高效液相色譜法測定苦木注射液中7種生物堿含量*

賴正權(quán)，艾偉鵬，廖慧君，廖祝元，丘金燕，蔡雨峰，楊婷婷，黃裕茵，廖醒環(huán)，蘇子仁

[1.深圳大學(xué)總醫(yī)院藥學(xué)部，深圳 518055；2.華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院(深圳大學(xué)第六附屬醫(yī)院)藥學(xué)部，深圳 518052；3.江西青峰藥業(yè)有限公司，贛州 341000；4.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)藥數(shù)理工程研究院，廣州 510006]

苦木注射液收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第二十冊，為苦木干燥枝或莖經(jīng)加工制成。其原料苦木[Picrasmaquassioides(D.Don)Benn]為苦木科(Simaroubaceae)苦木屬植物，具有清熱、解毒、消炎的功效，用于感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎、腸炎、細(xì)菌性痢疾等[1]。現(xiàn)代化學(xué)研究表明，苦木含有生物堿、苦味素、三萜類和揮發(fā)油類等化學(xué)成分，其中生物堿及苦味素為其主要的藥效成分[2-12]，具有抗菌消炎、解熱降壓、抗腫瘤、抗蛇毒和抗瘧等作用[13-16]。

部頒標(biāo)準(zhǔn)中對苦木注射液的質(zhì)量控制方法僅有薄層色譜法及重量法，質(zhì)量控制方法有待提高。有文獻(xiàn)報道采用高效液相色譜法單獨測定苦木注射液中鐵屎米酮類或咔巴啉類生物堿的含量[17-18]，其標(biāo)準(zhǔn)多側(cè)重于測定苦木注射液中同類母核結(jié)構(gòu)成分的含量，而同時測定多個母核結(jié)構(gòu)成分的方法尚未見報道。為確保該品種的質(zhì)量穩(wěn)定、可控，本實驗建立HPLC法同時測定苦木注射液中鐵屎米酮類和咔巴啉類共7個生物堿含量的分析方法，可為該品種質(zhì)量控制體系的建立提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 島津高效液相色譜儀(SPD-M20A PDA檢測器、CTO-20A柱溫箱、SIL-20AC自動進(jìn)樣器、LC-20AT泵、LC solution色譜工作站，日本島津公司)；試驗室專用超純水機(jī)(重慶利迪現(xiàn)代水技術(shù)設(shè)備有限公司)；BSA224S-SW 電子天平(感量：0.1 mg，德國Sartorius公司)；CP225D電子天平(感量：0.01 mg，德國Sartorius公司)。

1.2試藥 對照品1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉(a)，1-甲酸-β-咔巴啉(b)，1-丙酸基-β-咔巴啉(c)，3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮(d)，3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮(e)，4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮(f)，4，5-二甲氧基-鐵屎米酮(g)由廣州中醫(yī)藥大學(xué)新藥開發(fā)研究中心從苦木[Picrasmaquassioides(D.Don)Benn.]的莖中分離得到，并經(jīng)四大光譜確定結(jié)構(gòu)式，HPLC歸一法測定純度>98%，可供對照用，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。苦木注射液由青峰藥業(yè)有限公司提供。甲醇為色譜純(Merck公司)，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

圖1 7個生物堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1混合對照品溶液的制備 分別取1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5、6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5、6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、4，5-二甲氧基-鐵屎米酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度分別為30，153，22.8，11.4，7.2，12，3 μg·mL-1對照品儲備溶液。4 ℃保存、備用。臨用前，用甲醇按照1，2/3，1/2，1/3，1/6和1/30的比例稀釋對照品儲備溶液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2供試品溶液的制備 取適量苦木注射液，過孔徑0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3色譜條件 色譜柱為Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相30 mmol·L-1乙酸銨(冰乙酸調(diào)pH值4.5)溶液(A)-甲醇(B)梯度洗脫(0～6 min，5%→6% B；6～9 min，6%→20% B；9～30 min，20%→23% B；30～40 min，23%→30% B；40～50 min，30%→36% B；50～75 min，36%→65% B；75～80 min，65%→5% B；80～85 min，5% B)；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長254 nm。結(jié)果化合物a、b、c、d、e、f、g均能達(dá)到基線分離，樣品中其他成分對測定無干擾，見圖2。

a.1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉；b.1-甲酸-β-咔巴啉；c.1-丙酸基-β-咔巴啉；d.3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮；e.3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮；f.4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮，g.4，5-二甲氧基-鐵屎米酮。

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液，按“2.1”項下方法分別配制成6個不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表1，線性相關(guān)系數(shù)均>0.999 0，表明線性關(guān)系良好。

表1 7個生物堿的線性回歸方程和線性范圍

2.5精密度試驗 取同一份混合對照品溶液(濃度：1/3倍儲備溶液濃度)，按“2.3”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉，1-甲酸-β-咔巴啉，1-丙酸基-β-咔巴啉，3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮，3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮，4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮峰面積的RSD分別為0.2%，0.3%，0.1%，1.0%，0.9%，0.5%和0.9%。表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗 取同一批號苦木注射液(批號：181016)，按“2.2”項下方法制備樣品，在室溫下放置0，4，8，12，24，48 h時，分別按“2.3”項下色譜方法進(jìn)樣測定，記錄各對照品的峰面積。結(jié)果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮峰面積的RSD分別為0.5%，0.7%，0.6%，1.2%，1.8%，0.5%和0.3%。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗 取同一批號苦木注射液(批號：181016)6份，按照“2.2”項下方法制備樣品，按“2.3”項下色譜方法依次進(jìn)樣，分別測定7個生物堿的含量。結(jié)果1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮的平均含量分別為19.14，65.02，11.09，4.89，1.83，4.52，2.03 mg·L-1；RSD分別為0.8%，1.3%，0.4%，1.7%，2.1%，0.7%和0.5%。表明測定方法的重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗 量取已測含量的苦木注射液(批號：181016)2 500 μL共6份，分別置5 mL量瓶中，準(zhǔn)確加入與樣品中含量等量的對照品溶液，加甲醇定容至刻度。按“2.2”項下方法同法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，計算回收率，結(jié)果見表2。1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、1-甲酸-β-咔巴啉、1-丙酸基-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5，6-二酮、3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮和4，5-二甲氧基-鐵屎米酮的平均回收率分別為100.19%，100.23%，99.22%，100.51%，101.65%，99.69%，101.17%；RSD分別為1.05%，2.12%，0.91%，2.21%，0.97%，0.82%，1.38%。表明本方法符合分析方法學(xué)要求。

表2 7個生物堿的加樣回收率試驗結(jié)果

2.9樣品測定 取不同批次苦木注射液樣品，分別按“2.2”項下方法制備樣品，按“2.3”項下色譜方法分別進(jìn)樣，測定7個生物堿的峰面積，計算含量，結(jié)果見表3。

表3 苦木注射液中7個生物堿的含量測定

3 討論

3.1流動相的選擇 苦木注射液的主要成分是生物堿類成分，筆者在本實驗考察了不同流動相系統(tǒng)(A：甲醇-乙酸銨溶液系統(tǒng)；B：甲醇-磷酸鹽緩沖溶液系統(tǒng)；C：甲醇-十二烷基苯磺酸鈉水溶液系統(tǒng)；D：甲醇-氨水系統(tǒng))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以A系統(tǒng)分離度、峰形及理論塔板數(shù)較好。同時為了優(yōu)化A系統(tǒng)的色譜條件，考察了流動相中不同pH值(3.5，4.0，4.5和5.0)、不同乙酸銨濃度(20，25，30，35 mmol·L-1)，最終優(yōu)選了pH值4.5，乙酸銨濃度30 mmol·L-1。

3.2色譜柱的選擇 通過對比五個不同品牌的色譜柱：Phenomenex Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Phenomenex Gemini C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、YMC Pack ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent Zorbax SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters SymmetryShield RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Luna、Gemini色譜柱柱效較好，最后選用pH值適應(yīng)范圍寬的Gemini色譜柱。

3.3指標(biāo)成分的選擇 本研究選擇了7個生物堿成分作為指標(biāo)，建立了HPLC法同時測定7種生物堿含量的分析方法，經(jīng)系統(tǒng)的方法學(xué)考察，結(jié)果此法重現(xiàn)性好、操作簡便、準(zhǔn)確性高。其中化合物3-甲基-4-甲氧基-鐵屎米-5，6-二酮首次被選為指標(biāo)性成分，用于苦木注射液的質(zhì)量評價。

3.4測定結(jié)果分析 無質(zhì)量監(jiān)控的同一廠家10批次產(chǎn)品中7個生物堿含量波動較大，7個生物堿總含量差異也大，提示加強(qiáng)指標(biāo)成分的質(zhì)量監(jiān)控，有利苦木注射液的質(zhì)量穩(wěn)定。產(chǎn)品的質(zhì)量與原料質(zhì)量、生產(chǎn)工藝密切相關(guān)，要提高產(chǎn)品質(zhì)量，不但要監(jiān)控原料的質(zhì)量，而且還要優(yōu)化、穩(wěn)定生產(chǎn)工藝。