BMP-2聯(lián)合BMP-7在截骨延長(zhǎng)時(shí)促進(jìn)成骨的實(shí)驗(yàn)研究

馬珂，湯麗國(guó)，劉增運(yùn)，楊躍，霍繼貞，黃現(xiàn)峰，王輝，任志勇

（1.陽(yáng)光融和醫(yī)院 骨科中心，山東 濰坊 261000；2.中國(guó)人民解放軍陸軍第80集團(tuán)軍醫(yī)院 骨科，山東 濰坊 261000）

如何提高Ilizarov骨延長(zhǎng)技術(shù)加快肢體延長(zhǎng)的速度并縮短外固定時(shí)間，成為其進(jìn)一步發(fā)展的一個(gè)方向[1]。該技術(shù)每延長(zhǎng)1.0 cm骨組織，就需要大概一個(gè)月的時(shí)間[2]，在肢體延長(zhǎng)這個(gè)緩慢持續(xù)的過程中，常發(fā)生關(guān)節(jié)僵硬、釘?shù)栏腥镜炔l(fā)癥導(dǎo)致延長(zhǎng)不理想。誘導(dǎo)因子在促進(jìn)成骨方面作用顯著，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Protein,BMPs)在這些因子中誘導(dǎo)成骨最強(qiáng)[3]，2006年美國(guó)哈弗醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)專家Amitabha Bandyopadhyay從基因分析角度[4]，描述了BMP-2和BMP-7在肢體延長(zhǎng)和骨骼發(fā)育中所起到的作用。BMP-2把骨牽拉延長(zhǎng)時(shí)產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力轉(zhuǎn)換成生物招募炎性成骨因子信號(hào)[4]，隨之不斷地機(jī)械力刺激，招募更多的成骨因子，接著BMP-7的出現(xiàn)使軟骨內(nèi)成骨啟動(dòng)加速[5]，協(xié)同促進(jìn)骨組織再生，使骨牽拉延長(zhǎng)形成新骨的時(shí)間縮短。本文通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探究?lián)合應(yīng)用BMP-2和BMP-7對(duì)牽張成骨過程中延長(zhǎng)區(qū)新骨形成的質(zhì)量，并為臨床上縮短牽張成骨過程、加速骨愈合提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)選用雄性日本大耳白兔共30只，體重1.5～2.5 kg，年齡3～5個(gè)月（濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買）。主要儀器及試劑：小型環(huán)狀I(lǐng)lizarov外固定架（由北京骨外固定架研究所提供），螺距為0.1 cm；4個(gè)環(huán)狀外固定架內(nèi)徑為4.0 cm，外徑為5.0 cm；6根5.0 cm短螺紋桿；2根10.0 cm長(zhǎng)螺紋桿；自攻絲的小克氏針（直徑1.3 mm）若干；韓國(guó)科曼X線機(jī)（TITAN2000-1型）；光學(xué)顯微鏡（卡爾·蔡司Axioplan 2 imaging）；雙能X線骨密度儀（Dual Energy X-ray Absorptiometry，DEXA），深圳艾克瑞AKDX-09W-I型；骨優(yōu)導(dǎo)瓶裝（1.0 mg，4片裝）的rhBMP-2藥片，購(gòu)自杭州九源基因工程有限公司；重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（10μg），購(gòu)自上海博升生物科技有限公司；Harris蘇木精、伊紅染液、3%戊二醛、脫鈣液等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立模型及分組

常規(guī)消毒鋪單手術(shù)，取兔右側(cè)脛前內(nèi)側(cè)入路，自右脛骨粗隆向遠(yuǎn)端作縱行切口長(zhǎng)約6.0 cm，鈍性分離腓骨肌牽拉至一側(cè)，充分暴露脛腓骨。在脛骨粗隆下約2.0 cm水平處骨膜下截骨[6]，截?cái)?/3的脛骨，去除遠(yuǎn)端腓骨。將外固定架套入兔右下肢，在截骨面遠(yuǎn)近兩端2.0 cm處各打入兩根克氏針，兩根克氏針成（90°～120°）角度，在截骨面遠(yuǎn)端4.0 cm處再穿入一組克氏針，固定克氏針與外固定架，隨后截?cái)啾Ａ舻?/3脛骨，沿下緣切斷髕韌帶，減少患肢活動(dòng)，縫合包扎。術(shù)后延遲分離[7]，7 d后開始延長(zhǎng)，0.25 mm/ 次，2 次 /d[8]，共延長(zhǎng) 20 d，共延長(zhǎng) 1.0 cm；隨后進(jìn)入10 d的固定期。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行38 d。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物30只，完全隨機(jī)分為三組，每組10只。術(shù)后4只兔子死亡，用新兔補(bǔ)充繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。其中A組單純進(jìn)行牽拉不做其他處理，作為空白對(duì)照組；B組在截骨術(shù)中，于截骨處加入rhBMP-2藥片（100μg）；C組在截骨術(shù)中，于截骨處加入BMP-2藥片（100μg），術(shù)后7 d經(jīng)皮于延長(zhǎng)區(qū)注射rhBMP-7（1 mL，10μg/mL）溶解液。

1.2.3 取材及觀察指標(biāo)

術(shù)后第7天、第38天分別拍攝三組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物右側(cè)脛骨全長(zhǎng)X線片，仔細(xì)觀察牽張延長(zhǎng)區(qū)的新生骨外形、骨密度影及骨痂生長(zhǎng)狀況，在X線上測(cè)量延長(zhǎng)區(qū)的長(zhǎng)度；術(shù)后第38天，分別于A、B、C三組動(dòng)物中隨機(jī)抽取6只動(dòng)物空氣栓塞處死，取右側(cè)脛骨標(biāo)本。經(jīng)雙能X線骨密度儀測(cè)骨密度，分別測(cè)延長(zhǎng)中心區(qū)及遠(yuǎn)近截骨兩端的骨密度。以公式（延長(zhǎng)區(qū)/遠(yuǎn)端+延長(zhǎng)區(qū)/近端）×0.5×100%計(jì)算出百分比[9]，骨密度的結(jié)果以此百分比表示；隨即將三組標(biāo)本的延長(zhǎng)區(qū)切成0.4 cm×0.4 cm×0.4 cm的組織塊。包埋、切片4μm厚，進(jìn)行HE染色。選取合適的組織視野拍照，先低倍（×100）后高倍（×400）觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 影像學(xué)檢查結(jié)果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物截骨延長(zhǎng)術(shù)后X線示各組平均延長(zhǎng)（1.0±0.05）cm，基本達(dá)到實(shí)驗(yàn)預(yù)期牽拉長(zhǎng)度。術(shù)后第7天，A、B、C組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物X線正位片示：三組對(duì)位對(duì)線良好，兩截骨面對(duì)位緊湊無間隙，截骨端對(duì)位達(dá)到2/3以上，基本符合功能復(fù)位標(biāo)準(zhǔn)，三組X線透視無明顯差異（圖 1-3）。術(shù)后第 38天，A、B、C組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物X線正位片示：A組見延長(zhǎng)區(qū)內(nèi)骨痂由截骨端向延長(zhǎng)中心生長(zhǎng)，遠(yuǎn)近截骨端有模糊的低密度骨痂，新生骨痂未愈合；B組延長(zhǎng)區(qū)骨痂再生明顯，骨痂影密度較高，但腓骨側(cè)可見骨折線；C組骨新生硬骨痂充滿延長(zhǎng)區(qū)，未見骨折線，可見髓腔再通（圖4-6）。

圖1 A組動(dòng)物7 d X線片

圖2 B組動(dòng)物7 d X線片

圖3 C組動(dòng)物7 d X線片

圖4 A組動(dòng)物38 d X線片

圖5 B組動(dòng)物38 d X線片

圖6 C組動(dòng)物38 d X線片

2.2 組織學(xué)HE染色結(jié)果

A組標(biāo)本光鏡下見：少量的骨小梁和大量的間充質(zhì)細(xì)胞，骨小梁密度低，排列致密有序，骨基質(zhì)少，骨細(xì)胞被大量骨間充質(zhì)組織填充，成骨細(xì)胞可見（圖7）；B組標(biāo)本見骨小梁體積增大明顯，相鄰兩骨小梁細(xì)胞核間距遠(yuǎn)，骨基質(zhì)明顯增多，骨細(xì)胞密度增高，成骨細(xì)胞增多（圖8）；C組標(biāo)本見骨小梁勻稱增多、體積增大，骨基質(zhì)較為均勻，兩個(gè)相鄰的骨小梁胞核之間間距相對(duì)均一，排布有序，間充質(zhì)細(xì)胞減少，成骨細(xì)胞明顯增多，部分髓腔再通（圖9）。

圖7 A組術(shù)后第38天

圖8 B組術(shù)后第38天

圖9 C組術(shù)后第38天

2.3 骨密度測(cè)量結(jié)果

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A、B、C三組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較（Tamhane，T2）兩兩比較：A組與B組對(duì)比，P1=0.001＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A組與C組對(duì)比，P2=0.001＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；B組與C組對(duì)比，P3=0.017＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表 1）。

表1 三組骨密度測(cè)量結(jié)果比較（±s）

表1 三組骨密度測(cè)量結(jié)果比較（±s）

注：BMD以計(jì)算后百分比表示；各組BMD數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示

組別 只 B M D A組 6 8.7 2 8 3±2.8 0 3 2 9 B組 6 3 3.8 4 8 3±6.4 4 0 5 5 C組 6 4 7.9 1 1 7±7.3 5 4 0 2

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過A、B兩組的X線對(duì)比：A組截骨兩端新生的低密度骨痂影，該組通過常規(guī)的骨牽拉，無法在三周的牽拉中形成愈合的骨痂，有2例出現(xiàn)了骨不連，截骨兩端被大量纖維脂肪組織填充；B組延長(zhǎng)區(qū)骨組織增長(zhǎng)明顯多于A組，延長(zhǎng)區(qū)接近愈合，但腓骨側(cè)可見細(xì)小骨折線。對(duì)比A組觀察到B組延長(zhǎng)區(qū)的骨痂再生明顯，說明了BMP-2的成骨作用強(qiáng)。對(duì)比A、B兩組的HE染色切片，光鏡下見：A組骨小梁內(nèi)的骨細(xì)胞稀少；B組骨小梁內(nèi)細(xì)胞密度增加，細(xì)胞形態(tài)粗大，骨基質(zhì)增多，可見在截骨延長(zhǎng)中起到誘導(dǎo)招募炎性因子、促進(jìn)成骨的作用。B、C兩組的X線對(duì)比，C組骨密度影明顯高于B組，C組動(dòng)物基本形成了致密連續(xù)的硬骨痂，截骨兩端已經(jīng)完全愈合，髓腔再通可見，說明在BMP-2的基礎(chǔ)上聯(lián)合BMP-7，成骨效果優(yōu)于單獨(dú)使用BMP-2。對(duì)比B、C兩組的HE染色切片，光鏡下見：B組骨小梁細(xì)胞密度較高，細(xì)胞形態(tài)粗大，骨基質(zhì)增多；C組骨小梁密度高于B組，兩骨小梁細(xì)胞核間距小于B組，細(xì)胞體積小于B組，但仍有別于正常骨組織。從細(xì)胞水平上說明聯(lián)合應(yīng)用BMP-2和BMP-7，成骨能力優(yōu)于單獨(dú)使用BMP-2，BMP-2和BMP-7在骨再生中具有協(xié)同作用。通過測(cè)量延長(zhǎng)區(qū)中央與兩端的骨密度百分比的定量分析，也證實(shí)了骨密度C組＞B組＞A組。

3.1 BMPs成粗大骨小梁的現(xiàn)象

光鏡下A組的病理切片與B、C組差異較大，B、C組經(jīng)過BMPs的 ，生成了體積粗大的骨小梁，骨小梁的密度增加不如骨小梁體積的增大顯著，可能會(huì)造成一種說法，BMPs對(duì)延長(zhǎng)區(qū)骨組織的填充以增加骨小梁的體積為主，而不是通過增加生成更多的骨組織細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)的。再者這樣體積異常的骨小梁結(jié)構(gòu)，是否會(huì)影響破骨細(xì)胞的改建，能否與正常愈合后的骨組織應(yīng)力程度相等，是否會(huì)增加骨折幾率，在應(yīng)用BMPs成骨后存在一些導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)異常的因素，這些因素會(huì)帶來怎樣的后果，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 BMPs應(yīng)用的討論

查閱到正常骨折愈合過程BMP-2立即產(chǎn)生聚集并1天內(nèi)達(dá)到峰值，而BMP-7大量釋放聚集是在骨折后第7天[10]，二者釋放有順序性。還有一個(gè)很關(guān)鍵的問題：BMP-2和BMP-7具體的應(yīng)用劑量。研究者們的應(yīng)用范圍rhBMP-2在50～250μg，rhBMP-7在10～20μg[5]，沒有定論。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用較小劑量rhBMP-2，100μg；rhBMP-7，10μg。BMPs 劑量的應(yīng)用在一定程度上影響著新生骨組織的密度和結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物模型，驗(yàn)證了在截骨延長(zhǎng)中BMP-2能顯著促進(jìn)延長(zhǎng)區(qū)的成骨；在截骨延長(zhǎng)中BMP-7促進(jìn)啟動(dòng)軟骨成骨的作用，配合BMP-2的招募成骨因子作用，加速軟骨內(nèi)成骨。通過實(shí)驗(yàn)可知，BMP-2和BMP-7在骨再生方面具有協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用BMP-2和BMP-7成骨比單純使用BMP-2更快且骨密度高。