響應面法優(yōu)化超聲強化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的工藝

石 峰， 李 僉， 田 晶， 費 旭， 劉 向 麗， 羅 健， 張 楠， 陳 高 俊

( 1.大連工業(yè)大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034； 2.大連工業(yè)大學 分析中心, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

柚苷酶是一種重要的生物酶制劑[1]，由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成。柑橘類果汁加工過程中常用柚苷酶進行酶法脫苦，從而改善飲品的風味[2]。α-L-鼠李糖苷酶可將柚柑類果汁中的黃烷酮糖苷類化合物——柚皮苷(苦味較大)水解成鼠李糖和普魯寧(苦味較小)，普魯寧可在β-D-葡萄糖苷酶的繼續(xù)作用下生成柚皮素(無苦味)和葡萄糖，使果汁脫苦[3]。近年來，隨著研究的不斷深入，柚苷酶開始被廣泛應用于食品和醫(yī)藥工業(yè)[4]。

研究表明，超聲刺激能夠有效提高相關酶的產(chǎn)量[5-6]。但目前應用超聲刺激強化柚苷酶發(fā)酵酶活的相關研究鮮有報道。本實驗采用超聲刺激對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶過程進行研究，并通過響應曲面法對相關操作參數(shù)進行優(yōu)化，獲得最佳工藝條件，為深入研究新型柚苷酶發(fā)酵策略，促進生物食品酶及生物催化的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供基礎數(shù)據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

黑曲霉FFCC uv-11，大連工業(yè)大學菌種保藏中心提供；柚皮苷，寶雞市方晟生物開發(fā)有限公司；脫脂豆粉，大連調(diào)味食品廠；其他化學試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)條件

將低溫保存的黑曲霉菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后，取孢子接種于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基。改良后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成(L)[7]：KH2PO4·2H2O 1.5 g，K2HPO4·12H2O 1.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，(NH4)2SO44.0 g，ZnSO4·7H2O 0.09 g，CaCl20.1 g，豆粉2.0 g，蛋白胨2.0 g，酵母浸粉1.0 g，柚皮苷6.0 g；pH 6.0。

1.3 酶活力測定方法

使用Davis法測定發(fā)酵培養(yǎng)基中柚苷酶活力[8-9]。柚苷酶活力定義：在pH 4.5、50 ℃條件下，1 min水解1 μg的柚皮苷所需的酶量為1個酶活性單位(U/mL)[7]。

1.4 超聲對黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶的工藝優(yōu)化

1.4.1 超聲工藝

使用超聲波清洗機(頻率固定為40 kHz)對發(fā)酵搖瓶進行間歇性超聲處理，并通過冷卻水循環(huán)系統(tǒng)控制超聲水浴溫度為30 ℃。以未超聲處理的試驗組為對照組，研究不同超聲參數(shù)對柚苷酶發(fā)酵酶活力的影響。

1.4.2 單因素試驗

1.4.2.1 超聲時期的確定

分別在發(fā)酵18、24、30、36、42 h時進行超聲，功率150 W，時長5 min，每組試驗3個平行，發(fā)酵結束后測定柚苷酶活力。

1.4.2.2 超聲功率的確定

在最佳超聲時期，分別在超聲功率125、150、175、200、225 W時進行超聲，時長5 min，每組試驗3個平行，發(fā)酵結束后測定柚苷酶活力。

1.4.2.3 超聲時長的確定

在其他最佳條件下，分別進行3、5、10、15、20 min 超聲，每組試驗3個平行，發(fā)酵結束后測定柚苷酶發(fā)酵酶活力。

1.4.2.4 超聲次數(shù)的確定

在其他最佳條件下，分別進行1～4次超聲，每組試驗3個平行，發(fā)酵結束后測定柚苷酶發(fā)酵酶活力。

1.4.2.5 超聲時間間隔的確定

在其他最佳條件下，分別間隔6、12、18、24 h進行兩次超聲，每組試驗3個平行，發(fā)酵結束后測定柚苷酶發(fā)酵酶活力。

1.4.3 響應面法優(yōu)化發(fā)酵工藝

在單因素試驗基礎上，通過響應面分析法和Box-Behnken設計試驗，以柚苷酶活力作為響應值，以超聲時期(A)、超聲功率(B)、超聲時長(C)、超聲次數(shù)(D)、超聲時間間隔(E)進行五因素三水平的Box-Behnken試驗設計，采用響應曲面法分析各因素對響應值的影響。試驗因素水平見表1。

表1 Box-Behnken設計試驗因素水平表Tab.1 Code and true values of variables of the Box-Benhnken design models

2 結果與討論

2.1 超聲時期對柚苷酶活的影響

如圖1所示，在黑曲霉發(fā)酵18 h進行超聲，柚苷酶活最低，這可能是因為在發(fā)酵前期進行超聲處理使微生物發(fā)酵的延滯期延長，相對生長速率降低，從而影響發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)生。發(fā)酵30 h進行超聲時，發(fā)酵終點柚苷酶活達到最大，為918.3 U/mL。發(fā)酵時間持續(xù)延長，柚苷酶活有所下降，因此確定最佳超聲時期為菌體發(fā)酵30 h。

圖1 超聲時期對柚苷酶活的影響Fig.1 Effect of ultrasonic stimulation stage on naringinase activity

2.1.2 超聲功率對柚苷酶活的影響

如圖2所示，隨著超聲功率的增大，柚苷酶活不斷增加，當超聲功率為175 W時，柚苷酶活達到最大。而進一步增大超聲功率，柚苷酶活快速降低，可能是因為超聲功率的增加使得空化作用加強，較強的空化作用會對菌體造成損傷，導致菌體產(chǎn)酶能力降低[10]，這與張澤棟等[11]的研究結果相似，因此選取175 W為最佳超聲功率。

圖2 超聲功率對柚苷酶活的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on naringinase activity

2.1.3 超聲時長對柚苷酶活的影響

如圖3所示，在超聲功率一定的情況下，隨著超聲時長的增加，柚苷酶活不斷增加，當超聲時長為10 min時，柚苷酶活達到最大。當超聲時長繼續(xù)延長時，柚苷酶活顯著降低，這可能是因為過度的超聲會造成細胞損傷[12]，導致產(chǎn)酶能力下降。因此選取10 min為最佳超聲時長。

圖3 超聲時長對柚苷酶活的影響Fig.3 Effect of the ultrasonic duration on naringinase activity

2.1.4 超聲次數(shù)對柚苷酶活的影響

如圖4所示，當超聲次數(shù)為2時，柚苷酶活達到最高，繼續(xù)增加超聲次數(shù)，柚苷酶活降低。這可能是由于適當?shù)某暷軌虼龠M菌絲體的生長和次級代謝產(chǎn)物的合成，但多次刺激會對細胞膜造成損傷[13]，因此確定最佳超聲次數(shù)為2。

圖4 超聲次數(shù)對柚苷酶活的影響Fig.4 Effect of ultrasonic times on naringinase activity

2.1.5 超聲時間間隔對柚苷酶活的影響

如圖5所示，當超聲時間間隔為12 h時柚苷酶活達到最大，繼續(xù)延長超聲時間間隔會導致柚苷酶活的降低，這可能是由于超聲時間間隔的延長使得菌體對超聲的反應減弱，進而導致柚苷酶活的下降。因此確定最佳超聲時間間隔為12 h。

圖5 超聲時間間隔對柚苷酶活的影響Fig.5 Effect of ultrasonic interval on naringinase activity

2.2 響應面法優(yōu)化工藝

以超聲時期(A)、超聲功率(B)、超聲時長(C)、超聲次數(shù)(D)、超聲時間間隔(E)為試驗因素，以柚苷酶活為響應值進行五因素三水平的Box-Behnken設計，采用響應曲面法對超聲強化柚苷酶活的工藝進行優(yōu)化。Box-Behnken設計由46個試驗組組成，包括40個因子點和6個中心點，響應面試驗方案及結果如表2所示。

表2 響應曲面試驗方案與結果Tab.2 Experimental scheme and results of RSM

2.2.1 數(shù)學模型建立

使用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到柚苷酶活與各因素間的二元回歸方程：

N=1 058.34+4.36A-6.60B+8.21C+

0.34D-4.81E-0.12AB-11.24AC-

23.14AD+7.17AE-10.26BC-

15.84BD-9.13BE+10.14CD+

5.74CE+11.00DE-29.06A2-

32.09B2-15.14C2-14.64D2-7.74E2

2.2.2 方差分析

由表4可知，對響應值產(chǎn)生影響的5個因素對柚苷酶活的影響作用由大到小依次為B、C、E、A、D，其中B、C、E三項影響極顯著(P<10-4)，A影響顯著(P<0.05)，D影響不顯著(P>0.05)；A、B、C、E各因素平方項對響應值的影響都達到極顯著水平，所以超聲時機、超聲功率、超聲時長和超聲間隔時間對柚苷酶活的影響較大。

2.2.3 響應面分析

使用Design-Expert 8.0.6軟件繪制出各因素對響應值影響的三維曲面圖，如圖6所示。可以看出，超聲時期、功率、時長和時間間隔都存在相關性，所有的曲面圖均為開口向下的凸面，并存在最高點，說明在試驗考察范圍內(nèi)存在最大的柚苷酶活響應值。

表3 響應曲面回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of RSM regression equation

由圖6(a)可以看出，當超聲功率、超聲次數(shù)和超聲時間間隔為零水平時，隨著A和C的增大，柚苷酶活呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢；由圖6(b)可以看出，當其余因素處于零水平時，隨著A和E的增大，柚苷酶活達到最大酶活后快速降低，A、E表現(xiàn)出對柚苷酶活的非線性影響；由圖6(c)可以看出，隨著B和C的增大，柚苷酶活快速增大，后趨于平緩，響應曲面的坡度較陡，B、C對柚苷酶活的影響顯著；圖6(d)為C、E對柚苷酶活的交互影響。總體來說，各因素的交互影響效果明顯，等高線都呈現(xiàn)橢圓形，說明該響應面優(yōu)化設計能夠合理反映出各因素對響應值的影響。

2.2.4 最佳超聲工藝的確定和驗證試驗

最佳超聲刺激工藝條件：超聲時期27.25 h、超聲功率160.12 W、超聲時長14.43 min、超聲次數(shù)2.83、超聲時間間隔13.02 h，柚苷酶活的理論預測值最高可達1 064.19 U/mL。結合實際試驗條件，確定超聲強化黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶的最佳工藝參數(shù)為超聲時機27 h、超聲功率160 W、超聲時長14 min、超聲次數(shù)2次、超聲間隔時間13 h。在該工藝條件下測得柚苷酶活為1 059.20 U/mL，與預測值非常接近。

圖6 響應面分析各因素對柚苷酶活影響

Fig.6 Response surface plots of the effect of two-factor interaction on naringinase activity

3 結 論

對超聲刺激強化黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)柚苷酶過程進行了研究，通過響應曲面法進行試驗設計，獲得了最佳優(yōu)化工藝：超聲時期27 h、超聲功率160 W、超聲時長14 min、超聲次數(shù)2次、超聲時間間隔13 h，柚苷酶活達1 059.20 U/mL，與未進行超聲的對照組相比提高了23.16%。