• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    長(zhǎng)鏈非編碼RNA FGD5-AS1通過(guò)miR-542-3p/GTPBP4對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響

    2021-04-07 00:32:10陳新章諾貝
    關(guān)鍵詞:共轉(zhuǎn)染熒光素酶克隆

    陳新, 章諾貝

    (1. 南昌大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科,江西 南昌 330000; 2. 南昌大學(xué) 第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科,江西 南昌 330000)

    原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC),是世界上第6大最常見(jiàn)的惡性腫瘤,其死亡率居全球癌癥死亡率第3位[1-2].目前,放療是治療HCC常用的方法之一.然而,放射抗性的發(fā)生和發(fā)展已經(jīng)成為治療肝癌的主要臨床障礙[3].因此,提高肝癌細(xì)胞的對(duì)放射的敏感性是提升放療效果的有效途徑.

    多項(xiàng)研究表明,長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在調(diào)控腫瘤細(xì)胞的對(duì)放射的敏感性中起著至關(guān)重要的作用[4-5].lncRNA SNHG1在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織,沉默SNHG18可以通過(guò)抑制信號(hào)素5A,提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性[6].lncRNA OIP5-AS1在耐輻射的結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),沉默OIP5-AS1通過(guò)調(diào)控miR-369-3p/DYRK1A的表達(dá)以增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo細(xì)胞活性,抑制放射誘導(dǎo)的LoVo細(xì)胞凋亡[7].研究發(fā)現(xiàn),lncRNA FGD5-ASl可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[8],但其在腫瘤放射敏感性中的作用至今仍不清楚.

    miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA,可在轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá),從而參與多種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控[9].研究發(fā)現(xiàn),miRNA在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的放射敏感性中起關(guān)鍵作用[10].沉默miR-21可以通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路,增強(qiáng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射敏感性[11].沉默miR-214可以通過(guò)上調(diào)p38MAPK的表達(dá),以增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性[12].過(guò)表達(dá)miR-133a可通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)從而增強(qiáng)食管癌細(xì)胞的放射敏感性[13].研究發(fā)現(xiàn),miR-542-3p可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖與侵襲,但在腫瘤放射敏感性中的作用至今仍不清楚[14].本研究探究了lncRNA FGD5-AS1、miR-542-3p及其下游靶基因在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)以及在調(diào)控HCC放射敏感性中的作用機(jī)制.

    1 材料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    本研究經(jīng)南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò),并獲得所有患者的知情同意書(shū).21對(duì)HCC組織和癌旁組織取自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院的肝癌手術(shù)患者.所有患者經(jīng)組織病理學(xué)確診為肝癌,且術(shù)前未接受任何輔助治療.樣品儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱中.

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及輻射

    人肝細(xì)胞(LO2)和肝癌細(xì)胞系(Huh7、SMMC-7721、PLC5和Bel-7402)來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù).LO2、SMMC-7721和Bel-7402細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Solarbio公司)中培養(yǎng).Huh7和PLC5細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Solarbio公司)中培養(yǎng).將細(xì)胞置于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2、37 ℃條件下培養(yǎng).用X射線發(fā)生器(劑量率2 Gy/min)對(duì)細(xì)胞照射,Huh7和PLC5細(xì)胞給予0、2、4、6或8 Gy輻射劑量照射.

    1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    上海吉瑪公司構(gòu)建質(zhì)粒sh-GTPBP4、si-FGD5-AS1、miR-542-3p、anta-miR-542-3p及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒.使用PCR擴(kuò)增FGD5-AS1的全長(zhǎng)序列并克隆到pcDNA-3.1載體中,構(gòu)建pcDNA-FGD5-AS1質(zhì)粒用于過(guò)表達(dá)FGD5-AS1.采用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)將sh-GTPBP4、si-FGD5-AS1、miR-542-3p、anta-miR-542-3p、sh-NC、si-NC、miR-NC、anta-NC、pcDNA-FGD5-AS1和pcDNA質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至Huh7和PLC5細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn).本研究中所用的shRNA GTPBP4,siRNA FGD5-AS1和anta-miR-542-3p的序列見(jiàn)表1.

    表1 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

    1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)

    根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū),使用TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)從組織和細(xì)胞中分離總RNA.使用PrimeScriptTMRT試劑盒(美國(guó)Takara公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.在序列檢測(cè)系統(tǒng)(ABI Prism 7700;美國(guó)ABI公司)上使用PrimeScriptTMRT reagent kit(日本Takara公司)檢測(cè)基因的表達(dá)水平.通過(guò)TaqMan miRNA assay試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)分析miR-542-3p在組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平.使用β-actin作為FGD5-AS1和GTPBP4的內(nèi)參基因,U6作為miR-542-3p的內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法檢測(cè)FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4的相對(duì)表達(dá)水平.本研究所用的引物序列見(jiàn)表2.

    表2 RT-PCR引物序列Table 2 Primer sequence of RT-PCR

    1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

    使用含有蛋白抑制劑的RIPA buffer(美國(guó)Solarbio公司)提取Huh7和PLC5細(xì)胞的總蛋白.使用Enhanced BCA Protein Assay Kit(上海Beyotime公司)檢測(cè)蛋白表達(dá).取30 μg蛋白樣品以質(zhì)量分?jǐn)?shù)14% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上.使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉后,將聚偏氟乙烯膜浸泡在一抗GTPBP4 (V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000,英國(guó)Abcam公司)和抗β-actin(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶1 000,美國(guó)Boster公司)稀釋液二抗稀釋液(V抗體∶V抗體稀釋液=1∶2 000,美國(guó)Boster公司)中,室溫孵育1 h;洗膜液洗膜后使用BeyoECL Plus(上海Beyotime公司)試劑盒顯色,以β-actin作為內(nèi)參基因,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,ImageJ(美國(guó)NIH Image公司)軟件分析蛋白條帶灰度值.

    1.6 克隆形成試驗(yàn)

    轉(zhuǎn)染后,分別給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、2、4、6和8 Gy的輻射照射.細(xì)胞培養(yǎng)5 d后,用甲醇固定15 min,并在室溫條件下使用結(jié)晶紫(美國(guó)Solarbio公司)染色20 min,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆數(shù)(>50個(gè)細(xì)胞/克隆),放射細(xì)胞存活曲線計(jì)算如下:存活分?jǐn)?shù)=處理組集落形成率/對(duì)照組集落形成率.

    1.7 流式細(xì)胞儀分析

    Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Sigma-Aldrich公司)分析Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡.轉(zhuǎn)染后,給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、6 Gy劑量照射,細(xì)胞離心后懸浮于1 × Annexin V Binding buffer(500 μL).Annexin V-FITC(5 μL)在黑暗條件下處理細(xì)胞5 min.流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的凋亡情況.

    1.8 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)

    擴(kuò)增野生型和突變型的GTPBP4 3′UTR區(qū)的堿基序列(包含miR-542-3p位點(diǎn)),并將其分別克隆到熒光素酶報(bào)告載體(pmiR-RB-Report)中構(gòu)建pmiR-GTPBP4-WT和pmiR-GTPBP4-MUT載體.同樣將野生型和突變型的FGD5-AS1 3′UTR區(qū)的堿基序列克隆到熒光素酶報(bào)告載體(pmiR-RB-Report)中構(gòu)建pmiR-FGD5-AS1-WT和pmiR-FGD5-AS1-MUT載體.將熒光素酶報(bào)告載體和miR-542-3p、anta-miR-542-3p、miR-NC和anta-NC共轉(zhuǎn)染人Huh7細(xì)胞.轉(zhuǎn)染48 h后,用熒光素酶測(cè)定試劑盒(美國(guó)Pharmingen公司)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的相對(duì)活性.

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用student’sttest分析兩組組間的差異.多組組間差異采用單因素方差分析以及Tukey’s post hoc進(jìn)行檢驗(yàn).以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    2.1 FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)

    FGD5-AS1和GTPBP4的mRNA表達(dá)水平在肝癌組織中升高(P<0.01,圖1A、1C).相反,miR-542-3p在HCC組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(P<0.01,圖1B).此外,與人肝細(xì)胞(LO2)相比,F(xiàn)GD5-AS1和GTPBP4的mRNA表達(dá)水平在HCC細(xì)胞系顯著升高,miR-542-3p表達(dá)水平顯著降低(圖1D-1F).由此可見(jiàn),在HCC組織和細(xì)胞中,F(xiàn)GD5-AS1和GTPBP4表達(dá)上調(diào),miR-542-3p表達(dá)下調(diào).

    2.2 下調(diào)GTPBP4可增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

    為探討GTPBP4在HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用,通過(guò)向HCC細(xì)胞(Huh7和PLC5)中轉(zhuǎn)染sh-GTPBP4、sh-NC降低HCC細(xì)胞中GTPBP4的表達(dá)水平.qRT-PCR和Western blot檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),與sh-NC組相比,sh-GTPBP4組中GTPBP4的mRNA和蛋白水平明顯降低(圖2A-2D).采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析了沉默GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞系放射敏感性的影響.用sh-GTPBP4或sh-NC轉(zhuǎn)染Huh7和PLC5細(xì)胞,分別給予0、2、4、6和8Gy的劑量照射.結(jié)果表明,沉默GTPBP4對(duì)Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力具有放射劑量依賴性的抑制作用(圖2E、2F).在沒(méi)有或存在放射線照射(6Gy)的情況下,敲除GTPBP4促進(jìn)了Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡(圖2G、2H).這些結(jié)果表明GTPBP4的下調(diào)可以增強(qiáng)HCC細(xì)胞的放射敏感性.

    1)與癌旁組織比較,P<0.01;2)與人肝細(xì)胞比較,P<0.05;3)與人肝細(xì)胞比較,P<0.01.1)Compared with normal tissues,P<0.01;2)Compared with human hepatocyte cells,P<0.05;3)Compared with human hepatocyte cells,P<0.01qRT-PCR分析HCC組織中(A)FGD5-AS1、(B)miR-542-3p和(C)GTPBP4的表達(dá)水平.qRT-PCR分析HCC細(xì)胞(Huh7、SMMC-7721、PLC5和Bel-7402)中(D)FGD5-AS1、(E)miR-542-3p和(F)GTPBP4的表達(dá)水平qRT-PCR analysis of (A)FGD5-AS1, (B)miR-542-3p, and (C)GTPBP4 mRNA expression in HCC tissues. qRT-PCR analysis of (D) FGD5-AS1, (E)miR-542-3p, and (F)GTPBP4 mRNA expression in HCC cell lines (Huh7, SMMC-7721, PLC5, and Bel-7402).圖1 FGD5-AS1、miR-542-3p和GTPBP4在HCC組織和細(xì)胞中的表達(dá)變化Fig.1 Expression of FGD5-AS1, miR-542-3p, and GTPBP4 in HCC tissues and cell lines

    2.3 下調(diào)FGD5-AS1可提高HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

    與sh-NC組相比,sh-FGD5-AS1組Huh7和PLC5細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)顯著降低(圖3A、3B).轉(zhuǎn)染后,給予Huh7和PLC5細(xì)胞0、2、4、6和8 Gy的劑量照射.克隆形成試驗(yàn)結(jié)果表明,射線照射后,F(xiàn)GD5-AS1下調(diào)可顯著降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力(圖3C、3D).在沒(méi)有或存在放射線照射(6 Gy)的情況下,F(xiàn)GD5-AS1的下調(diào)可以促進(jìn)Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡(圖3E、3F).由此可見(jiàn),F(xiàn)GD5-AS1下調(diào)可增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性.

    1)與sh-NC組比較,P<0.01.1)Compared with sh-NC,P<0.01.A-D:GTPBP4的mRNA和蛋白水平.E、F: Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力.G、H:sh-GTPBP4轉(zhuǎn)染后的Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡情況.A-D:the mRNA and protein levels of GTPBP4. E、F:The effect of GTPBP4 on the sensitivity of HCC cell lines. G、H: The effect of GTPBP4 on the sensitivity of HCC cell lines.圖2 下調(diào)GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.2 The effect of down-regulation of GTPBP4 on the radiosensitivity of HCC cells

    1)與sh-NC組比較,P<0.011)Compared with sh-NC,P<0.01.A、B:用sh-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染Huh7和PLC5細(xì)胞后FGD5-AS1的表達(dá)水平;C、D:Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力;E、F:Huh7和PLC5細(xì)胞sh-FGD5-AS1轉(zhuǎn)染后的凋亡情況A、B: Huh7 and PLC5 cells were transfected with sh- FGD5-AS1, and the expression of FGD5-AS1;C、D: The survival fractions of Huh7 and PLC5 cells;E、F:The apoptosis of Huh7 and PLC5 cells which were transfected with sh-FGD5-AS1圖3 下調(diào)FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響Fig.3 The effect of FGD5-AS1 down-regulation on the radiosensitivity of HCC cells

    2.4 miR-542-3p靶向GTPBP4并抑制HCC GTPBP4的表達(dá)

    使用Starbase v 2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)分析預(yù)測(cè)GTPBP4的3′UTR包含一個(gè)miR-542-3p結(jié)合位點(diǎn)(圖4A).為了證實(shí)GTPBP4是否是miR-542-3p的靶基因,將GTPBP4-WT-3′UTR質(zhì)粒、GTPBP4-MUT-3″UTR質(zhì)粒與miR-542-3p、miR-NC共轉(zhuǎn)染到Huh7細(xì)胞中.轉(zhuǎn)染48 h后,miR-542-3p可顯著降低pmiR-GTPBP4-WT載體的熒光活性.然而,含有pmiR-GTPBP4-MUT載體的熒光活性不受miR-542-3p的影響(圖4B).此外,與miR-NC組相比,miR-542-3p上調(diào)可顯著降低GTPBP4的mRNA和蛋白水平,而轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p則可顯著上調(diào)GTPBP4的mRNA和蛋白水平(圖4C、4D).這些結(jié)果表明miR-542-3p靶向GTPBP4,并抑制GTPBP4在HCC細(xì)胞中的表達(dá).

    A:在GTPBP4 3′-UTR內(nèi)存在miR-542-3p的位點(diǎn).B:測(cè)定細(xì)胞的熒光素酶活性,1)與pmiR-GTPBP4-MUT質(zhì)粒相比,P<0.01. C、D:qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白水平,2)與anta-miR-542-3p、anta-NC相比,P<0.01.A: The predicted miR-542-3p binding site within the GTPBP4 3′-UTR is shown. B: the luciferase activity was determined. Compared with pmiR-GTPBP4-MUT,P<0.01. C、D: the mRNA and protein levels of GTPBP4 were evaluated by qRT-PCR and Western blot. 2)Compared with anta- miR-542-3p and anta-NC,P<0.01.圖4 miR-542-3p直接靶向GTPBP4對(duì)HCC細(xì)胞中GTPBP4表達(dá)的影響Fig.4 The effect of miR-542-3p directly targeting GTPBP4 on the expression of GTPBP4 in HCC cells

    2.5 FGD5-AS1作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性促進(jìn)GTPBP4在HCC中的表達(dá)

    使用Starbase v2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)FGD5-AS1基因序列上存在miR-542-3p的結(jié)合位點(diǎn)(圖5A).轉(zhuǎn)染FGD5-AS1的Huh7細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA的Huh7細(xì)胞中FGD5-AS1的表達(dá)水平(圖5B).將pmiR-FGD5-AS1-WT、pmiR-FGD5-AS1-MUT與miR-542-3p、miR-NC、anta-miR-542-3p、anta-NC共轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞.Huh7細(xì)胞的FGD5-AS1-WT的熒光素酶活性在轉(zhuǎn)染miR-542-3p后減弱,而在轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p后增強(qiáng),但miR-542-3p、miR-NC、anta-miR-542-3p、anta-NC對(duì)pmiR-FGD5-AS1-MUT熒光素酶活性無(wú)明顯影響(圖5C).使用pcDNA-FGD5-AS1-WT、pcDNA-FGD5-AS1-MUT、pcDNA、si-FGD5-AS1或si-NC轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞,通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)變化.結(jié)果表明野生型FGD5-AS1的過(guò)表達(dá)可顯著降低miR-542-3p的表達(dá)水平,而野生型FGD5-AS1的表達(dá)沉默可顯著升高miR-542-3p的表達(dá)水平(圖5D).野生型FGD5-AS1上調(diào)可促進(jìn)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高,而沉默野生型FGD5-AS1則可以導(dǎo)致GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低.突變型FGD5-AS1的上調(diào)對(duì)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平?jīng)]有影響(圖5E、5F).由此可見(jiàn),F(xiàn)GD5-AS1可作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性上調(diào)Huh7細(xì)胞中GTPBP4的表達(dá).

    A:在FGD5-AS1的3′-UTR內(nèi)存在miR-542-3p的位點(diǎn).B:qRT-PCR檢測(cè)FGD5-AS1表達(dá)水平,1)與FGD5-AS1-MUT相比較,P<0.01.C:FGD5-AS1-WT熒光素酶活性,2)與FGD5-AS1-WT和anta-miR-542-3p共轉(zhuǎn)染相比較,P<0.01.D:qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)水平,3)與pcDNA相比較,P<0.01;qRT-PCR檢測(cè)miR-542-3p的表達(dá)水平,4)與si-NC組相比較,P<0.01.E、F:qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平,5)與pcDNA相比較,P<0.01;qRT-PCR和Western blot檢測(cè)GTPBP4的mRNA和蛋白表達(dá)水平,6)與si-NC組相比較,P<0.01.A:The predicted binding sites of FGD5-AS1 and miR-542-3p is shown.B:the FGD5-AS1 expression level was confirmed by qRT-PCR 1) Compared with pcDNA- FGD5-AS1-MUT,P<0.01.C: the luciferase activity of FGD5-AS1-WT was measured 2)Compared with the cells were co-transfected with FGD5-AS1-WT and anta- miR-542-3p,P<0.01 D: the expression of miR-542-3p was examined by qRT-PCR 3) Compared with pcDNA,P<0.01. the expression of miR-542-3p was examined by qRT-PCR 4)Compared with si-NC,P<0.01. E、F: the mRNA and protein expression levels of GTPBP4 were determined by qRT-PCR and Western blot 5)Compared with pcDNA,P<0.01. the mRNA and protein expression levels of GTPBP4 were determined by qRT-PCR and Western blot 6)Compared with si-NC,P<0.01.圖5 FGD5-AS1作為miR-542-3p的“分子海綿”對(duì)GTPBP4在HCC細(xì)胞中表達(dá)的影響Fig.5 The effect of FGD5-AS1 as a “molecular sponge” of miR-542-3p on the expression of GTPBP4 in HCC cells

    2.6 FGD5-AS1依賴于miR-542-3p影響HCC細(xì)胞對(duì)放射的敏感性

    為了進(jìn)一步探討FGD5-AS1在影響HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用機(jī)制,在HuH7和PLC5細(xì)胞中進(jìn)行了恢復(fù)實(shí)驗(yàn).將si-FGD5-AS1、si-NC和anta-miR-542-3p、anta-NC共轉(zhuǎn)染HuH7和PLC5細(xì)胞后進(jìn)行放射線照射.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,下調(diào)miR-542-3p可以減輕si-FGD5-AS1對(duì)HuH7和PCL5細(xì)胞的克隆形成能力的抑制作用(圖6A、6B).此外,共轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1和anta-miR-542-3p的HuH7和PCL5細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比明顯低于共轉(zhuǎn)染si-FGD5-AS1和anta-NC的HuH7和PCL5細(xì)胞的凋亡細(xì)胞百分比(圖6C、6D).由此可見(jiàn),F(xiàn)GD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響依賴于miR-542-3p.

    與si-FGD5-AS1和anta-NC共轉(zhuǎn)染組比較,1)P<0.05,2)P<0.01Compared with the cells were co-transfected with si-FGD5-AS1 and anta-NC,1)P<0.05,2)P<0.01A、B:Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力,C、D: Huh7和PLC5細(xì)胞的凋亡情況.A、 B: Clonogenic survivals of Huh7 and PLC5 cells were assessed after radiation, C、D: The apoptosis of Huh7 and PLC5 cells was analyzed by flow cytometry圖6 FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響依賴于miR-542-3pFig.6 The role of FGD5-AS1 in the radiosensitivity is dependent on miR-542-3p

    3 討論

    lncRNA FGD5-AS1位于染色體11q13.1上,可以作為miRNA的“分子海綿”調(diào)控基因的表達(dá).研究表明,F(xiàn)GD5-AS1參與多種癌癥的發(fā)展,例如乳腺癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌和胃癌[8,15-16].有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)GD5-AS1在乳頭狀甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織[17].沉默F(xiàn)GD5-AS1可以上調(diào)miR-106b-3p的表達(dá),抑制ATAD2的表達(dá),進(jìn)而抑制K1和TPC1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)K1和TPC1細(xì)胞凋亡[18].近年來(lái),多項(xiàng)研究證明,F(xiàn)GD5-AS1在腫瘤細(xì)胞輻射抗性的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用.沉默F(xiàn)GD5-AS1可以通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá),上調(diào)caspase-3的表達(dá),降低鼻咽癌細(xì)胞的克隆形成能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性.此外,沉默F(xiàn)GD5-AS1可以通過(guò)調(diào)控miR-204/ZEB1的表達(dá),逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化表型,增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性[19].然而,F(xiàn)GD5-AS1在HCC細(xì)胞放射敏感性中的作用尚不清楚.在本研究中,F(xiàn)GD5-AS1在HCC組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào).此外,下調(diào)FGD5-AS1可以降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.

    近年來(lái),多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-542-3p在人類癌癥的發(fā)展中起著重要的調(diào)節(jié)作用[20-21].miR-542-3p在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤患者的腫瘤分級(jí)和預(yù)后不良呈負(fù)相關(guān)[22].過(guò)表達(dá)miR-542-3p可以通過(guò)靶向MALAT-1抑制PI3K/Akt信號(hào)通路,進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[23].此外,在腺樣囊性癌中,過(guò)表達(dá)miR-542-3p可以抑制Pim-1的表達(dá),進(jìn)而抑制SACC-83和SACC-LM細(xì)胞的增殖和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[24].在本研究中,miR-542-3p在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào).FGD5-AS1的過(guò)表達(dá)可顯著降低miR-542-3p的表達(dá)水平,而FGD5-AS1表達(dá)沉默則可顯著升高miR-542-3p的表達(dá)水平.下調(diào)miR-542-3p又可以減弱FGD5-AS1沉默對(duì)肝癌細(xì)胞放射敏感性的增強(qiáng)作用,此提示FGD5-AS1對(duì)HCC細(xì)胞放射敏感性的影響作用依賴于miR-542-3p.

    GTPBP4是一種屬于Ser/Thr蛋白激酶家族的酪氨酸激酶,是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)因子,可通過(guò)抑制細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞大小[25].學(xué)者認(rèn)為GTPBP4是一個(gè)潛在的惡性腫瘤治療靶點(diǎn)[26].GTPBP4抑制劑AZD1775可以減輕由輻射誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞G2的阻滯,并增強(qiáng)Hep3B、Huh7和HepG2細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性[25].此外,AZD1775治療可以抑制同源重組修復(fù)活性,上調(diào)γ-H2AX的表達(dá),進(jìn)而增強(qiáng)奧拉帕利介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞對(duì)輻射的增敏作用[27].在本研究中,GTPBP4在HCC組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),沉默GTPBP4可以降低Huh7和PLC5細(xì)胞的克隆形成能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GTPBP4是miR-542-3p的靶基因,上調(diào)miR-542-3p可明顯降低GTPBP4的mRNA和蛋白水平,而轉(zhuǎn)染anta-miR-542-3p可明顯升高GTPBP4的mRNA和蛋白水平,miR-542-3p可靶向抑制GTPBP4的表達(dá).

    FGD5-AS1上調(diào)可以促進(jìn)GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平升高,而沉默F(xiàn)GD5-AS1則可以導(dǎo)致GTPBP4 mRNA和蛋白質(zhì)水平降低.FGD5-AS1可作為miR-542-3p的“分子海綿”競(jìng)爭(zhēng)性上調(diào)GTPBP4的表達(dá)進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的放射敏感性的結(jié)論.

    本研究證實(shí)FGD5-AS1和GTPBP4在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),而miR-542-3p在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào).功能分析發(fā)現(xiàn)FGD5-AS1沉默可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-542-3p/GTPBP4軸增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的放射敏感性.本研究表明靶向FGD5-AS1可能成為肝癌放射治療的新靶點(diǎn).

    猜你喜歡
    共轉(zhuǎn)染熒光素酶克隆
    克隆狼
    NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
    不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ATB對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制研究
    浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
    EIAV Rev 蛋白拮抗eqTRIM5α介導(dǎo)的AP-1 信號(hào)通路的機(jī)制研究
    重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    綿羊肺腺瘤病毒SU蛋白與Hyal-2蛋白的結(jié)合域研究
    人多巴胺D2基因啟動(dòng)子區(qū)—350A/G多態(tài)位點(diǎn)熒光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定及活性檢測(cè)
    久久免费观看电影| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 男女国产视频网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产1区2区3区精品| 国产免费视频播放在线视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产高清videossex| 精品一区二区三区av网在线观看 | av不卡在线播放| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久久久久久免费视频了| 婷婷丁香在线五月| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产色视频综合| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 少妇人妻久久综合中文| 午夜老司机福利片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| bbb黄色大片| 国产伦人伦偷精品视频| 免费少妇av软件| 久久久国产一区二区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品国产国语对白av| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 在线观看舔阴道视频| 超碰成人久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 女性被躁到高潮视频| 韩国高清视频一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产真人三级小视频在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 人妻一区二区av| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 叶爱在线成人免费视频播放| 中文欧美无线码| 亚洲avbb在线观看| 午夜激情久久久久久久| 亚洲av美国av| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美激情 高清一区二区三区| 热99久久久久精品小说推荐| 免费在线观看完整版高清| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 9热在线视频观看99| 一区二区av电影网| 又大又爽又粗| 午夜福利在线免费观看网站| 久久99一区二区三区| 国产色视频综合| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美大码av| 中文字幕高清在线视频| 成年人午夜在线观看视频| 韩国高清视频一区二区三区| 91成人精品电影| 蜜桃在线观看..| 久久国产精品大桥未久av| 1024视频免费在线观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 午夜激情久久久久久久| 精品高清国产在线一区| 秋霞在线观看毛片| 少妇精品久久久久久久| 视频区欧美日本亚洲| 美女主播在线视频| 伦理电影免费视频| 国产麻豆69| 国产亚洲欧美精品永久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 色老头精品视频在线观看| 少妇人妻久久综合中文| 在线观看免费日韩欧美大片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产精品免费视频内射| av免费在线观看网站| 亚洲专区国产一区二区| 午夜福利影视在线免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 满18在线观看网站| tube8黄色片| 亚洲成人国产一区在线观看| 丝袜喷水一区| 老司机靠b影院| 国产精品1区2区在线观看. | av在线app专区| 亚洲第一青青草原| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲avbb在线观看| 咕卡用的链子| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 成人亚洲精品一区在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 精品少妇久久久久久888优播| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产精品.久久久| 免费不卡黄色视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产成人精品在线电影| 美女扒开内裤让男人捅视频| 水蜜桃什么品种好| 成年人免费黄色播放视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲国产看品久久| 后天国语完整版免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 少妇精品久久久久久久| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲少妇的诱惑av| 中亚洲国语对白在线视频| 高清在线国产一区| 男人舔女人的私密视频| 69av精品久久久久久 | 热99国产精品久久久久久7| 日本欧美视频一区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品人妻1区二区| 国产有黄有色有爽视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 国产三级黄色录像| 成年女人毛片免费观看观看9 | 777米奇影视久久| 亚洲国产精品成人久久小说| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文字幕色久视频| 一区二区三区激情视频| 天天添夜夜摸| 国产高清videossex| 老汉色∧v一级毛片| 美女高潮到喷水免费观看| 久久这里只有精品19| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 69精品国产乱码久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| av在线老鸭窝| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产野战对白在线观看| 18在线观看网站| 精品国内亚洲2022精品成人 | 亚洲国产欧美网| 国产成人系列免费观看| 青草久久国产| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲综合色网址| 高清视频免费观看一区二区| 日韩欧美一区视频在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 亚洲av国产av综合av卡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 老司机午夜福利在线观看视频 | 亚洲成人手机| 精品人妻1区二区| 国产精品九九99| 久久这里只有精品19| 久久精品国产综合久久久| 亚洲 国产 在线| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲精华国产精华精| 性少妇av在线| 热re99久久国产66热| 亚洲专区中文字幕在线| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 大陆偷拍与自拍| 国产福利在线免费观看视频| 精品久久久久久电影网| 国产99久久九九免费精品| 国产日韩欧美视频二区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 51午夜福利影视在线观看| 久久这里只有精品19| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品一二三区在线看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 成人av一区二区三区在线看 | 久久综合国产亚洲精品| 亚洲精品国产区一区二| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日韩一区二区三区影片| 人妻 亚洲 视频| 久久久欧美国产精品| 亚洲人成电影免费在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲黑人精品在线| 亚洲欧美一区二区三区久久| 另类亚洲欧美激情| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美日韩av久久| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 成年女人毛片免费观看观看9 | 人人澡人人妻人| 亚洲伊人色综图| 中亚洲国语对白在线视频| 99国产精品99久久久久| 蜜桃在线观看..| 99热网站在线观看| 欧美性长视频在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 777米奇影视久久| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人精品无人区| e午夜精品久久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 性色av一级| 国产精品国产av在线观看| 电影成人av| 亚洲综合色网址| av不卡在线播放| av在线老鸭窝| av超薄肉色丝袜交足视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 悠悠久久av| 99精品欧美一区二区三区四区| 最新的欧美精品一区二区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲专区国产一区二区| 国产欧美日韩精品亚洲av| 中文欧美无线码| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | videos熟女内射| 日韩视频一区二区在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 国产精品1区2区在线观看. | 成人av一区二区三区在线看 | 热re99久久精品国产66热6| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 欧美激情久久久久久爽电影 | 91成年电影在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 老司机影院毛片| 我的亚洲天堂| 亚洲视频免费观看视频| 国产男女内射视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| e午夜精品久久久久久久| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品 国内视频| 精品久久久精品久久久| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 中文字幕最新亚洲高清| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 亚洲精华国产精华精| 无限看片的www在线观看| 国产一区二区三区综合在线观看| 人人澡人人妻人| 久久亚洲精品不卡| 日韩中文字幕视频在线看片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜视频精品福利| 久9热在线精品视频| 午夜激情av网站| 国产有黄有色有爽视频| 午夜91福利影院| 91精品三级在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲专区中文字幕在线| 最黄视频免费看| 一区二区三区激情视频| 十八禁人妻一区二区| 免费日韩欧美在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国精品久久久久久国模美| 精品一区二区三卡| 香蕉国产在线看| 亚洲中文日韩欧美视频| 精品亚洲成国产av| 色94色欧美一区二区| 精品熟女少妇八av免费久了| 精品一区二区三区av网在线观看 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 三上悠亚av全集在线观看| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久久久久久大尺度免费视频| 丝袜喷水一区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品一区在线观看国产| 午夜视频精品福利| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产高清videossex| 美国免费a级毛片| 国产一级毛片在线| avwww免费| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲人成电影免费在线| 91大片在线观看| 9热在线视频观看99| 亚洲成人免费av在线播放| 成人免费观看视频高清| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品一区在线观看国产| av不卡在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 天天影视国产精品| 9191精品国产免费久久| 他把我摸到了高潮在线观看 | 丝瓜视频免费看黄片| 香蕉丝袜av| 午夜成年电影在线免费观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 视频区欧美日本亚洲| 在线av久久热| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久欧美国产精品| 中文字幕人妻熟女乱码| 一级黄色大片毛片| 精品免费久久久久久久清纯 | 人成视频在线观看免费观看| 亚洲精品av麻豆狂野| 久热这里只有精品99| 极品人妻少妇av视频| 97精品久久久久久久久久精品| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲精品av麻豆狂野| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 中国美女看黄片| 9191精品国产免费久久| 亚洲男人天堂网一区| 国产成人av教育| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美激情高清一区二区三区| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲精华国产精华精| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日韩视频在线欧美| 日本一区二区免费在线视频| a级毛片黄视频| 岛国毛片在线播放| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 飞空精品影院首页| 国产有黄有色有爽视频| 久久国产精品人妻蜜桃| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品自拍成人| 亚洲av片天天在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产麻豆69| 麻豆乱淫一区二区| 天天添夜夜摸| 国产一区二区 视频在线| av在线老鸭窝| 麻豆国产av国片精品| a级毛片黄视频| 五月开心婷婷网| 多毛熟女@视频| www.自偷自拍.com| 亚洲人成电影观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产黄频视频在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 18在线观看网站| 亚洲欧美激情在线| 一区在线观看完整版| 亚洲精品中文字幕在线视频| bbb黄色大片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 青春草视频在线免费观看| av网站在线播放免费| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产成人啪精品午夜网站| 久久狼人影院| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产精品久久久人人做人人爽| www.熟女人妻精品国产| 亚洲国产精品999| 91老司机精品| 国产在线视频一区二区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一个人免费在线观看的高清视频 | 日韩三级视频一区二区三区| 真人做人爱边吃奶动态| 香蕉丝袜av| 老司机深夜福利视频在线观看 | 欧美日韩黄片免| 一区在线观看完整版| 亚洲精品国产av蜜桃| 久久这里只有精品19| 精品亚洲成a人片在线观看| 桃花免费在线播放| 日本91视频免费播放| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产男女内射视频| 免费在线观看完整版高清| 色视频在线一区二区三区| 亚洲国产精品999| 一级毛片女人18水好多| 90打野战视频偷拍视频| 脱女人内裤的视频| 欧美午夜高清在线| 人妻久久中文字幕网| 老熟女久久久| 欧美日韩福利视频一区二区| 另类精品久久| 十八禁人妻一区二区| 在线 av 中文字幕| 国产av精品麻豆| 啦啦啦中文免费视频观看日本| av视频免费观看在线观看| 欧美黄色淫秽网站| www.自偷自拍.com| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久人人爽人人片av| 国产成人精品久久二区二区91| 久久精品国产综合久久久| 成年人免费黄色播放视频| 制服人妻中文乱码| 国产又色又爽无遮挡免| 一级毛片电影观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产成人av教育| 无限看片的www在线观看| 亚洲久久久国产精品| av一本久久久久| 国产av一区二区精品久久| 亚洲avbb在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 国产精品 国内视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | e午夜精品久久久久久久| 18禁观看日本| 久久九九热精品免费| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲欧美精品自产自拍| 99九九在线精品视频| 日本黄色日本黄色录像| 国产精品一区二区在线不卡| 国产淫语在线视频| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品一区蜜桃| 午夜老司机福利片| 91字幕亚洲| 国产国语露脸激情在线看| 欧美日韩亚洲高清精品| 69精品国产乱码久久久| 看免费av毛片| 国产高清视频在线播放一区 | 亚洲精品国产一区二区精华液| av有码第一页| 久久热在线av| 欧美变态另类bdsm刘玥| 成人三级做爰电影| avwww免费| 欧美国产精品一级二级三级| avwww免费| 国产精品欧美亚洲77777| 日本91视频免费播放| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲全国av大片| 男人操女人黄网站| 亚洲欧美激情在线| 最新的欧美精品一区二区| 97精品久久久久久久久久精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产精品1区2区在线观看. | av不卡在线播放| 久久人妻熟女aⅴ| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 亚洲第一av免费看| 各种免费的搞黄视频| 日本91视频免费播放| 亚洲avbb在线观看| www.av在线官网国产| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| √禁漫天堂资源中文www| 国产欧美亚洲国产| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 男人操女人黄网站| 国产又爽黄色视频| 免费在线观看日本一区| 狠狠狠狠99中文字幕| 不卡一级毛片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 18禁国产床啪视频网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久久精品国产a三级三级三级| 午夜成年电影在线免费观看| 岛国毛片在线播放| a 毛片基地| 国产欧美日韩综合在线一区二区| h视频一区二区三区| 免费在线观看日本一区| 永久免费av网站大全| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲中文av在线| 欧美日韩av久久| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 中亚洲国语对白在线视频| 自线自在国产av| 一级毛片电影观看| 老司机影院毛片| 99热全是精品| 在线av久久热| www.999成人在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲七黄色美女视频| 丝袜在线中文字幕| 国产男女内射视频| 国产免费现黄频在线看| 久久国产精品影院| 国产区一区二久久| 国产一卡二卡三卡精品| 一区二区三区乱码不卡18| 一区二区三区精品91| 涩涩av久久男人的天堂| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 日韩欧美免费精品| 啦啦啦啦在线视频资源| 可以免费在线观看a视频的电影网站| www.999成人在线观看| 久久久久网色| 热99re8久久精品国产| 久久久欧美国产精品| 一区二区三区乱码不卡18| 中文欧美无线码| 欧美在线黄色| 91精品国产国语对白视频| 69av精品久久久久久 | 91精品国产国语对白视频| 99热全是精品| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产精品偷伦视频观看了| 婷婷色av中文字幕| 精品国产一区二区久久| 97在线人人人人妻| 亚洲国产av影院在线观看| av在线app专区| 欧美一级毛片孕妇| 啦啦啦免费观看视频1| 午夜激情久久久久久久| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲国产精品一区三区| www.999成人在线观看| 丁香六月欧美| 成在线人永久免费视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| av超薄肉色丝袜交足视频| 另类精品久久| 视频区图区小说| 天天影视国产精品| 91老司机精品| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美激情久久久久久爽电影 | 日韩电影二区| 久久影院123| 女性生殖器流出的白浆| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费看十八禁软件| 久久久久久人人人人人| 少妇的丰满在线观看| 久久久欧美国产精品| 一级毛片精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 久久毛片免费看一区二区三区| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 日韩有码中文字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲熟女精品中文字幕| 日韩电影二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产黄色免费在线视频| 18禁观看日本| 大片电影免费在线观看免费| 日韩,欧美,国产一区二区三区|