維生素D干預(yù)對大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型血管功能的影響

付文軼，徐男男，徐內(nèi)利，張寧

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷和肢體殘疾最常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎。RA的自身免疫和炎性反應(yīng)可能會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[1]。80%的RA患者血管內(nèi)皮功能受損, 并且與RA的疾病活動(dòng)相關(guān)[2]。RA患者內(nèi)皮功能障礙可能與腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、膽固醇(cholesterol,CHOL)、一氧化氮(NO)水平相關(guān)[3-6]。已有研究表明TNF-α或IL-6受體拮抗劑可改善RA相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙[7-8]。有研究表明維生素D(vitamin D，VD)水平也可能與RA血管功能相關(guān)[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)VD制劑可能改善慢性腎病患者的血管功能[11-13],活性VD抑制腎素的轉(zhuǎn)錄[14]。本研究通過觀察維生素D干預(yù)對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collageninduced arthritis，CIA)造模大鼠血管功能的影響，探討非活性維生素D對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血管功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

冰醋酸(北京索萊寶科技有限公司)；雞Ⅱ型膠原(Sigma)；完全氟式佐劑(Sigma)；膽維丁乳(國藥準(zhǔn)字：H10910070 上海信宜金朱藥業(yè)有限公司)；Total 25-OH Vitamin D IVD ELISA Kit(R&D Systems)；抗鼠VDR單克隆抗體(Santa Cruz)；鼠IgG Kappa結(jié)合蛋白偶聯(lián)辣根過氧化物酶(Santa Cruz)；Rat Angiotensin Ⅱ (ANG-Ⅱ) ELISA Kit(CUSABIO)；Rat Renin ELISA Kit(CUSABIO)；TRIpure 裂解液(Thermo Fisher)；Direct-zol RNA MiniPrep PLUS (ZYMO RESEARCH)；VDR引物(生工公司)；腎素引物(生工公司)；β-actin引物(Thermo Fisher)；Power SYBRTMGreen PCR Master Mix (SYBR Green)；酶標(biāo)儀(BIO-RAD iMarkTMMicroplate Reader)；7500 Real Time PCR System (Thermo Hybaid)。

1.2 實(shí)驗(yàn)對象

雌性4周齡體質(zhì)量100 g左右Wistar大鼠60只，購自遼寧長生生物有限公司，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室的 SPF 清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

所有大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，稱重后按體質(zhì)量分組。空白對照組12只，空白給藥組12只，實(shí)驗(yàn)組36只，造模CIA模型后，剔除造模不理想大鼠，造模成功者分配于2組實(shí)驗(yàn)組，每組12只，分別為造模對照組，造模給藥組。

1.3 膠原誘導(dǎo)Wistar大鼠關(guān)節(jié)炎模型

按照文獻(xiàn)[15]方法初次、二次免疫造模。二次免疫造模1周后，評(píng)估造模情況，選取造模成功大鼠按體重分配至造模對照組和造模給藥組，每組12只。

1.4 藥物干預(yù)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用膽維丁乳，劑型：8 mL，15 mg，給藥組按照30 000 IU/kg給藥，對照組給予同等體積生理鹽水，應(yīng)用灌胃針給大鼠灌藥。

1.5 取材與標(biāo)本處理

每組12只大鼠，在初次免疫4周即給藥后2周取材，每組剩余6只在初次免疫6周即給藥后4周取材。麻醉后分離主動(dòng)脈，留取血標(biāo)本，主動(dòng)脈標(biāo)本剪成3 mm左右長度，分別于凍存管-80 ℃冰箱和中性福爾馬林中浸泡，4 ℃冰箱保存。

1.6 ELISA法檢測

大鼠外周血清及主動(dòng)脈組織中腎素(renin)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，ANG-Ⅱ)：使用Rat Angiotensin Ⅱ (ANG-Ⅱ) ELISA Kit和Rat Renin ELISA Kit所述方法檢測血液及主動(dòng)脈勻漿。

1.7 免疫組化檢測

大鼠主動(dòng)脈組織維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)： Nikon Eclipse 80顯微鏡下觀察切片，Nikon Digital Sight采集圖片。VDR陽性表達(dá)產(chǎn)物的免疫組化片呈棕褐色，應(yīng)用許良中免疫組化十三點(diǎn)評(píng)分法半定量分析免疫組化結(jié)果。

1.8 qPCR檢測VDR及腎素表達(dá)

使用Direct-zol RNA MiniPrep PLUS (ZYMO RESEARCH) 提取大鼠主動(dòng)脈組織RNA，進(jìn)行濃度測定，反轉(zhuǎn)錄RNA獲取cDNA，之后qPCR檢測VDR及腎素的表達(dá)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分析數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用單因素ANOVA檢驗(yàn)2組數(shù)據(jù)方差齊性，方差齊則組間比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊應(yīng)用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分

造模2周時(shí)，選擇關(guān)節(jié)炎評(píng)分為4分的大鼠分為造模對照組及造模給藥物。造模4周時(shí)關(guān)節(jié)炎評(píng)分最高，之后逐漸減低。6周觀察期內(nèi)造模對照組及造模給藥組無明顯差異(圖1)。

圖 1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分及空白組和CIA造模組大鼠典型圖Fig 1 Score of Arthritis in each group, and typical diagrams of rat pam in the blank group and CIA modelA:空白組大鼠爪; B:CIA組大鼠爪

2.2 大鼠血清25(OH)VD水平

給藥2周及4周分批取材檢測大鼠外周血25(OH)VD水平，造模后大鼠血清25(OH)VD水平下降，與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；維生素D制劑干預(yù)2周時(shí)造模組血清25(OH)VD達(dá)到空白對照組水平，4周時(shí)略下降(圖2)。

圖 2 給藥2及4周大鼠外周血25(OH)VD水平Fig 2 25(OH)VD levels in peripheral blood of rats after 2 and 4 weeks of administration與同時(shí)期空白對照比較,*P<0.05; 與同時(shí)期造模組比較，#P<0.05

2.3 大鼠外周血及主動(dòng)脈組織腎素、ANG-Ⅱ水平

給藥2及4周檢測大鼠外周血及主動(dòng)脈組織腎素、ANG-Ⅱ水平，CIA造模及VD干預(yù)未影響大鼠外周血腎素、ANG-Ⅱ水平。而主動(dòng)脈局部腎素、ANG-Ⅱ水平在CIA造模后增高，VD制劑干預(yù)后4周時(shí)輕度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍高于空白對照組(圖3)。

2.4 大鼠主動(dòng)脈VDR表達(dá)

造模4及6周時(shí)，分別取各組大鼠主動(dòng)脈組織進(jìn)行VDR免疫組化，結(jié)果經(jīng)CIA造模，大鼠主動(dòng)脈VDR表達(dá)明顯增高，與空白對照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在4周時(shí)造模給藥組VDR表達(dá)較造模對照組下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模6周時(shí)造模對照組VDR表達(dá)較4周時(shí)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4， 圖5)。

2.5 qPCR檢測大鼠主動(dòng)脈腎素、VDR表達(dá)

給藥2及4周時(shí)，分別提取各組大鼠主動(dòng)脈組織RNA，結(jié)果顯示CIA造模后大鼠主動(dòng)脈VDR及腎素mRNA水平均升高，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VD制劑干預(yù)后2及4周均可見VDR及腎素mRNA水平下降，與CIA造模對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模6周時(shí)CIA造模組VDR比造模4周時(shí)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

圖 3 給藥2及4周大鼠外周血及主動(dòng)脈組織腎素、血管緊張素Ⅱ水平Fig 3 Renin and angiotensin Ⅱ levels in peripheral blood and aorta of rats after 2 and 4 weeks of administrationA: 給藥2及4周各組外周血腎素水平；B: 給藥2及4周各組外周血血管緊張素Ⅱ水平；C: 給藥2及4周各組主動(dòng)脈腎素水平；D: 給藥2及4周各組主動(dòng)脈血管緊張素Ⅱ水平; 與同時(shí)期空白對照比較，*P<0.05; 與同時(shí)期造模組相比，#P<0.05

圖 4 造模4及6周大鼠主動(dòng)脈VDR表達(dá)Fig 4 Expression of VDR in rat aorta at 4 and 6 weeks after modeling與同時(shí)期空白對照比較，*P<0.05;與同時(shí)期造模組比較，#P<0.05

圖 5 造模4及6周大鼠主動(dòng)脈VDR免疫組化Fig 5 VDR immunohistochemistry of rat aorta at 4 and 6 weeks after modelingA: 造模4周空白對照組；B: 造模4周空白給藥組；C: 造模4周造模對照組；D: 造模4周造模給藥組；E: 造模6周空白對照組； F: 造模6周空白給藥組；G: 造模6周造模對照組；H: 造模6周造模給藥組(×200)

圖 6 給藥2及4周大鼠主動(dòng)脈腎素、VDR mRNA水平Fig 6 mRNA levels of renin and VDR in rat aorta after 2 and 4 weeks of administrationA:給藥2及4周大鼠主動(dòng)脈腎素mRNA水平；B:給藥2及4周大鼠主動(dòng)脈VDR mRNA水平；與同時(shí)期空白對照比較，*P<0.05; 與同時(shí)期造模對照組比較，#P<0.05

3 討論

RA 長期慢性炎癥負(fù)擔(dān)和自身免疫激活，可能導(dǎo)致血管損傷和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[16]。RA的大血管和微血管水平都有內(nèi)皮功能障礙。而VD水平可能與RA血管功能相關(guān)[9-10]。大量研究發(fā)現(xiàn)RA患者VD缺乏明顯[17-19]。本研究通過CIA造模模擬RA，發(fā)現(xiàn)和RA患者相同，CIA大鼠血清中25(OH)VD水平下降。

腎素血管緊張素系統(tǒng)是一種激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，影響血管收縮。經(jīng)典的腎素由腎臟分泌，腎素激活血管緊張素前體形成血管緊張素Ⅰ，之后水解產(chǎn)生有活性的ANG-Ⅱ從而調(diào)節(jié)血管舒張。除了經(jīng)典的途徑外，局部組織中如血管壁也發(fā)現(xiàn)有腎素及血管緊張素的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)CIA造模對大鼠血清腎素及ANG-Ⅱ水平無影響，而主動(dòng)脈局部腎素及ANG-Ⅱ水平在造模后升高，VD干預(yù)后有所下降，二者變化與主動(dòng)脈中VDR水平變化一致。

VD對腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響機(jī)制尚不清楚。既往有研究發(fā)現(xiàn)RA伴有高血壓患者腎素血管緊張素活性增強(qiáng)[20]，RA患者的關(guān)節(jié)滑膜和滑液中腎素活性增強(qiáng)[21]。已有實(shí)驗(yàn)也證實(shí)活性VD可抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)活性[14，22]。本研究發(fā)現(xiàn)CIA大鼠主動(dòng)脈局部的腎素血管緊張素系統(tǒng)可能受血清VD水平影響。適度補(bǔ)充VD制劑，提高血清25(OH)VD，可能通過局部1α-羥化酶催化為活性VD[23]，結(jié)合血管局部VDR，形成激素受體復(fù)合物，作用于靶基因的特定DNA序列，調(diào)節(jié)腎素基因的表達(dá)，從而減弱局部增高的腎素血管緊張素系統(tǒng)活性，改善局部血管功能[24]。充足的血清25(OH)VD活化也可能通過特定基因調(diào)控促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài)，降低自身免疫反應(yīng)，降低局部增高的腎素水平。

CIA大鼠主動(dòng)脈VDR高表達(dá)，推測CIA大鼠自身免疫炎癥激活血管組織自身穩(wěn)態(tài)修復(fù)，高表達(dá)VDR通過DNA反應(yīng)元件影響靶基因表達(dá)，調(diào)控免疫反應(yīng)，消耗大量VD，引起血清25(OH)VD水平降低。隨造模時(shí)間延長，CIA大鼠自身免疫炎癥減弱，因此造模對照組VDR表達(dá)隨時(shí)間延長下調(diào)。而VD干預(yù)后，提升血清25(OH)VD水平，可部分降低組織VDR的高表達(dá)，提示可能存在針對VDR的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，當(dāng)血清25(OH)VD缺乏時(shí)VDR表達(dá)增高，血清25(OH)VD水平回升后，組織中VDR表達(dá)相對下調(diào)。

總之，CIA大鼠出現(xiàn)血清25(OH)VD水平降低，可能由于自身免疫炎癥促使機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)消耗引起，適量補(bǔ)充VD可能對CIA大鼠血管功能有益。由于CIA造模時(shí)限性，無法長期觀察CIA大鼠血管形態(tài)，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證VD對CIA大鼠血管功能的作用。