng)典雙指數(shù)模型對原始圖像進(jìn)行分析得到D值、D*值及f值.感興趣區(qū)(region of interest，ROI)選取IVIM-DWI序列上腫瘤最大層面及其上、下兩個相鄰層面，盡量避開脂肪、血管及壞死區(qū)域，測量3個層面的ROI并取平均值.IVIM-DWI的計(jì)算公式：Sb/S0=(1-f)×exp(-bD)+f×exp(-bD*)，Sb是不同b值的信號強(qiáng)度，S0是b值為0時(shí)的信號強(qiáng)度，D代表體素內(nèi)真性擴(kuò)散系數(shù)，D*為假性擴(kuò)散系數(shù)，f是灌注分?jǐn)?shù)[4].

1.2.3 病理學(xué)及CD34免疫組化分析

實(shí)驗(yàn)組和對照組各6只，分別在21 d處死取腫瘤組織，稱質(zhì)量后將標(biāo)本浸于體積分?jǐn)?shù)為10%福爾馬林中，行HE染色和免疫組化.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)MRI表現(xiàn)

anti miR-221組和miR-NC組在細(xì)胞接種后第7天，所有裸鼠MRI檢查結(jié)果顯示陽性.MRI橫斷位掃描顯示，與周圍組織相比，兩組T1WI均呈等信號，T2WI均呈高信號，邊界清晰(圖1 a-d).

anti miR-221組和miR-NC組在細(xì)胞接種后第21天，MRI橫斷位掃描顯示，與周圍組織相比，anti miR-221組T1WI呈等信號，T2WI以高信號為主，內(nèi)見少許點(diǎn)狀更高信號區(qū)，邊界清晰(圖2 a-b)；miR-NC組T1WI呈等信號，T2WI呈高信號為主的混雜信號，內(nèi)見大面積片狀更高信號及等信號區(qū)，邊界清晰(圖2 c-d).T1WI 增強(qiáng)掃描后，兩組瘤灶均呈不均勻強(qiáng)化，以瘤灶周緣強(qiáng)化明顯(圖2 e-f).

2.2 IVIM-DWI影像檢查結(jié)果

anti miR-221實(shí)驗(yàn)組和miR-NC對照組各6只裸鼠，在細(xì)胞接種后第7天，實(shí)驗(yàn)組和對照組的D值，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P值為0.106，但第21天實(shí)驗(yàn)組的D值高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值為0.000；在細(xì)胞接種后第7天和21天，實(shí)驗(yàn)組的D*值均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.000、0.000；實(shí)驗(yàn)組的f值均低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.001、0.000(圖3-4).

圖4 各時(shí)間點(diǎn)腫瘤IVIM-DWI序列相關(guān)參數(shù)偽彩圖Fig.4 The colour map of IVIM-DWI parameters of each time point

2.3 病理結(jié)果

HE染色：100倍鏡下，兩組腫瘤細(xì)胞均排列成巢狀或片狀，細(xì)胞大小形態(tài)不一，邊界清楚，胞漿比例增加，細(xì)胞核大而深染，核分裂象多見，符合鱗狀細(xì)胞癌的結(jié)構(gòu)特征.400倍鏡下，可以看到與anti miR-221組相比，miR-NC組腫瘤內(nèi)細(xì)胞數(shù)量減少，壞死增多，組織結(jié)構(gòu)排列紊亂(圖5).

CD34血管染色：anti miR-221組的陽性染色局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞膜及胞質(zhì)，呈點(diǎn)狀或線狀的散在分布，而miR-NC組血管數(shù)量明顯增加，呈環(huán)狀分布(圖5).

圖5 腫瘤HE染色切片鏡下表現(xiàn)，免疫組化檢測CD34的表達(dá)Fig.5 Tumor HE staining and Immunohistochemistry test of CD34 expression

3 討論

3.1 miR-221的作用機(jī)制

Micro RNAs(miRNAs)是一類長度為18～25個核苷酸，內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，進(jìn)化過程中非常保守[5].miRNA調(diào)控是基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的一個基本因素，在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、代謝和分化等過程中發(fā)揮著重要作用[6].miR-221 在許多癌癥患者的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，不斷有研究報(bào)道在白血病、肝癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌等腫瘤[7-11]中，miR-221異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著密切聯(lián)系.然而miR-221在舌鱗癌中的研究并不是很深入，需要進(jìn)一步對其機(jī)制進(jìn)行探究.

3.2 IVIM-DWI相關(guān)參數(shù)的臨床價(jià)值

DWI是目前應(yīng)用最廣泛的功能磁共振成像技術(shù)，最早通過單指數(shù)模型計(jì)算表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)值來比較簡單的組織內(nèi)水分子的彌散程度[12].Le Bihan[13]于1985年首次提出體素內(nèi)不相干運(yùn)動理論(intravoxel incoherent motion, IVIM)，認(rèn)為活體組織內(nèi)的水分子擴(kuò)散不僅包括真實(shí)的水分子擴(kuò)散，還包括微循環(huán)灌注引起的假性擴(kuò)散.采用多b值DWI掃描，應(yīng)用雙指數(shù)模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，將組織水分子的擴(kuò)散和微循環(huán)灌注進(jìn)行分離，更加真實(shí)的反映組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散狀態(tài)[14].該模型計(jì)算得到的影像學(xué)指數(shù)有：D值、D*值、f值.其中D值代表活體內(nèi)水分子的擴(kuò)散，反映擴(kuò)散的情況；D*與f值代表水分子在血管內(nèi)宏觀運(yùn)動，反映灌注的情況[15].因此，IVIM 比DWI更能準(zhǔn)確地反映腫瘤微觀的變化，對病變的定性和鑒別診斷，評價(jià)癌癥治療的療效等方面具有更重要的作用.

3.3 沉默miR-221后IVIM-DWI序列相關(guān)參數(shù)及其病理學(xué)變化

裸鼠皮下移植瘤模型具有可重復(fù)性，數(shù)據(jù)可以量化，成功率較高，生物學(xué)特性保持較好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于許多生物醫(yī)學(xué)研究[16].本研究建立了12只人舌鱗癌裸鼠皮下移植瘤模型，生長良好，成瘤率達(dá)到100%.

實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別對裸鼠行T1WI、T2WI及連續(xù)動態(tài)增強(qiáng)掃描，可以清晰顯示皮下腫瘤的位置，進(jìn)而觀察腫瘤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及周圍情況，經(jīng)尾靜脈注射 MR對比劑釓貝葡胺能使腫瘤得到明顯強(qiáng)化.第7天時(shí)，兩組腫瘤邊界清晰，在 T1WI上呈等信號，T2WI上呈高信號，信號尚均勻，瘤內(nèi)無明顯的出血和脂肪變性.第21天時(shí)，兩組腫瘤邊界清晰，在T1WI上呈等信號，T2WI上表現(xiàn)為以高信號為主的不均勻混雜信號，這一特征在對照組表現(xiàn)更為突出，腫瘤內(nèi)部的更高信號區(qū)病理證實(shí)為壞死組織.說明舌鱗癌生長較快，內(nèi)部血供不足，引起局部組織的缺血壞死，這也與病理檢查結(jié)果相一致.T1WI增強(qiáng)掃描后，所有瘤灶周邊強(qiáng)化明顯，而內(nèi)部無強(qiáng)化區(qū)，說明周邊為供血豐富的生長活躍區(qū).

在細(xì)胞接種后第21天，實(shí)驗(yàn)組的D值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明第21天實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長較慢，腫瘤細(xì)胞密度和活性降低.而在細(xì)胞接種后第7天 和21天，實(shí)驗(yàn)組的D*值、f值均顯著低于對照組，說明實(shí)驗(yàn)組的血流灌注低于對照組.以上結(jié)果證實(shí)沉默miR-221表達(dá)后，瘤體內(nèi)細(xì)胞增殖活性降低，新生血管形成受到抑制.CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，在腫瘤新生血管的形成中起重要作用[17].CD34表達(dá)水平與腫瘤微血管生成有一定的相關(guān)性，蛋白表達(dá)水平越高，腫瘤微血管越多.CD34在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)降低，說明沉默miR-221表達(dá)后，細(xì)胞的增殖減慢，微血管的形成受到抑制，這一結(jié)果與IVIM-DWI的結(jié)果相一致.

綜上所述，沉默miR-221的表達(dá)能顯著抑制裸鼠皮下移植瘤體的生長，IVIM-DWI相關(guān)參數(shù)可以定量檢測裸鼠移植瘤的真實(shí)擴(kuò)散信息和微循環(huán)灌注信息，從而間接地反映沉默miR-221后抑制腫瘤生長的療效.進(jìn)一步證實(shí)了 miR-221作為潛在的分子靶點(diǎn)，在舌鱗癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用.