FAT/CD36表達(dá)及轉(zhuǎn)位在有氧運(yùn)動(dòng)改善老年小鼠骨骼肌胰島素敏感性中的作用

孫婧瑜，蘇亞娟，秦黎黎，董靜梅

關(guān)鍵字：衰老；運(yùn)動(dòng)干預(yù)；脂肪酸轉(zhuǎn)位酶；胰島素信號(hào)通路

隨著社會(huì)老齡化的發(fā)展，老年人糖尿病的發(fā)病率急劇上升（Evans et al.，2013）。研究表明，衰老能夠誘導(dǎo)胰島素抵抗的發(fā)生（Hamanoue et al.，2017）。胰島素抵抗是高血壓、肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病的主要危險(xiǎn)因素。骨骼肌作為能量代謝的主要器官，隨著年齡的增長，骨骼肌胰島素敏感性下降（Dagdeviren et al.，2017；Hamanoue et al.，2017）。因此，骨骼肌被認(rèn)為是衰老誘導(dǎo)胰島素抵抗的主要部位（Biswas et al.，2016）。

近年來，有研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂是衰老誘導(dǎo)骨骼肌胰島素敏感性下降的重要因素（Biswas et al.，2016）。長鏈脂肪酸（long-chainfatty acids，LCFAs）從脂肪組織運(yùn)輸?shù)焦趋兰【€粒體需要經(jīng)過一系列脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)控。其中，脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase，F(xiàn)AT/CD36）廣泛存在于骨骼肌中（Nickerson et al.，2009），并且FAT/CD36向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位功能可能是所有脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體中所特有的（Romic et al.，2017）。在人類肥胖模型及嚙齒類動(dòng)物胰島素抵抗模型研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜FAT/CD36與脂肪酸攝取、甘油三酯堆積以及胰島素刺激下葡萄糖攝取的減少密切相關(guān)（Bonen et al.，2004）。因此，骨骼肌細(xì)胞膜FAT/CD36在調(diào)節(jié)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能起到了中心作用。有研究發(fā)現(xiàn)，與衰老相關(guān)的胰島素抵抗發(fā)生時(shí)，細(xì)胞膜FAT/CD36含量增多不是由于FAT/CD36合成的增加，而是由于永久固定于細(xì)胞膜上的FAT/CD36增多。這種永久固定于細(xì)胞膜上的FAT/CD36增多可能是導(dǎo)致2型糖尿病早期發(fā)病的主要因素；而線粒體功能障礙引起的過量脂質(zhì)沉積可能是糖尿病后期發(fā)病的主要因素（Steinbusch et al.，2011）。因此，對(duì)骨骼肌FAT/CD36的表達(dá)及轉(zhuǎn)位機(jī)制進(jìn)行研究可能是糖尿病防治的新思路。

由于運(yùn)動(dòng)的安全性、有效性和多重靶點(diǎn)作用等優(yōu)勢，越來越多的研究聚焦其潛在的糖尿病防治機(jī)理。然而，運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老誘導(dǎo)的胰島素抵抗骨骼肌FAT/CD36的作用及作用機(jī)理尚不明確。因此，本研究首先利用siRNA干擾技術(shù)，在C2C12細(xì)胞中進(jìn)行FAT/CD36基因敲低，探討FAT/CD36缺乏對(duì)骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)通路的影響。其次，利用老年小鼠，探討運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36總蛋白含量的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，與FAT/CD36總蛋白相比，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的FAT/CD36向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位功能可能對(duì)骨骼肌脂肪酸代謝更為重要（Mcfarlan et al.，2012）。電壓依賴性陰離子通道蛋白（voltage-dependent anion channel，VDAC）是線粒體外膜上含量極為豐富的孔狀蛋白，也是線粒體的重要標(biāo)志物之一（Zhang et al.，2019）；小窩蛋白（caveolins）在FAT/CD36向細(xì)胞膜脂筏錨定的過程中起到了重要的調(diào)控作用（Eyre et al.，2007）。因此，本研究進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36向細(xì)胞膜和/或線粒體膜轉(zhuǎn)位的影響及其在細(xì)胞膜脂筏中的定位。根據(jù)研究推測，運(yùn)動(dòng)可能通過減少FAT/CD36的表達(dá)、增加向細(xì)胞膜脂筏轉(zhuǎn)位的雙重作用，激活A(yù)KT/ERK信號(hào)通路，從而改善衰老誘導(dǎo)的骨骼肌胰島素敏感性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)及siRNA干擾

小鼠骨骼肌C2C12細(xì)胞系在6孔板內(nèi)培養(yǎng)，以生長培養(yǎng)基（高糖DMEM、10%小牛血清、1%谷氨酸、1%青霉素/鏈霉素）培養(yǎng)2天后，改用分化培養(yǎng)基（高糖DMEM、2%馬血清、1%谷氨酸、1%青霉素/鏈霉素）進(jìn)行分化培養(yǎng)4～6天。在C2C12細(xì)胞分化第3天時(shí)，換用無抗生素的分化培養(yǎng)基，分別對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行siRNA干擾：siCont、siCD36-1、sicd36-2。siCont：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；siCD36-1：5’-GGAUGACAACUUCACAGUUTT-3’；siCD36-2：5’-CCACAUUUCCUACAUGCAA-TT-3’。

6孔板中每孔加入A液（150 μl Optimem＋1.5 μl 20mol/L siRNA）和B液（150 μl Optimem＋3 μl Lipofecta-mine RNAi-MAX）。A液混入B液后，將混合物于室溫放置5 min，加入C2C12細(xì)胞，于37℃培養(yǎng)箱孵育6 h后，換回分化培養(yǎng)基，繼續(xù)分化培養(yǎng)2天。然后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行低糖DMEM及無血清饑餓過夜，并用含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解細(xì)胞，用于后續(xù)檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

8周齡C57BL/6雄性小鼠自由進(jìn)食飲水，環(huán)境溫度20℃～24℃，相對(duì)濕度40%～60%，通風(fēng)良好，晝夜12 h/12 h循環(huán)照明（所有操作均嚴(yán)格遵守同濟(jì)大學(xué)道德倫理委員會(huì)的要求）。小鼠自然飼養(yǎng)至56周齡后，隨機(jī)分為老年對(duì)照組（aging control，AC；n=10）和老年運(yùn)動(dòng)組（aging exercise，AE；n=10）。老年對(duì)照組無特殊運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，進(jìn)行16周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。

1.3 小鼠運(yùn)動(dòng)模型構(gòu)建

小鼠進(jìn)行適應(yīng)性跑臺(tái)訓(xùn)練1周，每周6次，每次訓(xùn)練時(shí)間由20 min/次逐漸遞增至60 min/次，跑速由10 m/min逐漸遞增至20 m/min。第2周開始，小鼠跑臺(tái)訓(xùn)練以20 m/min跑速，6次/周，60 min/次進(jìn)行并持續(xù)16周。訓(xùn)練時(shí)間固定在每周一至周六下午，周日休息。

1.4 腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)

第72周末對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT）。小鼠禁食16 h后，腹腔注射葡萄糖溶液1 g/kg，并分別在腹腔注射0 min、15 min、30 min、60 min、120 min及180 min時(shí)進(jìn)行取血。采用羅氏卓越精采型血糖儀及其配套試紙進(jìn)行血糖測量，并繪制血糖曲線，計(jì)算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）（Sun et al.，2018）。

1.5 腹腔注射胰島素耐量實(shí)驗(yàn)

第72周末對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（intraperitoneal insulin tolerance test，IPGTT）。小鼠禁食16 h后，腹腔注射胰島素2 g/kg，并分別在腹腔注射0 min、15 min、30 min、60 min及120 min時(shí)進(jìn)行取血。采用羅氏卓越精采型血糖儀及其配套試紙進(jìn)行血糖測量，并繪制血糖曲線，計(jì)算血糖曲線下面積（AUC）（Sun et al.，2018）。

1.6 動(dòng)物取材

實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，小鼠禁食12 h，自由飲水。選用7 mL/kg 20%戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔麻醉注射。主動(dòng)脈取血后迅速分離雙側(cè)腓腸肌，進(jìn)行RT-PCR、WB及免疫熒光相關(guān)指標(biāo)檢測。剩余組織置于?80℃冰箱冷凍待用。

1.7 血脂檢測

甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，T-CHO）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipopro?tein cholesterol，HDL?C）及低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein chesterol，LDL-C）4項(xiàng)血脂指標(biāo)按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測儀檢測。

1.8 RNA的提取和RT-PCR

60～80 mg腓腸肌剪碎后加入500 ul Trizol（抽提總RNA。室溫靜置5 min后，加入100 μl氯仿。12 000 r/min，4℃離心15 min后吸取170 μl上清，并加入等體積異丙醇，室溫靜置 10 min。12 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清。75%乙醇洗滌沉淀2次后，沉淀溶于10 μl RNase-free水中并測定OD值。取1 μg總RNA，按照cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

RT-PCR 反應(yīng)體系為 10 μl，包括 100 ng cDNA、5 μl 2×FastStart Universal SYBR GreenMaster、0.5 μl Primer F/R（10 μmol/L）、4 μl RNase Free Water。表1為 PCR 引物正向和反向序列。反應(yīng)條件為：起始模板預(yù)變性95℃，10 min；PCR循環(huán)反應(yīng)95 ℃，10 s；60 ℃，10 s，72 ℃，10 s，共40個(gè)循環(huán)。用內(nèi)參β-actin對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并用2-△△Ct方法計(jì)算mRNA的相對(duì)含量。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer Sequences for Fluorescence Quantitative PCR

1.9 免疫印跡

取60～80 mg腓腸肌置于含磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液中，剪碎后充分勻漿（或C2C12細(xì)胞裂解液），冰上靜置30 min后，12 000/min，4℃離心10 min，取上清；BCA法測定蛋白樣品濃度后進(jìn)行煮沸變性。蛋白樣品經(jīng)過SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，一抗4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，二抗室溫孵育1 h。采用ECL發(fā)光法檢測目標(biāo)蛋白條帶，并用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.10 免疫熒光

制備骨骼肌冰凍切片，置于4%多聚甲醛冰上固定60 min，封閉60 min后，分別加入CD36/Caveolin-1混合一抗（FAT/CD36，1：200；Caveolin-1，1：200），CD36/VDAC 混合一抗（FAT/CD36，1：200；VDAC，1：200），4 ℃孵育過夜?；旌?Alexa Fluor 594（紅）、Alexa Fluor 488（綠）標(biāo)記的二抗，室溫孵育60 min。滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑封片。采用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像，用ZEN分析軟件分析熒光強(qiáng)度及共定位程度。熒光強(qiáng)度反映FAT/CD36蛋白表達(dá)的變化情況，共定位程度反映FAT/CD36在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)位情況。

1.11 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SE）表示。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著性差異水平設(shè)置為P＜0.05。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 FAT/CD36缺乏對(duì)骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)通路AKT/ERK激活的影響

經(jīng)siCD36干擾后的C2C12細(xì)胞，F(xiàn)AT/CD36蛋白表達(dá)水平顯著下降（圖1），說明本實(shí)驗(yàn)中的FAT/CD36基因敲低效率較好。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siCD36干擾后的C2C12細(xì)胞，AKT/ERK磷酸化水平顯著增加，說明FAT/CD36基因缺乏能夠激活骨骼肌細(xì)胞胰島素信號(hào)通路。

圖1 FAT/CD36缺乏對(duì)C2C12小鼠骨骼肌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響Figure 1. Effect of FAT/CD36 Deficiency on Related Protein Expression Levels in C2C12 Skeletal Muscle Cells

2.2 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠糖耐量水平的影響

小鼠腹腔注射葡萄糖0 min、15 min、30 min、60 min、120 min、180 min后血液葡萄糖水平及IPGTT血糖曲線下面積（AUC）（圖2）。結(jié)果顯示，AE組AUC顯著低于AC組（P＜0.05），說明運(yùn)動(dòng)能改善老年小鼠葡萄糖耐量。

圖2 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠葡萄糖耐量的影響Figure 2. Effect of Exercise Intervention on Glucose Tolerance inAged Mice

2.3 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠胰島素耐量水平的影響

小鼠腹腔注射胰島素 0 min、15 min、30 min、60 min、120 min后血液葡萄糖水平及IPITT血糖曲線下面積（圖3）。結(jié)果顯示，AE組AUC顯著低于AC組（P＜0.05），說明運(yùn)動(dòng)能改善老年小鼠胰島素耐量。

圖3 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠胰島素耐量的影響Figure 3. Effect of Exercise Intervention on Insulin Tolerance inAged Mice

2.4 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠血脂的影響

與AC組相比，AE組小鼠血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量無顯著性差異；與AC組相比，AE組小鼠高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平顯著增加（P＜0.01），說明運(yùn)動(dòng)能顯著改善老年小鼠HDL-C含量（圖4）。

圖4 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠血脂的影響Figure 4. Effect of Exercise Intervention on Blood Lipid Content inAged Mice

2.5 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌胰島素信號(hào)通路激活的影響

與AC組相比，AE組小鼠骨骼肌AKT/ERK磷酸化水平顯著增加（P＜0.05，圖5），說明中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能顯著改善老年小鼠骨骼肌胰島素敏感性。

圖5 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌胰島素信號(hào)通路激活的影響Figure 5. Effect of Exercise on theActivation of Insulin Signaling Pathway in the Skeletal Muscle ofAged Mice

2.6 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36及其他脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)水平的影響

與AC組相比，AE組小鼠骨骼肌脂肪酸結(jié)合蛋白（fatty acid binding protein，F(xiàn)ABPpm）、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（fatty acid transport protein 4，F(xiàn)ATP4）mRNA表達(dá)水平未見顯著變化，而FAT/CD36、肉堿脂酰轉(zhuǎn)移酶-1（carnitine acyltransferase-1，CPT-1）mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，圖6），說明與其他脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相比，F(xiàn)AT/CD36、CPT-1在運(yùn)動(dòng)改善老年小鼠骨骼肌胰島素敏感性中可能發(fā)揮了更重要的作用。與AC組相比，AE組小鼠骨骼肌過氧化物酶增殖物激活受體γ共化合物1α（peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator-1α，PGC-1α）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferatoractivated receptor-γ，PPAR-γ）mRNA表達(dá)水平未見顯著性變化，說明PGC-1α、PPARγ可能不是運(yùn)動(dòng)調(diào)控FAT/CD36表達(dá)變化的主要轉(zhuǎn)錄因子。

圖6 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA表達(dá)水平的影響Figure 6. Effect of Exercise on mRNAExpression Levels of FattyAcid Transporters in the Skeletal Muscle ofAged Mice

2.7 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36蛋白表達(dá)水平的影響

與AC組相比，AE組小鼠骨骼肌FAT/CD36的蛋白表達(dá)水平顯著減少（P＜0.05，圖7），說明運(yùn)動(dòng)能顯著降低老年小鼠骨骼肌FAT/CD36的蛋白表達(dá)水平。

圖7 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36蛋白表達(dá)水平的影響Figure 7. Effect of Exercise on FAT/CD36 Protein Expression Levels in the Skeletal Muscle ofAged Mice

2.8 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36轉(zhuǎn)位功能的影響

小鼠骨骼肌組織CD36/Caveolin-1免疫熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果顯示（圖8），F(xiàn)AT/CD36被標(biāo)記為綠色熒光，Caveolin-1被標(biāo)記為紅色熒光，二者的共定位重疊區(qū)域?yàn)辄S色，細(xì)胞核被DAPI標(biāo)記為藍(lán)色。與AC組相比，AE組FAT/CD36綠色熒光強(qiáng)度顯著減少（P＜0.05），說明運(yùn)動(dòng)能減少老年小鼠骨骼肌FAT/CD36的蛋白表達(dá)水平；AC組顯示，黃色共定位區(qū)域明顯，說明FAT/CD36存在于細(xì)胞膜脂筏中；與AC組相比，AE組黃色共定位程度進(jìn)一步增加，說明運(yùn)動(dòng)能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位，并定位于細(xì)胞膜脂筏中。

圖8 運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位Figure 8. Exercise Induced FAT/CD36 Trafficking to Plasma Membrane in the Skeletal Muscle ofAged Mice

2.9 運(yùn)動(dòng)未能誘導(dǎo)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36向線粒體膜轉(zhuǎn)位

小鼠骨骼肌組織CD36/VDAC免疫熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果顯示（圖9），F(xiàn)AT/CD36被標(biāo)記為綠色熒光，VDAC被標(biāo)記為紅色熒光，二者的共定位重疊區(qū)域?yàn)辄S色，細(xì)胞核被DAPI標(biāo)記為藍(lán)色。AC組顯示，黃色共定位區(qū)域不明顯，說明FAT/CD36不存在于線粒體膜上；與AC組相比，AE組黃色共定位程度未有明顯改變，說明運(yùn)動(dòng)干預(yù)亦未能誘導(dǎo)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36向線粒體膜轉(zhuǎn)位。

圖9 運(yùn)動(dòng)未誘導(dǎo)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36向線粒體膜轉(zhuǎn)位Figure 9. Effect of Exercise Induced FAT/CD36 Trafficking to Mitochondrial Membrane in the Skeletal Muscle ofAged Mice

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動(dòng)對(duì)老年小鼠骨骼肌胰島素敏感性的改善作用

胰島素抵抗是許多衰老相關(guān)疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，如2型糖尿病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等。骨骼肌是人體攝取和利用葡萄糖最重要的組織。隨著年齡的增長，骨骼肌的質(zhì)量和功能出現(xiàn)衰退，導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生。因此，提高老年人骨骼肌胰島素敏感性是預(yù)防衰老相關(guān)疾病的重要措施。然而，除了運(yùn)動(dòng)干預(yù)之外，目前尚未有成熟的骨骼肌衰退治療方法。本研究結(jié)果顯示，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能顯著改善老年小鼠血糖、血脂及骨骼肌胰島素敏感性。

衰老導(dǎo)致過量脂肪酸流入骨骼肌細(xì)胞，脂肪酸在骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的過量沉積，導(dǎo)致骨骼肌脂肪酸氧化能力下降，線粒體生物合成發(fā)生障礙，線粒體功能損傷，慢肌纖維向快肌纖維轉(zhuǎn)變增多以及肌萎縮等變化，這些變化均與骨骼肌脂肪酸代謝紊亂有關(guān)，最終引起胰島素抵抗的發(fā)生（Oseph et al.，2012）。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，外源性脂肪酸通過自由擴(kuò)散的方式實(shí)現(xiàn)向骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)；然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，一些膜蛋白，如FAT/CD36、FABPpm及FATPs在協(xié)助脂肪酸跨過細(xì)胞膜，向細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起到了重要作用（Glatz et al.，2010）。尤其是FAT/CD36與骨骼肌細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的異位沉積關(guān)系密切（Bonen et al.，2004）。有研究結(jié)果表明，外源性脂肪酸通過激活FAT/CD36的轉(zhuǎn)位機(jī)制，對(duì)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸攝取與氧化平衡起到了重要的調(diào)控作用（Samovski et al.，2015）。然而，靜息狀態(tài)下FAT/CD36可能不是最為重要的脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體，CPT-1可能更為重要；在運(yùn)動(dòng)等能量需求較大時(shí)，與其他脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相比，F(xiàn)AT/CD36對(duì)骨骼肌脂肪酸代謝的調(diào)控作用更為明顯（Holloway et al.，2009）。因此，本研究著重探討FAT/CD36在運(yùn)動(dòng)改善老年小鼠骨骼肌胰島素敏感性中的作用及作用機(jī)制。

3.2 FAT/CD36蛋白表達(dá)水平在運(yùn)動(dòng)改善老年小鼠骨骼肌胰島素敏感性中的作用

研究顯示，胰島素抵抗骨骼肌中FAT/CD36的表達(dá)水平顯著增加（Bonen et al.，2004），而運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)骨骼肌FAT/CD36表達(dá)水平的改變呈現(xiàn)多元化的調(diào)控。有研究顯示，6周高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練能顯著增加骨骼肌細(xì)胞FAT/CD36總蛋白表達(dá)水平（Talanian et al.，2010）。Kiens等（2004）發(fā)現(xiàn)，長期耐力訓(xùn)練并不能增加人類股外側(cè)肌FAT/CD36總蛋白表達(dá)水平。這可能是因?yàn)镕AT/CD36對(duì)運(yùn)動(dòng)的適應(yīng)性變化，主要表現(xiàn)在FAT/CD36向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位機(jī)制，而非總蛋白水平上的改變。另外，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的骨骼肌FAT/CD36總蛋白表達(dá)水平的變化可能存在時(shí)效性及運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式上的差異，特別是在運(yùn)動(dòng)適應(yīng)的初期，F(xiàn)AT/CD36誘導(dǎo)的骨骼肌脂肪酸調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜。骨骼肌FAT/CD36蛋白表達(dá)水平的增加可能是對(duì)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練初期的一個(gè)暫時(shí)性的適應(yīng)過程。隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長，這種適應(yīng)過程可能逐漸消失。本研究結(jié)果顯示，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著降低了老年小鼠骨骼肌組織FAT/CD36及CPT-1的mRNA表達(dá)，然而FABPpm及FATP4脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的mRNA表達(dá)水平未見顯著性變化。該結(jié)果與Palacios等（2009）研究相一致，說明了與其他脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相比，F(xiàn)AT/CD36及CPT-1在運(yùn)動(dòng)改善骨骼肌胰島素敏感性中可能發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。另外，與FAT/CD36 mRNA表達(dá)水平變化相一致，16周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練顯著降低了胰島素抵抗骨骼肌組織FAT/CD36的蛋白表達(dá)水平。

PGC-1α含量的增加不僅能夠誘導(dǎo)線粒體的生物發(fā)生，促進(jìn)脂肪酸氧化代謝，還可以增加FAT/CD36的含量（Benton et al.，2010）。本研究結(jié)果顯示，16周中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能夠顯著降低老年小鼠骨骼肌組織FAT/CD36的含量，但未能降低PGC-1α及PPARγ的mRNA表達(dá)水平，說明運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的衰老小鼠骨骼肌FAT/CD36表達(dá)水平的變化可能不完全通過PGC-1α及PPARγ轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。其他途徑對(duì)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36表達(dá)水平的調(diào)控機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

3.3 FAT/CD36轉(zhuǎn)位在運(yùn)動(dòng)改善老年小鼠骨骼肌胰島素敏感性中的作用

FAT/CD36普遍分布于骨骼肌細(xì)胞膜及胞質(zhì)儲(chǔ)存囊泡中。研究顯示，機(jī)械收縮或胰島素刺激均能誘導(dǎo)細(xì)胞膜FAT/CD36含量的增加，而骨骼肌細(xì)胞內(nèi)FAT/CD36總蛋白含量并沒有增加（Koonen et al.，2005）。由此推測，F(xiàn)AT/CD36在細(xì)胞膜和胞漿儲(chǔ)存體內(nèi)可能是以循環(huán)的形式存在。當(dāng)FAT/CD36的胞內(nèi)轉(zhuǎn)位機(jī)制發(fā)生障礙時(shí)，細(xì)胞膜上的FAT/CD36便無法正?；厥罩涟|(zhì)儲(chǔ)存囊泡，導(dǎo)致過量外源性脂肪酸的攝入，從而導(dǎo)致了骨骼肌脂肪酸代謝異常（Bonen et al.，2004）。但是對(duì)于FAT/CD36是否存在于線粒體膜上，尚存爭議。Lopaschuk等（2010）認(rèn)為，F(xiàn)AT/CD36存在于線粒體膜上，并通過調(diào)節(jié)脂肪酸進(jìn)入線粒體的數(shù)量，對(duì)脂肪酸氧化代謝進(jìn)行調(diào)控。Holloway等（2007）認(rèn)為，F(xiàn)AT/CD36既不存在于線粒體膜上，又不能通過調(diào)節(jié)脂肪酸進(jìn)入線粒體的數(shù)量來對(duì)脂肪酸氧化進(jìn)行調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AT/CD36高表達(dá)于老年小鼠骨骼肌細(xì)胞膜中，而線粒體膜上未見表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT/CD36向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位功能是運(yùn)動(dòng)過程中脂肪酸氧化代謝調(diào)節(jié)的重要機(jī)制（Mcfarlan et al.，2012）。本研究結(jié)果與該結(jié)論相一致，即16周有氧運(yùn)動(dòng)能夠進(jìn)一步誘導(dǎo)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，然而運(yùn)動(dòng)未能誘導(dǎo)老年小鼠骨骼肌FAT/CD36向線粒體膜的轉(zhuǎn)位。這可能是因?yàn)檫\(yùn)動(dòng)過程中需要大量的能量供應(yīng)，外源性LCFA可以為骨骼肌收縮提供能量底物，而FAT/CD36可能主要在LCFA進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞膜過程中起到重要作用，在LCFA進(jìn)入線粒體膜過程中的作用不如其他脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如FABPpm、CPT-1等。

3.4 FAT/CD36向細(xì)胞膜脂筏上的定位在運(yùn)動(dòng)改善老年小鼠骨骼肌胰島素敏感性中的作用

衰老誘導(dǎo)的胰島素抵抗伴有胰島素信號(hào)通路上的多個(gè)分子表達(dá)或活化水平的異常，如胰島素與受體的結(jié)合能力下降、胰島素受體、胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的酪氨酸磷酸化以及磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI-3K）活化水平下降等，這些均被認(rèn)為是衰老誘導(dǎo)骨骼肌胰島素抵抗發(fā)生的可能機(jī)制。但是，目前對(duì)胰島素信號(hào)通路分子表達(dá)或活化水平改變的上游機(jī)制尚不清楚。隨著脂筏的發(fā)現(xiàn)，人們開始關(guān)注小GTP結(jié)合蛋白R(shí)ab GTPases在胰島素抵抗中的作用。脂筏是細(xì)胞膜上含有特殊脂質(zhì)及特殊蛋白質(zhì)的微結(jié)構(gòu)域（microdomains）。有研究證明，脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)離不開脂筏結(jié)構(gòu)域（Ehehalt et al.，2006），這就為探討有氧運(yùn)動(dòng)改善胰島素敏感性的作用機(jī)制提供了一個(gè)新視角。

小窩是脂質(zhì)膜上直徑約為50～100 nm的囊泡凹陷結(jié)構(gòu)，在上皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)豐富（Lo et al.，2015）。脂筏、小窩能夠通過聚集某些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如葡萄糖、膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，來調(diào)控營養(yǎng)物質(zhì)的攝?。∣rtegren et al.，2007）。研究顯示，相關(guān)的長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與脂筏、小窩結(jié)構(gòu)關(guān)系密切（Ehehalt et al.，2006）。因此，推測小窩蛋白可能參與了FAT/CD36在細(xì)胞膜上的定位及功能。FAT/CD36只有錨定在細(xì)胞膜表面的脂筏微結(jié)構(gòu)域內(nèi)，并與小窩蛋白共同作用，才能對(duì)脂肪酸的攝取進(jìn)行調(diào)控（Ehehalt et al.2008）；若在回收過程中，F(xiàn)AT/CD36未能正確定位于脂筏和/或小窩中，可能會(huì)影響脂肪酸的攝取及轉(zhuǎn)運(yùn)。然而，運(yùn)動(dòng)能否誘導(dǎo)衰老小鼠骨骼肌FAT/CD36向細(xì)胞膜脂筏和/或小窩上的正確定位，尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)動(dòng)能夠誘導(dǎo)衰老小鼠骨骼肌FAT/CD36向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位并準(zhǔn)確定位于細(xì)胞膜上的脂筏中。脂筏被看作是一個(gè)信號(hào)募集、發(fā)生、轉(zhuǎn)導(dǎo)的平臺(tái)，含有多種信號(hào)分子（Philip et al.，2007）。因此，本研究結(jié)果進(jìn)一步說明了運(yùn)動(dòng)可能通過增加FAT/CD36在細(xì)胞膜脂筏上的定位，增強(qiáng)了FAT/CD36與下游信號(hào)分子的相互作用，如Src家族蛋白激酶（Fyn、Lyn和Yes）（Yamada et al.，2010），從而激活了相關(guān)胰島素信號(hào)通路，進(jìn)而對(duì)衰老誘導(dǎo)的骨骼肌胰島素敏感性進(jìn)行調(diào)控。在今后的研究中，可以選取運(yùn)動(dòng)初期、運(yùn)動(dòng)中期以及運(yùn)動(dòng)末期等多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從而可以更清晰地反映出FAT/CD36的表達(dá)及轉(zhuǎn)位功能在運(yùn)動(dòng)適應(yīng)中的變化趨勢，進(jìn)一步說明FAT/CD36在運(yùn)動(dòng)防治衰老誘導(dǎo)的骨骼肌胰島素抵抗中的靶點(diǎn)價(jià)值。

4 結(jié)論

FAT/CD36在調(diào)節(jié)骨骼肌胰島素信號(hào)通路中具有重要作用，并且運(yùn)動(dòng)可能通過減少FAT/CD36的表達(dá)、增加向細(xì)胞膜脂筏轉(zhuǎn)位的雙重作用，激活A(yù)KT/ERK信號(hào)通路，從而改善衰老誘導(dǎo)的骨骼肌胰島素敏感性下降（圖10）。

圖10 FAT/CD36在運(yùn)動(dòng)改善衰老骨骼肌胰島素敏感性中的作用及可能機(jī)制Figure 10. The Role of FAT/CD36 in Improving Insulin Sensitivity of Skeletal Muscle inAged Mice by Exercise