雷公藤甲素調(diào)節(jié)NF-κB通路對(duì)膿毒血癥大鼠心肌損傷的保護(hù)作用*

孫貝貝， 陳雪梅， 王爍陽， 楊 倩， 楊永芝， 朱 紅， 陳雪祎， 王海華△

（1皖南醫(yī)學(xué)院生理教研室，2皖南醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，3皖南醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，安徽蕪湖241002）

膿毒血癥是宿主對(duì)感染或損傷的全身有害反應(yīng)，嚴(yán)重者會(huì)造成休克。大量研究表明，心肌功能障礙是膿毒血癥患者的常見并發(fā)癥。然而，膿毒血癥引起的心肌功能障礙的確切機(jī)制尚不明確[1]。相關(guān)研究顯示，心肌的炎癥以及炎癥信號(hào)的持續(xù)激活是膿毒血癥心功能障礙的起始環(huán)節(jié)[2]。諸多研究顯示，Toll 樣受體信號(hào)通路的下游信號(hào)分子NF-κB 在免疫應(yīng)答和炎癥的各個(gè)階段的早期生物進(jìn)程扮演了重要角色，尤其與心肌炎性損傷密切相關(guān)[3]。由于膿毒血癥心肌損傷病死率高，同時(shí)沒有安全有效的藥物，因此探討膿毒血癥心肌損傷發(fā)病機(jī)制和尋求有效防治藥物至關(guān)重要。

雷公藤甲素（triptolide，TP）是從藥用植物雷公藤中分離出來的主要活性天然產(chǎn)物，這些化合物表現(xiàn)出相似的藥理活性，在腫瘤和炎癥的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[4]。近期研究表明，TP通過下調(diào)NFκB 信號(hào)通路減輕膜性腎小球腎炎大鼠的炎癥反應(yīng)[5]，TP 通過抑制NF-κB 的活性和表達(dá)來減輕小鼠急性肺損傷[6]，TP 通過NF-κB 通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化改善脊髓損傷[7]，但其在膿毒血癥心肌損傷中的作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)尚不明晰。本文應(yīng)用CLP 法構(gòu)建膿毒血癥模型，進(jìn)一步探討雷公藤甲素在膿毒血癥心肌損傷中的器官保護(hù)機(jī)制，為膿毒血癥心肌損傷提供參考資料。

材料和方法

1 動(dòng)物

60 只SPF 級(jí)3 月齡雄性SD 大鼠（290±20）g 許可證號(hào)SCXK（魯）20140007，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。

2 藥物試劑與儀器

TP（T819207-20 mg，純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司）；cTn-I 酶聯(lián)免疫試劑盒（南京建成生物工程研究所）；CK-MB、IL-6 和TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；兔抗鼠GAPDH 單克隆抗體，兔抗鼠TLR4 單克隆抗體和兔抗鼠NF-κB p65 單克隆抗體（武漢三鷹有限公司）；兔抗TAK1（抗體CST）；ECL 化學(xué)發(fā)光液（上海生物工程有限公司）；PowerLab8-35Power Lab 系統(tǒng)（埃德儀器公司）；電泳儀和轉(zhuǎn)膜槽（Biorad）；超靈敏多功能成像儀AI600和高速離心機(jī)（GE）

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 膿毒血癥模型的建立 SD 大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg 腹腔注射，麻醉后固定于鼠板，先去除腹部毛發(fā)，沿腹白線做1 cm 的中線切口，逐層打開腹腔，并找到盲腸。然后在盲腸末端1 cm處用3/0絲線緊密地結(jié)扎，并使用7 號(hào)針在距其遠(yuǎn)端約0.5 cm 處穿刺兩次。擠出少量糞便放入腹腔。將盲腸放回其正常的腹腔內(nèi)位置，并以兩層閉合腹部。在沒有CLP 的情況下，假手術(shù)（sham）組中的大鼠進(jìn)行完全相同的程序。所有動(dòng)物在手術(shù)后立即皮下注射30 mL/kg 生理鹽水進(jìn)行液體復(fù)蘇并給予大鼠復(fù)溫。48 h后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、食欲減退，解剖大鼠發(fā)現(xiàn)腸腔有水腫、黏連、血性液體，即造模成功[8-10]。

3.2 分組和給藥 將60只大鼠隨機(jī)分配為6組（n=10）：假手術(shù)（sham）組、CLP 組、CLP+TP-L（50 μg/kg）、CLP+TP-M（100 μg/kg）、CLP+TP-H（200 μg/kg）和CLP+PMX-B（1 mg/kg）組[11-14]。所有大鼠術(shù)前禁食，不限制飲水。采用CLP 法建立膿毒血癥心肌損傷模型。TP各干預(yù)組和CLP+PMX-B組術(shù)后4 h腹腔注射藥物，24 h 后再注射一次。48 h 后，麻醉處死大鼠，測(cè)試相應(yīng)指標(biāo)。

3.3 大鼠生存分析 構(gòu)建膿毒血癥模型后，每12 h觀察大鼠的存活情況，連續(xù)觀察72 h，統(tǒng)計(jì)生存率并進(jìn)行比較。

3.4 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 大鼠麻醉后由右頸總動(dòng)脈插管，通過PowerLab 系統(tǒng)先測(cè)定平均動(dòng)脈壓（mean arterial blood pressure，MABP），再測(cè)左心室收縮峰壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左心室舒張末壓（left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP）、心率（heart rate，HR）、左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率（maximal increase/decrease rate of left ventricular pressure，±dp/dtmax）。

3.5 HE 染色 采血后立即取大鼠的心臟，然后放入40%多聚甲醛溶液中固定。將組織脫水和石蠟包埋，然后進(jìn)行病理切片。HE 染色后，切片在55℃烘箱中烘20 min后封片，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

3.6 大鼠血清中CK-MB 和cTn-I 含量和血漿中TNF-α和IL-6的含量測(cè)定 CLP術(shù)后48 h采血，取兩份血液分別放入肝素抗凝管和普通EP 管中，靜置離心后分血漿和血清備用。通過相應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒，測(cè)定平均吸光度（A）值。

3.7 Western blot 法檢測(cè)TLR4、TAK1 和NF-κB p65的表達(dá)情況 稱取0.05 g 心肌組織提總蛋白，每個(gè)樣品取200 uL 上清液，加入5× SDS-PAGE 上樣緩沖液50 μL，在沸水中變性5 min，行8% SDS-PAGE 后，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后用脫脂奶粉封閉2 h 后，放入Ⅰ抗（1∶1 000）中過夜孵育，然后在Tris 緩沖鹽水吐溫中洗滌3 次，加入Ⅱ抗（1∶5 000），并孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光（ECL）用于顯影圖像。通過ImageJ 軟件分析靶蛋白條帶的灰度值。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了3次。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均由SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理。測(cè)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）的形式表示。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)使用單因素方差分析進(jìn)行多組之間的比較。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠72 h生存率分析

結(jié)果顯示：sham組大鼠72 h內(nèi)均沒有出現(xiàn)死亡，與sham 組相比，CLP組存活率下降（P＜0.05），與CLP組相比，CLP+TP-M、CLP+TP-H 組和CLP+PMX-B 組均能提高大鼠生存率（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. Comparison of rat survival rate in each group.Mean±SD.n=10.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs CLP group.圖1 各組大鼠生存率的比較

2 各組大鼠MAP和心功能變化

心功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與sham 組相比，CLP 組大鼠MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax顯著降低（P＜0.05）；與CLP 組相比，CLP+TP-M 組、CLP+TP-H組和CLP+PMX-B 組大鼠MABP、LVDP×HR 和±dp/dtmax均顯著升高（P＜0.05），見圖2及表1。

3 各組大鼠血清中CK-MB和cTn-I含量

CLP 組CK-MB 和cTn-I 含 量 高 于sham 組（P＜0.05）；TP各干預(yù)組和CLP+PMX-B組CK-MB和cTn-I 含量均低于CLP 組（P＜0.05）；與CLP+TP-L 組比較，CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 組中CKMB和cTn-I含量顯著降低（P＜0.05），見表2。

4 各組大鼠血漿中TNF-α和IL-6含量

CLP 組TNF-α 和IL-6 含 量 高 于sham 組（P＜0.05）；TP 各干預(yù)組和CLP+PMX-B 組TNF-α 和IL-6含量均低于CLP 組（P＜0.05）；與CLP+TP-L 組比較，CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 組中TNF-α 和IL-6含量顯著降低（P＜0.05），見表3。

5 各組心肌組織病理變化

HE 染色結(jié)果顯示，sham 組心肌細(xì)胞完整，肌纖維清晰排列，無炎癥細(xì)胞浸潤；CLP組可見血管擴(kuò)張充血，心肌細(xì)胞灶狀變性壞死，炎癥細(xì)胞浸潤；與CLP 組相比，CLP+TP-L 組未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，但心肌細(xì)胞腫脹，橫紋消失，細(xì)胞核固縮；而CLP+TP-M、CLP+TP-H 和CLP+PMX-B 組心肌細(xì)胞病理改變好轉(zhuǎn)趨于正常，見圖3。

6 各組大鼠心肌組織中TLR4、TAK1 和NF-κBp65蛋白的表達(dá)

Figure 2. Changes in cardiac function of rats in each group.圖2 各組大鼠心功能變化

表1 各組大鼠心功能變化Table 1. Changes of cardiac function in rats in each group（Mean±SD. n=10）

表2 各組大鼠血清中CK-MB和cTn-I含量比較Table 2. Comparison of CK-MB and cTn-I levels in serum of rats in each group（Mean±SD. n=10）

表3 各組大鼠血漿中TNF-α和IL-6含量比較Table 3. Comparison of TNF-α and IL-6 levels in plasma of rats in each group（Mean±SD. n=10）

Figure 3. Pathological results of myocardium with HE staining. A and D：the cardiomyocytes in sham group were intact；B and E：in CLP group，vascular dilatation and congestion，focal degeneration and necrosis of cardiomyocytes，and inflammatory cell infiltration were observed；C and F：in CLP+TP-L group，the myocardial cells were swollen；G-L：transverse striae disappeared and nuclei were shrunken. The pathological changes of myocardial cells in CLP+TP-M，CLP+TP-H and CLP+PMXB groups were improved and tended to be normal. Scale bar=100 μm in A，B，C，G，H and I；scale bar=20 μm in D，E，F(xiàn)，J，K and L.圖3 HE染色心肌病理結(jié)果

Western blot 結(jié)果顯示，CLP 組TLR4、TAK1 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)量顯著高于sham 組（P＜0.05）；CLP+TP-M、CLP+TP-H和CLP+PMX-B組TLR4、TAK1和NF-κB p65 蛋白表達(dá)量均低于CLP 組（P＜0.05）；而CLP+TP-L 組TLR4 和NF-κB p65 蛋白表達(dá)量與CLP組相比無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

Figure 4. Expression levels of TLR4，TAK1 and NF-κB p65 proteins in myocardium of rats in each group. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CLP group；△P＜0.05 vs CLP+TP-L group.圖4 TLR4、TAK1和NF-κB p65蛋白在各組大鼠心肌中的表達(dá)水平

討論

臨床上耐藥菌株的日漸增多與抗菌藥物的濫用有關(guān)，導(dǎo)致了膿毒血癥患者的抗生素療效不盡人意，新型抗菌藥物的研發(fā)及其臨床應(yīng)用滯后，致使膿毒血癥患者死亡的發(fā)生率居高不下[15]。通過盲腸結(jié)扎穿刺法復(fù)制大鼠膿毒血癥更接近臨床患者病理進(jìn)程，是研究其發(fā)生發(fā)展機(jī)制的合適模型[16]。多器官功能障礙和衰竭是臨床上膿毒血癥患者常見的并發(fā)癥，心臟是膿毒血癥造成的常見受損靶器官[17]。心肌的炎癥以及炎癥信號(hào)的持續(xù)激活是膿毒血癥心功能障礙的起始環(huán)節(jié)[2]。深入探究膿毒血癥的發(fā)病機(jī)制并尋求有效的防治藥物對(duì)于防治膿毒血癥尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)復(fù)制的膿毒血癥大鼠體內(nèi)致病菌革蘭氏陰性菌最常見，細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性細(xì)菌外膜的主要成分，當(dāng)LPS 進(jìn)入大鼠體內(nèi)與Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）受體結(jié)合，活化NF-κB 信號(hào)通路，NF-κB 主要以p65-p50 二聚體的形式存在，p65 亞基與多種炎癥性疾病有關(guān)[18-19]。炎癥疾病中，由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）在膿毒血癥導(dǎo)致的心肌炎性損傷中扮演重要角色[20]。多黏菌素B 常用于治療臨床難治性革蘭陰性菌感染患者[21]。

TP具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用，我們研究室前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)TP 能改善內(nèi)毒血癥大鼠血管低反應(yīng)性，可能是通過TLR4/NF-κB 通路保護(hù)內(nèi)皮功能實(shí)現(xiàn)的[14]。TLR4/NF-κB 通路是經(jīng)典的炎癥信號(hào)通路，不僅刺激細(xì)胞因子的表達(dá)，而且致使炎癥反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大，TAK1 通過激活的JNK 和p38 MAPK 發(fā)起MKK 級(jí)聯(lián)，刺激IκB激酶，導(dǎo)致NF-κB活化，在此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)效應(yīng)中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[22-23]。

cTn-I存在于心肌細(xì)胞中，血清中cTn-I水平與心肌功能損傷程度呈正相關(guān)，CK-MB 是診斷心肌損傷特異性較高度的酶[24]。MABP 反映血管張力變化，HR×LVDP 代表心臟做功，+dp/dtmax和-dp/dtmax絕對(duì)值大小，反映大鼠心臟收縮和舒張功能強(qiáng)弱[25]。

作為臨床上常用的有效的抗炎藥雷公藤甲素，對(duì)于其作用機(jī)制研究是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，有關(guān)其通過抗炎作用在膿毒血癥心肌損傷中的作用及其作用機(jī)制研究尚鮮有文獻(xiàn)報(bào)道[26]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與sham 組相比，CLP 組大鼠生存率低，心功能顯著下降，心肌血管擴(kuò)張充血、炎癥細(xì)胞浸潤、細(xì)胞灶狀變性壞死；血清中CK-MB、cTn-I及血漿中TNF-α和IL-6的含量顯著增高，心肌TLR4、TAK1 和NF-κB p65 的蛋白表達(dá)顯著增多；與CLP 組相比，TP 干預(yù)后，呈劑量依賴性提高膿毒血癥大鼠生存率，改善其心肌結(jié)構(gòu)和功能，使血清中CK-MB 和cTn-I及血漿中TNF-α和IL-6 的含量顯著降低，心肌TLR4、TAK1 和NF-κB p65 的蛋白表達(dá)亦顯著減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，TP 干預(yù)后對(duì)膿毒血癥大鼠心肌損傷有明顯的保護(hù)作用。

綜上所述，通過TP 干預(yù)后，TP 能降低CLP 大鼠體內(nèi)TNF-α 和IL-6 的釋放，使 其 血 液 中CK-MB 和cTn-I 的含量減少，從而對(duì)CLP 大鼠心肌損傷起到明顯的保護(hù)作用，其效應(yīng)可能與抑制TLR4/TAK1/NFκB信號(hào)通路有關(guān)。