添加鐵氧化物對水稻土產(chǎn)甲烷微生物EPS性能的影響

李友臣, 王 進, 鐘 成, 陳天虎, 岳正波

(合肥工業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

溫室氣體的溫室效應(yīng)是導(dǎo)致全球變暖的主要原因,而甲烷作為一種溫室氣體,它的溫室效應(yīng)比二氧化碳更強。稻田土壤是溫室氣體甲烷的重要排放源之一,而中國是世界上重要的水稻生產(chǎn)國,水稻種植面積約占世界稻田總面積的23%[1-2]。我國南方水稻土土壤中存在鐵氧化物,其對有機質(zhì)的厭氧產(chǎn)甲烷過程存在一定的促進或抑制作用,鐵氧化物可以作為微生物胞外呼吸的終端電子受體/供體、電子儲存介質(zhì)或種間電子傳遞介質(zhì)促進環(huán)境微生物的新陳代謝[3]。文獻[4]研究發(fā)現(xiàn)在水稻土中添加Fe(OH)3和纖鐵礦后,由于Fe(Ⅲ)還原對電子的競爭消耗,使土壤產(chǎn)甲烷過程被抑制;文獻[5]研究發(fā)現(xiàn)添加鐵氧化物,抑制了水稻土中甲烷的形成。但是結(jié)晶度較高的鐵氧化物如針鐵礦、赤鐵礦、磁鐵礦等對于產(chǎn)甲烷過程具有促進作用;文獻[6]研究發(fā)現(xiàn)以乙酸鈉為碳源,厭氧微生物產(chǎn)甲烷過程中,添加水熱合成針鐵礦和天然針鐵礦能促進甲烷的釋放,使甲烷累計釋放量提前達到最大值;文獻[7]通過富集水稻土微生物研究發(fā)現(xiàn),添加納米磁鐵礦能夠明顯促進丁酸互營氧化產(chǎn)甲烷過程;文獻[8]研究發(fā)現(xiàn)向水稻土中添加導(dǎo)體鐵氧化物磁鐵礦和半導(dǎo)體鐵氧化物赤鐵礦,能夠創(chuàng)造一種特殊的微生物種間相互關(guān)系,從而能夠促進乙醇或乙酸的產(chǎn)甲烷過程。

胞外聚合物(extracellular polymeric substance,EPS)是微生物在基質(zhì)代謝、細胞生長及死亡等各項生命活動中產(chǎn)生的,并釋放一類溶解性的有機質(zhì),主要由多糖、蛋白質(zhì)、核酸、腐殖酸等組成[9-13]。EPS在微生物鐵氧化物共存體系中具有重要作用,鐵氧化物可以同微生物進行胞外電子傳遞,并促進微生物的生長和代謝過程[14-15]。文獻[16]以希瓦氏菌和惡臭假單胞菌的EPS為研究對象,發(fā)現(xiàn)EPS具有氧化還原性質(zhì),蛋白為EPS中的氧化還原物質(zhì)。文獻[17]研究發(fā)現(xiàn)黃酮素在針鐵礦促進甲烷生產(chǎn)過程中發(fā)揮重要作用。但目前對于水稻土甲烷釋放過程中微生物EPS的性質(zhì)認識還比較有限。

三維熒光光譜(excitation-emission-matrix spectra,EEM)能夠獲得激發(fā)波長和發(fā)射波長同時變化時的熒光強度信息,能識別和表征復(fù)雜體系中熒光光譜重疊的對象,是非常有用的光譜指紋技術(shù),具有高靈敏度、高選擇性、高信息量、且不破壞樣品結(jié)構(gòu)等優(yōu)點。而EPS含有熒光性基團物質(zhì),利用EEM對其進行觀測解析已有大量的研究報道,如文獻[9]對厭氧污泥和好氧污泥EPS進行了EEM解析,發(fā)現(xiàn)熒光峰的位置、強度和各種峰強度的比率受pH和EPS濃度影響顯著。文獻[18]發(fā)現(xiàn)熒光類蛋白物質(zhì)在微生物聚集體形成過程中的作用比腐殖酸類物質(zhì)更加重要。因此,本研究構(gòu)建了鐵氧化物水稻土微生物體系,首先研究了以乙酸鈉為底物的甲烷產(chǎn)生過程,然后利用化學(xué)分析、EEM和紅外光譜技術(shù)對EPS及其產(chǎn)生過程進行了分析表征,以期認識EPS組分及性質(zhì)變化規(guī)律,揭示EPS對水稻土甲烷產(chǎn)生過程的影響和作用機制,為進一步認識水稻田溫室氣體釋放提供支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

以500 mL血清瓶為反應(yīng)器,有效反應(yīng)體積為200 mL,乙酸鈉初始濃度為20 mmol/L,水稻土取自合肥肥東,添加量為10.0 g/L。針鐵礦和赤鐵礦添加量為20 mmol/L(基于鐵元素),初始pH為7。加入所有營養(yǎng)成份后,鼓氬氣排除空氣,并用鋁塞密封,置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在產(chǎn)氣量為理論產(chǎn)氣量的1/4、1/2、3/4和結(jié)束時,進行EPS提取,樣品分別記作S1、S2、S3和S4。

1.2 測試分析

1.2.1 EPS提取及成分分析

胞外聚合物EPS的提取采用離心法[19],取50 mL樣品于離心管內(nèi),在5 000 r/min下離心5 min,提取上清液即為EPS。多糖測試方法采用蒽酮硫酸分光光度計法進行測定,以葡萄糖作為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線[20];蛋白質(zhì)測試方法采用改進的Lowry法進行測定,以牛血清蛋白作為標(biāo)樣做標(biāo)準(zhǔn)曲線[21];腐殖酸測定采用福林酚法[22];DNA采用二苯胺法進行測量(標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為2-脫氧-D-核糖);TOC、TN采用島津TOC-V CPH分析儀進行測定。EPS中多糖和蛋白質(zhì)含量分別用比色法測定值同TOC和TN的比值表示。

1.2.2 電化學(xué)表征方法

電化學(xué)實驗在室溫條件下采用三電極體系的電化學(xué)工作站，使用玻碳電極作為工作電極,鉑絲電極作為對電極,以及采用飽和甘汞電極作為參比電極,選用計時安培法測量EPS的電子接受能力,以磷酸鹽(pH=7.0)為緩沖劑,在測量之前使用氮氣吹脫。向20 mL空白體系中(0.1 mol/L KCl,0.1 mol/L phosphate,pH=7.0)加入待測的微生物胞外聚合物樣品1 mL,設(shè)置工作電極Eh=-0.6 V的條件下,測量樣品的電子接受能力[23]。

1.2.3 三維熒光光譜

實驗采用日本分光FP6500 熒光分光光度計對EPS 進行分析。三維熒光光譜以5 nm為增量從激發(fā)波長250 nm掃描到450 nm,以2 nm為增量從發(fā)射波長300 nm掃描到50 nm,掃描速度為2 000 nm/min,響應(yīng)時間為0.2 s。用相同體積的樣品進行測定,采用Origin8.0對光譜圖進行數(shù)據(jù)分析[24]。

1.2.4 傅立葉紅外光譜法

實驗采用日本島津IRPrestige-21 紅外光譜儀對制作好的樣品進行測定。將提取的EPS 倒在培養(yǎng)皿上冰凍,用冷凍干燥機處理后的樣品與KBr 以1:100的比例研磨,壓片成型后用紅外光譜儀測定。掃描條件如下:光譜范圍為4 000～400 cm-1,掃描次數(shù)為10,分辨率為4 cm-1[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲烷產(chǎn)生及底物消耗

體系累積產(chǎn)甲烷及底物消耗過程如圖1所示。

圖1 累積產(chǎn)甲烷及底物消耗過程

接種后25 d處于微生物生長的遲滯期,增長較慢,甲烷產(chǎn)生和底物消耗量均較少。25～60 d處于厭氧微生物增長的對數(shù)期,甲烷產(chǎn)生和底物消耗主要發(fā)生在此階段。60 d后,厭氧微生物處于穩(wěn)定期,底物消耗基本完成。鐵氧化物的加入提升了底物消耗速率和甲烷生成速率,這與文獻[6]的研究結(jié)果一致。

2.2 EPS組分

多糖、蛋白質(zhì)和腐殖酸等是EPS的主要成分[25]。產(chǎn)甲烷過程EPS多糖、蛋白質(zhì)和腐殖酸的變化如圖2所示。

在產(chǎn)甲烷初始階段多糖含量較低,然后逐步增加。蛋白質(zhì)的變化趨勢正好相反,初始階段含量較高,甲烷產(chǎn)生過程中濃度較低。初始腐殖酸含量較低,隨著反應(yīng)的進行,腐殖酸的含量逐漸升高并趨于穩(wěn)定。

各體系反應(yīng)初期(S1)中EPS多糖幾乎無差異,而鐵氧化物的存在促進了胞外蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在甲烷產(chǎn)生的高峰期(S2和S3)添加針鐵礦和赤鐵礦的體系,EPS中多糖和蛋白質(zhì)含量降低。反應(yīng)末期(S4)空白組的多糖較低,蛋白質(zhì)濃度較高。在產(chǎn)甲烷對數(shù)增長期鐵氧化物組腐殖酸的含量高于空白對照組。

產(chǎn)甲烷過程EPS電子接受能力變化如圖3所示,在反應(yīng)初期(S1),EPS的電子接受能力較低。在產(chǎn)甲烷高峰期(S2和S3)EPS的電子接受能力有所提升,鐵氧化物組的電子接受能力礦物組高于空白組,這可能是由于腐殖酸含量較高(圖2c)。腐殖酸含量提升能夠部分解釋添加鐵氧化物體系較高的產(chǎn)甲烷速率和底物消耗速率(圖1)。

圖2 產(chǎn)甲烷過程EPS多糖、蛋白質(zhì)和腐殖酸的變化

圖3 產(chǎn)甲烷過程EPS電子接受能力變化

2.3 EPS的相關(guān)分析

2.3.1 三維熒光光譜

EPS三維熒光光譜的分析結(jié)果如圖4所示,主要出現(xiàn)了4個熒光峰,分別是類色氨酸蛋白質(zhì)峰A(λEx=280 nm,λEm=340 nm),類腐殖酸熒光峰B(λEx=330 nm,λEm=430 nm),類腐殖酸熒光峰C(λEx=405 nm,λEm=459 nm),紫外區(qū)類富里酸熒光物質(zhì)峰D(λEx=255 nm,λEm=482 nm)[26-27]。

圖4 EPS三維熒光光譜分析結(jié)果

反應(yīng)初期(S1)EPS各峰峰強較低表明此時微生物分泌胞外物質(zhì)較少,隨著厭氧微生物的生長,胞外物質(zhì)開始大量生成。在厭氧微生物進入對數(shù)增長期(S2和S3),各體系中類腐殖酸、類富里酸熒光峰的峰強逐漸增強。這和腐殖酸含量變化(圖3)以及底物消耗速率加快(圖1)等現(xiàn)象一致,說明類腐殖酸和類富里酸物質(zhì)在產(chǎn)甲烷過程中具有重要作用。

甲烷產(chǎn)生的高峰期(S2和S3),添加針鐵礦體系中類腐殖酸、類富里酸熒光峰的峰強高于赤鐵礦組以及對照組。這同體系電子傳遞能力以及產(chǎn)甲烷速率的變化相一致。添加赤鐵礦體系中類腐殖酸熒光峰的峰強上升,在樣S3中類腐殖酸熒光峰峰強達到最大,此時赤鐵礦組中產(chǎn)甲烷速率最大(圖1)。在樣S4中,空白組中類色氨酸蛋白質(zhì)峰的峰強最強,與蛋白質(zhì)含量分析結(jié)果一致(圖2b)。

添加針鐵礦組體系中反應(yīng)開始后類腐殖酸熒光峰峰強呈現(xiàn)上升趨勢,反應(yīng)結(jié)束后呈現(xiàn)下降趨勢。這同針鐵礦組中的產(chǎn)甲烷速率相對應(yīng)(圖1)。在厭氧微生物進入對數(shù)增長期后,添加針鐵礦體系類腐殖酸熒光峰的峰強高于空白對照組。結(jié)合底物消耗和甲烷產(chǎn)生過程數(shù)據(jù)可知針鐵礦的加入促進了EPS中腐殖酸含量的增加,提高了體系的電子傳遞能力,進而促進了產(chǎn)甲烷過程。

2.3.2 熒光區(qū)域積分法(FRI)分析

根據(jù)文獻[27]提供的熒光區(qū)域積分法(fluorescence regional integration,FRI),將熒光光譜圖劃分為5個熒光區(qū)域(Ⅰ～Ⅴ),分別對應(yīng)芳香族蛋白質(zhì)、芳香族蛋白質(zhì)Ⅰ、類富里酸物質(zhì)Ⅱ、類色氨酸蛋白質(zhì)和類腐殖酸物質(zhì)。據(jù)此可以對EPS熒光光譜區(qū)域積分可得,每組樣品各個區(qū)域占總區(qū)域物質(zhì)的比例如圖5所示。在樣品S1中,鐵氧化物組蛋白質(zhì)所占比例高于空白對照組,這與圖2b中蛋白質(zhì)的含量相對應(yīng)。而隨著厭氧發(fā)酵的進行,在樣品S3和S4中,鐵氧化物組蛋白質(zhì)所占比例低于空白對照組,腐殖酸和富里酸所占總比例高于空白對照組,這與腐殖酸含量變化規(guī)律相對應(yīng)(圖3)。說明腐殖酸和富里酸在厭氧發(fā)酵過程中具有重要作用。

圖5 EPS的熒光積分分析

2.3.3 熒光類物質(zhì)作用分析

對EEM分析結(jié)果中各熒光峰強度同乙酸鈉消耗速率、產(chǎn)甲烷速率進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)相關(guān)系數(shù)介于0.679～0.998之間。由此表明EPS中的類色氨酸蛋白質(zhì)、類腐殖酸和類富里酸含量與底物消耗速率和產(chǎn)甲烷速率呈一定的正相關(guān),其對于底物消耗和產(chǎn)甲烷具有促進作用。鐵氧化物組底物消耗速率和產(chǎn)甲烷速率在樣品S3中達到最大,而此時鐵氧化物組腐殖酸和富里酸峰強達到最大;空白對照組在樣品S4中,底物消耗速率和產(chǎn)甲烷速率達到最大,此時空白組的腐殖酸和富里酸的峰強最高,這是由于腐殖酸和富里酸具有電子傳遞能力,提升了體系內(nèi)的電子傳遞能力,進而提高了底物消耗速率和產(chǎn)甲烷速率。說明鐵氧化物的加入,較快提升了體系內(nèi)的腐殖酸和富里酸的生成,從而提升了反應(yīng)底物消耗速率和產(chǎn)甲烷速率。鐵氧化物具有導(dǎo)電性,因此鐵氧化物的加入,可能提升了微生物間的電子傳遞能力[28],促進了微生物的快速生長,從而促進了微生物胞外聚合物的快速分泌,EPS中含有腐殖酸和富里酸的生成,進而使鐵氧化物組的底物消耗速率和產(chǎn)甲烷速率快速達到最大。

2.4 紅外光譜表征

3組樣品EPS的紅外光譜圖如圖6所示,圖6中3 431 cm-1處是-OH的伸縮振動;3 000 cm-1處是C—H的伸縮振動,1 654 cm-1處是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ的C=O伸縮振動；1 532 cm-1處是蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ的N-H變形振動；1 455 cm-1處是CH3振動；1 400 cm-1處是羧基的伸縮振動[29]；1 092 cm-1和1 042 cm-1為多糖結(jié)構(gòu)的振動[30]。1 400 cm-1處羧基伸縮振動和3 431 cm-1處-OH的伸縮振動是腐殖酸、富里酸主要官能團,1 654 cm-1處蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ的C=O伸縮振動和1 532 cm-1處蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ的N-H變形振動是類色氨酸蛋白質(zhì)的主要官能團[31]。

從圖6可以看出，隨著反應(yīng)進行,各峰強度逐漸升高。在樣S4中,赤鐵礦組位于1 092 cm-1多糖結(jié)構(gòu)振動峰強最高,這與圖2中多糖含量相對應(yīng)。從紅外光譜中可以看出,EPS中存在腐殖酸、富里酸和類色氨酸蛋白質(zhì)等物質(zhì),與化學(xué)分析及EEM分析結(jié)果一致。

在樣S2和S3中,鐵氧化物組位于1 400 cm-1處羧基和3 431 cm-1處羥基的峰強,赤鐵礦組高于針鐵礦組高于空白對照組,說明鐵氧化物的加入促進了體系內(nèi)的腐殖酸含量,且赤鐵礦的促進作用高于針鐵礦組高于空白對照組。在樣S1、S2和S3中,赤鐵礦組位于1 532 cm-1處是蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ的N-H變形振動,強于針鐵礦組和空白對照組。樣S4中空白對照組位于1 654 cm-1處是蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ的C=O伸縮振動峰強最強,與三維熒光光譜結(jié)果相一致。

圖6 EPS的紅外光譜圖

3 結(jié) 論

鐵氧化物的加入提升了水稻土產(chǎn)甲烷微生物體系的產(chǎn)甲烷速率和底物消耗速率。化學(xué)分析和紅外分析結(jié)果表明EPS主要組分為多糖、蛋白質(zhì)和腐殖酸類物質(zhì)。EEM分析結(jié)果表明EPS組分腐殖酸、富里酸和類色氨酸蛋白質(zhì)強度變化同產(chǎn)甲烷速率、底物消耗速率呈現(xiàn)線性正相關(guān)關(guān)系。鐵氧化物的加入有利于促進EPS組分腐殖酸的生成,進而提高了體系內(nèi)微生物的電子接收能力,從而有利于微生物主導(dǎo)的底物消耗和甲烷產(chǎn)生過程。