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    長(zhǎng)鏈非編碼RNA FGD5-AS1通過(guò)miR-542-3p/GTPBP4對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響

    2021-04-07 00:32:10陳新章諾貝
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染熒光素酶克隆

    陳新, 章諾貝

    (1. 南昌大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科,江西 南昌 330000; 2. 南昌大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,江西 南昌 330000)

    原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是世界上第6大最常見(jiàn)的惡性腫瘤,其死亡率居全球癌癥死亡率第3位[1-2].目前,放療是治療HCC常用的方法之一.然而,放射抗性的發(fā)生和發(fā)展已經(jīng)成為治療肝癌的主要臨床障礙[3].因此,提高肝癌細(xì)胞的對(duì)放射的敏感性是提升放療效果的有效途徑.

    多項(xiàng)研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的對(duì)放射的敏感性中起著至關(guān)重要的作用[4-5].lncRNA SNHG1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織,沉默SNHG18可以通過(guò)抑制信號(hào)素5A,提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性[6].lncRNA OIP5-AS1在耐輻射的結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),沉默OIP5-AS1通過(guò)調(diào)控miR-369-3p/DYRK1A的表達(dá)以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞活性,抑制放射誘導(dǎo)的LoVo細(xì)胞凋亡[7].研究發(fā)現(xiàn),lncRNA FGD5-ASl可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[8],但其在腫瘤放射敏感性中的作用至今仍不清楚.

    miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA,可在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控[9].研究發(fā)現(xiàn),miRNA在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的放射敏感性中起關(guān)鍵作用[10].沉默miR-21可以通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路,增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性[11].沉默miR-214可以通過(guò)上調(diào)p38MAPK的表達(dá),以增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性[12].過(guò)表達(dá)miR-133a可通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)從而增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的放射敏感性[13].研究發(fā)現(xiàn),miR-542-3p可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖與侵襲,但在腫瘤放射敏感性中的作用至今仍不清楚[14].本研究探究了lncRNA FGD5-AS1、miR-542-3p及其下游靶基因在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)以及在調(diào)控HCC放射敏感性中的作用機(jī)制.

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò),并獲得所有患者的知情同意書(shū).21對(duì)HCC組織和癌旁組織取自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院的肝癌手術(shù)患者.所有患者經(jīng)組織病理學(xué)確診為肝癌,且術(shù)前未接受任何輔助治療.樣品儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中.

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及輻射

    人肝細(xì)胞(LO2)和肝癌細(xì)胞系(Huh7、SMMC-7721、PLC5和Bel-7402)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).LO2、SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Solarbio公司)中培養(yǎng).Huh7和PLC5細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Solarbio公司)中培養(yǎng).將細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng).用X射線發(fā)生器(劑量率2 Gy/min)對(duì)細(xì)胞照射,Huh7和PLC5細(xì)胞給予0、2、4、6或8 Gy輻射劑量照射.

    1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    上海吉瑪公司構(gòu)建質(zhì)粒sh-GTPBP4、si-FGD5-AS1、miR-542-3p、anta-miR-542-3p及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒.使用PCR擴(kuò)增FGD5-AS1的全長(zhǎng)序列并克隆到pcDNA-3.1載體中,構(gòu)建pcDNA-FGD5-AS1質(zhì)粒用于過(guò)表達(dá)FGD5-AS1.采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將sh-GTPBP4、si-FGD5-AS1、miR-542-3p、anta-miR-542-3p、sh-NC、si-NC、miR-NC、anta-NC、pcDNA-FGD5-AS1和pcDNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Huh7和PLC5細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).本研究中所用的shRNA GTPBP4,siRNA FGD5-AS1和anta-miR-542-3p的序列見(jiàn)表1.

    表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

    1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

    根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū),使用TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)從組織和細(xì)胞中分離總RNA.使用PrimeScriptTMRT試劑盒(美國(guó)Takara公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.在序列檢測(cè)系統(tǒng)(ABI Prism 7700;美國(guó)ABI公司)上使用PrimeScriptTMRT reagent kit(日本Takara公司)檢測(cè)基因的表達(dá)水平.通過(guò)TaqMan miRNA assay試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)分析miR-542-3p在組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平.使用β-actin作為FGD5-AS1和GTPBP4的內(nèi)參基因,U6作為miR-542-3p的內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法檢測(cè)FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4的相對(duì)表達(dá)水平.本研究所用的引物序列見(jiàn)表2.

    表2 RT-PCR引物序列Table 2 Primer sequence of RT-PCR

    1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

    使用含有蛋白抑制劑的RIPA buffer(美國(guó)Solarbio公司)提取Huh7和PLC5細(xì)胞的總蛋白.使用Enhanced BCA Protein Assay Kit(上海Beyotime公司)檢測(cè)蛋白表達(dá).取30 μg蛋白樣品以質(zhì)量分?jǐn)?shù)14% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上.使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉后,將聚偏氟乙烯膜浸泡在一抗GTPBP4 (V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000,英國(guó)Abcam公司)和抗β-actin(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000,美國(guó)Boster公司)稀釋液二抗稀釋液(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶2 000,美國(guó)Boster公司)中,室溫孵育1 h;洗膜液洗膜后使用BeyoECL Plus(上海Beyotime公司)試劑盒顯色,以β-actin作為內(nèi)參基因,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,ImageJ(美國(guó)NIH Image公司)軟件分析蛋白條帶灰度值.

    1.6 克隆形成試驗(yàn)

    轉(zhuǎn)染后,分別給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、2、4、6和8 Gy的輻射照射.細(xì)胞培養(yǎng)5 d后,用甲醇固定15 min,并在室溫條件下使用結(jié)晶紫(美國(guó)Solarbio公司)染色20 min,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞/克隆),放射細(xì)胞存活曲線計(jì)算如下:存活分?jǐn)?shù)=處理組集落形成率/對(duì)照組集落形成率.

    1.7 流式細(xì)胞儀分析

    Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)分析Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡.轉(zhuǎn)染后,給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、6 Gy劑量照射,細(xì)胞離心后懸浮于1 × Annexin V Binding buffer(500 μL).Annexin V-FITC(5 μL)在黑暗條件下處理細(xì)胞5 min.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況.

    1.8 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

    擴(kuò)增野生型和突變型的GTPBP4 3′UTR區(qū)的堿基序列(包含miR-542-3p位點(diǎn)),并將其分別克隆到熒光素酶報(bào)告載體(pmiR-RB-Report)中構(gòu)建pmiR-GTPBP4-WT和pmiR-GTPBP4-MUT載體.同樣將野生型和突變型的FGD5-AS1 3′UTR區(qū)的堿基序列克隆到熒光素酶報(bào)告載體(pmiR-RB-Report)中構(gòu)建pmiR-FGD5-AS1-WT和pmiR-FGD5-AS1-MUT載體.將熒光素酶報(bào)告載體和miR-542-3p、anta-miR-542-3p、miR-NC和anta-NC共轉(zhuǎn)染人Huh7細(xì)胞.轉(zhuǎn)染48 h后,用熒光素酶測(cè)定試劑盒(美國(guó)Pharmingen公司)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的相對(duì)活性.

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用student’sttest分析兩組組間的差異.多組組間差異采用單因素方差分析以及Tukey’s post hoc進(jìn)行檢驗(yàn).以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    2.1 FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)

    FGD5-AS1和GTPBP4的mRNA表達(dá)水平在肝癌組織中升高(P<0.01,圖1A、1C).相反,miR-542-3p在HCC組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(P<0.01,圖1B).此外,與人肝細(xì)胞(LO2)相比,F(xiàn)GD5-AS1和GTPBP4的mRNA表達(dá)水平在HCC細(xì)胞系顯著升高,miR-542-3p表達(dá)水平顯著降低(圖1D-1F).由此可見(jiàn),在HCC組織和細(xì)胞中,F(xiàn)GD5-AS1和GTPBP4表達(dá)上調(diào),miR-542-3p表達(dá)下調(diào).

    2.2 下調(diào)GTPBP4可增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

    為探討GTPBP4在HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用,通過(guò)向HCC細(xì)胞(Huh7和PLC5)中轉(zhuǎn)染sh-GTPBP4、sh-NC降低HCC細(xì)胞中GTPBP4的表達(dá)水平.qRT-PCR和Western blot檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),與sh-NC組相比,sh-GTPBP4組中GTPBP4的mRNA和蛋白水平明顯降低(圖2A-2D).采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析了沉默GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞系放射敏感性的影響.用sh-GTPBP4或sh-NC轉(zhuǎn)染Huh7和PLC5細(xì)胞,分別給予0、2、4、6和8Gy的劑量照射.結(jié)果表明,沉默GTPBP4對(duì)Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力具有放射劑量依賴性的抑制作用(圖2E、2F).在沒(méi)有或存在放射線照射(6Gy)的情況下,敲除GTPBP4促進(jìn)了Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡(圖2G、2H).這些結(jié)果表明GTPBP4的下調(diào)可以增強(qiáng)HCC細(xì)胞的放射敏感性.

    1)與癌旁組織比較,P<0.01;2)與人肝細(xì)胞比較,P<0.05;3)與人肝細(xì)胞比較,P<0.01.1)Compared with normal tissues,P<0.01;2)Compared with human hepatocyte cells,P<0.05;3)Compared with human hepatocyte cells,P<0.01qRT-PCR分析HCC組織中(A)FGD5-AS1、(B)miR-542-3p和(C)GTPBP4的表達(dá)水平.qRT-PCR分析HCC細(xì)胞(Huh7、SMMC-7721、PLC5和Bel-7402)中(D)FGD5-AS1、(E)miR-542-3p和(F)GTPBP4的表達(dá)水平qRT-PCR analysis of (A)FGD5-AS1, (B)miR-542-3p, and (C)GTPBP4 mRNA expression in HCC tissues. qRT-PCR analysis of (D) FGD5-AS1, (E)miR-542-3p, and (F)GTPBP4 mRNA expression in HCC cell lines (Huh7, SMMC-7721, PLC5, and Bel-7402).圖1 FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)變化Fig.1 Expression of FGD5-AS1, miR-542-3p, and GTPBP4 in HCC tissues and cell lines

    2.3 下調(diào)FGD5-AS1可提高HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

    與sh-NC組相比,sh-FGD5-AS1組Huh7和PLC5細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)顯著降低(圖3A、3B).轉(zhuǎn)染后,給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、2、4、6和8 Gy的劑量照射.克隆形成試驗(yàn)結(jié)果表明,射線照射后,F(xiàn)GD5-AS1下調(diào)可顯著降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力(圖3C、3D).在沒(méi)有或存在放射線照射(6 Gy)的情況下,F(xiàn)GD5-AS1的下調(diào)可以促進(jìn)Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡(圖3E、3F).由此可見(jiàn),F(xiàn)GD5-AS1下調(diào)可增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性.

    1)與sh-NC組比較,P<0.01.1)Compared with sh-NC,P<0.01.A-D:GTPBP4的mRNA和蛋白水平.E、F: Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力.G、H:sh-GTPBP4轉(zhuǎn)染后的Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡情況.A-D:the mRNA and protein levels of GTPBP4. E、F:The effect of GTPBP4 on the sensitivity of HCC cell lines. G、H: The effect of GTPBP4 on the sensitivity of HCC cell lines.圖2 下調(diào)GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.2 The effect of down-regulation of GTPBP4 on the radiosensitivity of HCC cells

    1)與sh-NC組比較,P<0.011)Compared with sh-NC,P<0.01.A、B:用sh-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染Huh7和PLC5細(xì)胞后FGD5-AS1的表達(dá)水平;C、D:Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力;E、F:Huh7和PLC5細(xì)胞sh-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染后的凋亡情況A、B: Huh7 and PLC5 cells were transfected with sh- FGD5-AS1, and the expression of FGD5-AS1;C、D: The survival fractions of Huh7 and PLC5 cells;E、F:The apoptosis of Huh7 and PLC5 cells which were transfected with sh-FGD5-AS1圖3 下調(diào)FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.3 The effect of FGD5-AS1 down-regulation on the radiosensitivity of HCC cells

    2.4 miR-542-3p靶向GTPBP4并抑制HCC GTPBP4的表達(dá)

    使用Starbase v 2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析預(yù)測(cè)GTPBP4的3′UTR包含一個(gè)miR-542-3p結(jié)合位點(diǎn)(圖4A).為了證實(shí)GTPBP4是否是miR-542-3p的靶基因,將GTPBP4-WT-3′UTR質(zhì)粒、GTPBP4-MUT-3″UTR質(zhì)粒與miR-542-3p、miR-NC共轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中.轉(zhuǎn)染48 h后,miR-542-3p可顯著降低pmiR-GTPBP4-WT載體的熒光活性.然而,含有pmiR-GTPBP4-MUT載體的熒光活性不受miR-542-3p的影響(圖4B).此外,與miR-NC組相比,miR-542-3p上調(diào)可顯著降低GTPBP4的mRNA和蛋白水平,而轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p則可顯著上調(diào)GTPBP4的mRNA和蛋白水平(圖4C、4D).這些結(jié)果表明miR-542-3p靶向GTPBP4,并抑制GTPBP4在HCC細(xì)胞中的表達(dá).

    A:在GTPBP4 3′-UTR內(nèi)存在miR-542-3p的位點(diǎn).B:測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性,1)與pmiR-GTPBP4-MUT質(zhì)粒相比,P<0.01. C、D:qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白水平,2)與anta-miR-542-3p、anta-NC相比,P<0.01.A: The predicted miR-542-3p binding site within the GTPBP4 3′-UTR is shown. B: the luciferase activity was determined. Compared with pmiR-GTPBP4-MUT,P<0.01. C、D: the mRNA and protein levels of GTPBP4 were evaluated by qRT-PCR and Western blot. 2)Compared with anta- miR-542-3p and anta-NC,P<0.01.圖4 miR-542-3p直接靶向GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞中GTPBP4表達(dá)的影響Fig.4 The effect of miR-542-3p directly targeting GTPBP4 on the expression of GTPBP4 in HCC cells

    2.5 FGD5-AS1作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性促進(jìn)GTPBP4在HCC中的表達(dá)

    使用Starbase v2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)FGD5-AS1基因序列上存在miR-542-3p的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A).轉(zhuǎn)染FGD5-AS1的Huh7細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA的Huh7細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)水平(圖5B).將pmiR-FGD5-AS1-WT、pmiR-FGD5-AS1-MUT與miR-542-3p、miR-NC、anta-miR-542-3p、anta-NC共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞.Huh7細(xì)胞的FGD5-AS1-WT的熒光素酶活性在轉(zhuǎn)染miR-542-3p后減弱,而在轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p后增強(qiáng),但miR-542-3p、miR-NC、anta-miR-542-3p、anta-NC對(duì)pmiR-FGD5-AS1-MUT熒光素酶活性無(wú)明顯影響(圖5C).使用pcDNA-FGD5-AS1-WT、pcDNA-FGD5-AS1-MUT、pcDNA、si-FGD5-AS1或si-NC轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)變化.結(jié)果表明野生型FGD5-AS1的過(guò)表達(dá)可顯著降低miR-542-3p的表達(dá)水平,而野生型FGD5-AS1的表達(dá)沉默可顯著升高miR-542-3p的表達(dá)水平(圖5D).野生型FGD5-AS1上調(diào)可促進(jìn)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高,而沉默野生型FGD5-AS1則可以導(dǎo)致GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低.突變型FGD5-AS1的上調(diào)對(duì)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平?jīng)]有影響(圖5E、5F).由此可見(jiàn),F(xiàn)GD5-AS1可作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性上調(diào)Huh7細(xì)胞中GTPBP4的表達(dá).

    A:在FGD5-AS1的3′-UTR內(nèi)存在miR-542-3p的位點(diǎn).B:qRT-PCR檢測(cè)FGD5-AS1表達(dá)水平,1)與FGD5-AS1-MUT相比較,P<0.01.C:FGD5-AS1-WT熒光素酶活性,2)與FGD5-AS1-WT和anta-miR-542-3p共轉(zhuǎn)染相比較,P<0.01.D:qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)水平,3)與pcDNA相比較,P<0.01;qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)水平,4)與si-NC組相比較,P<0.01.E、F:qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平,5)與pcDNA相比較,P<0.01;qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平,6)與si-NC組相比較,P<0.01.A:The predicted binding sites of FGD5-AS1 and miR-542-3p is shown.B:the FGD5-AS1 expression level was confirmed by qRT-PCR 1) Compared with pcDNA- FGD5-AS1-MUT,P<0.01.C: the luciferase activity of FGD5-AS1-WT was measured 2)Compared with the cells were co-transfected with FGD5-AS1-WT and anta- miR-542-3p,P<0.01 D: the expression of miR-542-3p was examined by qRT-PCR 3) Compared with pcDNA,P<0.01. the expression of miR-542-3p was examined by qRT-PCR 4)Compared with si-NC,P<0.01. E、F: the mRNA and protein expression levels of GTPBP4 were determined by qRT-PCR and Western blot 5)Compared with pcDNA,P<0.01. the mRNA and protein expression levels of GTPBP4 were determined by qRT-PCR and Western blot 6)Compared with si-NC,P<0.01.圖5 FGD5-AS1作為miR-542-3p的“分子海綿”對(duì)GTPBP4在HCC細(xì)胞中表達(dá)的影響Fig.5 The effect of FGD5-AS1 as a “molecular sponge” of miR-542-3p on the expression of GTPBP4 in HCC cells

    2.6 FGD5-AS1依賴于miR-542-3p影響HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

    為了進(jìn)一步探討FGD5-AS1在影響HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用機(jī)制,在HuH7和PLC5細(xì)胞中進(jìn)行了恢復(fù)實(shí)驗(yàn).將si-FGD5-AS1、si-NC和anta-miR-542-3p、anta-NC共轉(zhuǎn)染HuH7和PLC5細(xì)胞后進(jìn)行放射線照射.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)miR-542-3p可以減輕si-FGD5-AS1對(duì)HuH7和PCL5細(xì)胞的克隆形成能力的抑制作用(圖6A、6B).此外,共轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1和anta-miR-542-3p的HuH7和PCL5細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比明顯低于共轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1和anta-NC的HuH7和PCL5細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比(圖6C、6D).由此可見(jiàn),F(xiàn)GD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響依賴于miR-542-3p.

    與si-FGD5-AS1和anta-NC共轉(zhuǎn)染組比較,1)P<0.05,2)P<0.01Compared with the cells were co-transfected with si-FGD5-AS1 and anta-NC,1)P<0.05,2)P<0.01A、B:Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力,C、D: Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡情況.A、 B: Clonogenic survivals of Huh7 and PLC5 cells were assessed after radiation, C、D: The apoptosis of Huh7 and PLC5 cells was analyzed by flow cytometry圖6 FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響依賴于miR-542-3pFig.6 The role of FGD5-AS1 in the radiosensitivity is dependent on miR-542-3p

    3 討論

    lncRNA FGD5-AS1位于染色體11q13.1上,可以作為miRNA的“分子海綿”調(diào)控基因的表達(dá).研究表明,F(xiàn)GD5-AS1參與多種癌癥的發(fā)展,例如乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌[8,15-16].有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)GD5-AS1在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織[17].沉默F(xiàn)GD5-AS1可以上調(diào)miR-106b-3p的表達(dá),抑制ATAD2的表達(dá),進(jìn)而抑制K1和TPC1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)K1和TPC1細(xì)胞凋亡[18].近年來(lái),多項(xiàng)研究證明,F(xiàn)GD5-AS1在腫瘤細(xì)胞輻射抗性的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用.沉默F(xiàn)GD5-AS1可以通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá),上調(diào)caspase-3的表達(dá),降低鼻咽癌細(xì)胞的克隆形成能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性.此外,沉默F(xiàn)GD5-AS1可以通過(guò)調(diào)控miR-204/ZEB1的表達(dá),逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型,增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性[19].然而,F(xiàn)GD5-AS1在HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用尚不清楚.在本研究中,F(xiàn)GD5-AS1在HCC組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào).此外,下調(diào)FGD5-AS1可以降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.

    近年來(lái),多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p在人類癌癥的發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用[20-21].miR-542-3p在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的腫瘤分級(jí)和預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)[22].過(guò)表達(dá)miR-542-3p可以通過(guò)靶向MALAT-1抑制PI3K/Akt信號(hào)通路,進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23].此外,在腺樣囊性癌中,過(guò)表達(dá)miR-542-3p可以抑制Pim-1的表達(dá),進(jìn)而抑制SACC-83和SACC-LM細(xì)胞的增殖和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[24].在本研究中,miR-542-3p在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào).FGD5-AS1的過(guò)表達(dá)可顯著降低miR-542-3p的表達(dá)水平,而FGD5-AS1表達(dá)沉默則可顯著升高miR-542-3p的表達(dá)水平.下調(diào)miR-542-3p又可以減弱FGD5-AS1沉默對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性的增強(qiáng)作用,此提示FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響作用依賴于miR-542-3p.

    GTPBP4是一種屬于Ser/Thr蛋白激酶家族的酪氨酸激酶,是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子,可通過(guò)抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞大小[25].學(xué)者認(rèn)為GTPBP4是一個(gè)潛在的惡性腫瘤治療靶點(diǎn)[26].GTPBP4抑制劑AZD1775可以減輕由輻射誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞G2的阻滯,并增強(qiáng)Hep3B、Huh7和HepG2細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性[25].此外,AZD1775治療可以抑制同源重組修復(fù)活性,上調(diào)γ-H2AX的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)奧拉帕利介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對(duì)輻射的增敏作用[27].在本研究中,GTPBP4在HCC組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),沉默GTPBP4可以降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GTPBP4是miR-542-3p的靶基因,上調(diào)miR-542-3p可明顯降低GTPBP4的mRNA和蛋白水平,而轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p可明顯升高GTPBP4的mRNA和蛋白水平,miR-542-3p可靶向抑制GTPBP4的表達(dá).

    FGD5-AS1上調(diào)可以促進(jìn)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高,而沉默F(xiàn)GD5-AS1則可以導(dǎo)致GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低.FGD5-AS1可作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性上調(diào)GTPBP4的表達(dá)進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的放射敏感性的結(jié)論.

    本研究證實(shí)FGD5-AS1和GTPBP4在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),而miR-542-3p在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào).功能分析發(fā)現(xiàn)FGD5-AS1沉默可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-542-3p/GTPBP4軸增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.本研究表明靶向FGD5-AS1可能成為肝癌放射治療的新靶點(diǎn).

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