骨形態(tài)發(fā)生蛋白7 通過(guò)調(diào)節(jié)GSK?3β 活性對(duì)心肌梗死后大鼠心肌纖維化的影響

余平 梁鵬 龐詩(shī)鋒 袁文健 黃巧娟

持續(xù)過(guò)度的心肌重構(gòu)是心肌梗死發(fā)展成充血性心力衰竭的重要病理機(jī)制，而心肌纖維化是心肌重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。因此，有效抑制心肌纖維化可能是心肌梗死后治療的關(guān)鍵。既往研究表明，BMP7 具有抗炎、抗凋亡、抗纖維化的作用，并在心臟疾病中發(fā)揮重要作用，但其抗心肌纖維化可能涉及的機(jī)制尚不清楚［2，3］。因此本研究通過(guò)制備心肌梗死大鼠模型，旨在探究BMP7 對(duì)心肌梗死后心肌纖維化的影響及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 22 只健康雄性Sprague?Dawley 大鼠（SD rats），體重230-250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑及儀器 人重組骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（BMP7，北京博奧森生物科技有限公司），p?GSK?3β抗體（英國(guó)Abcam 公司），TGF?β1 抗體（英國(guó)Abcam公司），β?Actin 抗體（美國(guó)CST 公司），Masson 染色試劑盒（北京博奧森生物科技有限公司），ALC?V9動(dòng)物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司）

1.3 心梗模型制備 根據(jù)Curaj［4］等的方法構(gòu)建心梗模型。通過(guò)腹腔注射2%戊巴比妥鈉（3 ml/kg）麻醉大鼠，行經(jīng)口氣管插管并連接動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，在左側(cè)胸壁第3-4 肋間處備皮、開(kāi)胸，暴露心臟，于左心耳根部下方2-3 mm 處用6-0 縫合線結(jié)扎左前降支，結(jié)扎后見(jiàn)左室前壁及心尖部變白，心臟搏動(dòng)減弱，心電圖示ST 段抬高，即表示造模成功。術(shù)畢，形成胸腔負(fù)壓，逐層關(guān)閉胸腔后肌肉注射2.5×104U 青霉素預(yù)防感染。假手術(shù)組大鼠進(jìn)行相同手術(shù)操作，僅不結(jié)扎左前降支。

1.4 動(dòng)物分組與處理 將術(shù)后成功存活12 h 的大鼠隨機(jī)分為2 組，分別為MI 組和MI+BMP7 組，每組8 只。另外選擇6 只正常SD 大鼠作為Sham組。術(shù)后第二天，MI+BMP7 組尾靜脈注射35 μg·kg-1［3］，1 次/周，共4 周，其 余 兩 組 尾 靜 脈 注 射 與BMP7 等體積的生理鹽水，1 次/周，共4 周。

1.5 標(biāo)本收集與處理 術(shù)后4 周時(shí)，先麻醉大鼠，再剪開(kāi)胸腔迅速將心臟取出，并放入盛有10%氯化鉀溶液的玻璃皿中，使心臟在舒張期停止。用冷生理鹽水沖洗心腔及心臟表面，直至沖洗液變透明。再將結(jié)扎線以上部分心肌組織和右心室組織去除，剩余心肌組織一部分用4%多聚甲醛固定24 h 備用，另一部分經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法 （1）HE 染色 各組心肌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h 后，石蠟包埋切片，將切片依次放入二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化至蒸餾水，再蘇木素染色，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)，伊紅染色，再梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢觀察心肌形態(tài)學(xué)改變。（2）Masson 染色切片常規(guī)脫蠟水化，遵循Masson 染色試劑盒操作說(shuō)明處理，在光鏡下心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色，并用Image?Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行圖像分析。膠原容積分?jǐn)?shù)（%）=（膠原面積/膠原纖維+肌纖維總面積）×100%。（3）蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)（Western Blot）采用RIPA 組織裂解液提取各組心肌組織蛋白，蛋白定量，按比例加入上樣緩沖液煮沸10 min，冷卻后取35 μg 蛋白上樣，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，將膜浸于5%脫脂奶粉封閉后分別置于p?GSK?3β、TGF?β1 及β?Actin 一抗中孵育，4℃過(guò)夜。再TBST 緩沖液洗膜三次，室溫孵育二抗1 h 后TBST 再次洗滌，在膜上加入ECL化學(xué)發(fā)光液，曝光顯影，并用Image?J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變 HE 染色結(jié)果顯示，Sham 組大鼠心肌纖維排列有序，未見(jiàn)明顯異常；MI 組心肌組織出現(xiàn)大量心肌纖維斷裂、壞死，并被膠原纖維所取代；MI+BMP7 組較MI 組而言，心肌纖維壞死減少，心肌纖維化程度得到明顯改善，見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠心肌纖維化情況 Masson 染色結(jié)果顯示，Sham 組心肌纖維間僅有少量的膠原纖維；與Sham 組相比，MI 組心肌纖維排列紊亂，可見(jiàn)大量的膠原纖維沉積（P＜0.05）；而使用BMP7 治療后明顯減輕了心肌組織纖維化程度（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 各組大鼠心肌組織中p?GSK?3β 及TGF?β1的蛋白表達(dá) 與Sham 組相比，MI 組大鼠心肌組織中p?GSK?3β及TGF?β1的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（均P＜0.05）；而MI+BMP7組大鼠心肌組織p?GSK?3β 及TGF?β1 的蛋白表達(dá)水平明顯低于MI 組（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖1 各組大鼠心肌組織HE 染色結(jié)果（×400）

圖2 Masson 染色檢測(cè)各組心肌纖維化情況（×200）

圖3 各組大鼠心肌組織中p?GSK?3β 及TGF?β1 蛋白表達(dá)情況

3 討 論

心肌纖維化是MI 后所致缺血性心臟病的常見(jiàn)結(jié)果，可作為心力衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［5］。因此，MI 后心肌纖維化的治療成為了心血管疾病研究的熱點(diǎn)。大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎4 周后可誘導(dǎo)心肌纖維化模型，目前此模型已廣泛應(yīng)用于心肌纖維化研究。本研究應(yīng)用該方法成功構(gòu)建了大鼠心肌纖維化模型，模型組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維大量沉積，纖維化相關(guān)蛋白p?GSK?3β 和TGF?β1顯著升高，而應(yīng)用BMP7 干預(yù)后，以上纖維化相關(guān)蛋白隨之降低，心肌纖維化程度得到明顯改善，其機(jī)制可能是BMP7 通過(guò)GSK?3β 通路來(lái)改善MI 后心肌纖維化。

既往研究表明，TGF?β1 是公認(rèn)的器官纖維化指標(biāo)，在缺血性心臟病中促進(jìn)成纖維細(xì)胞活化和膠原纖維沉積［6，7］。目前研究顯示，多種信號(hào)分子及通路可調(diào)控TGF?β1/Smads 信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌纖維化程度，也稱為通路串?dāng)_，GSK?3β 便是其中之一。GSK?3β 是一種可調(diào)節(jié)糖原合成酶活性的絲氨酸/蘇氨酸激酶，其活性受到多種機(jī)制的復(fù)雜調(diào)控，是少數(shù)可通過(guò)磷酸化而失活的蛋白激酶之一。多項(xiàng)研究證實(shí)，GSK?3β 介導(dǎo)心肌纖維化負(fù)性調(diào)節(jié)作用在限制MI 后心肌重構(gòu)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［8，9］。此外，GSK?3β 可直接控制Smad?3 活性及其蛋白穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控TGF?β1/Smads 信號(hào)傳導(dǎo)，GSK?3β 缺失或活性降低可導(dǎo)致TGF?β1/Smads 信號(hào)傳導(dǎo)通路過(guò)度激活，誘導(dǎo)心肌纖維化表型［8，10］。

在結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支4 周后，MI 組大鼠心肌組織心肌纖維排列紊亂，可見(jiàn)大量的膠原纖維沉積，證明本模型確實(shí)誘發(fā)了心肌纖維化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MI 組p?GSK?3β 和TGF?β1 表達(dá)量較Sham 組明顯升高，這與先前研究一致［9］。而相較于MI 組，給予BMP7 治療后p?GSK?3β 和TGF?β1表達(dá)量均顯著下調(diào)，且心肌纖維化程度得到明顯改善。說(shuō)明外源性BMP7 治療可能通過(guò)改善MI 誘導(dǎo)的GSK?3β 活性降低，從而抑制TGF?β1/Smads 信號(hào)傳導(dǎo)通路過(guò)度激活，減輕心肌纖維化。

綜上，本研究通過(guò)制備大鼠MI 后心肌纖維化模型將BMP7 與纖維化負(fù)調(diào)節(jié)因子GSK?3β 聯(lián)系起來(lái)，結(jié)果證明外源性BMP7 可改善MI 誘導(dǎo)的不良心室重構(gòu)，而GSK?3β 介導(dǎo)的纖維化負(fù)調(diào)控可能參與了BMP7 對(duì)MI 后心肌纖維化的保護(hù)機(jī)制，具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步使用通路抑制劑或體外實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，為心肌纖維化疾病的治療提供一個(gè)新的治療方向。